全 文 ：书菊苣质体同源片段的克隆及非抗生素标记
的质体定点整合表达载体构建
王玉华，郝建国，贾敬芬
（陕西省生物技术重点实验室 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室 西北大学生命科学学院，陕西 西安７１００６９）
摘要：依据烟草、玉米、拟南芥和大豆质体基因组狉狆狊７基因和１６犛狉犇犖犃 基因的保守序列设计引物，以菊苣质体基
因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增到１段４．８ｋｂ的片段。序列分析表明，该片段全长４７５１ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为
ＧＱ１９９４７８），包括４４９ｂｐ的狉狆狊７基因５′端序列、７９３ｂｐ的狉狆狊１２基因、７２ｂｐ的狋狉狀犞基因、１３１５ｂｐ的１６犛狉犇犖犃
基因５′端以及大部分的基因间隔区，该序列与烟草对应区段的相似性为９２％，与莴苣对应区段的相似性为９７％。
以此片段作为定点整合外源基因的同源重组片段，构建了非抗生素标记的菊苣质体定点整合表达载体ｐＪＢＡＤＨ
ＧＦＰ，酶切分析及ＰＣＲ检测证明构建的载体符合预期设计。该载体的构建为建立高效、稳定的菊苣质体转化和无
抗生素筛选体系奠定基础，为进一步通过质体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良，或以菊
苣质体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台。
关键词：菊苣；质体同源片段；非抗生素标记；定点整合；表达载体
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５４０．３５３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０６００７２１０
向细胞核导入外源基因的核基因转化技术已普遍应用于农作物改良中。然而，随着研究的深入，细胞核转化
技术逐渐暴露其种种难以克服的弊端：首先，外源基因的随机整合造成的转基因沉默严重影响了基因工程的应用
效果；其次，转基因植物的花粉飘逸带来的环境安全问题更成为人们关注的焦点，如果转化基因飘逸进入边缘杂
草就会改变物种间的竞争关系，破坏原有生态平衡；再次，在植物基因工程中，常选用细菌来源的抗生素基因作选
择标记筛选转化子，而它们在转基因植物（尤其是可食用植物）中的表达对人类的健康具有潜在威胁，这成为转基
因植物一直不能普遍被大众接受的主要原因。因此，寻找一种新的植物转基因方式（既能高效表达目的基因，又
不会对环境和人类健康带来威胁）不仅十分重要，也十分迫切。
植物质体转化以质体基因组为平台进行遗传操作，能有效解决核基因转化中存在的外源基因表达量过低问
题和环境安全问题，外源基因的定点整合能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题，质体基因
组的高拷贝性决定其可高效表达外源基因，而其单亲母性遗传特点决定了外源基因不会随花粉传播［１］。此外，外
源基因在质体中的高效表达使植物的质体可作为工业用酶或药用蛋白等产品的生物反应器［２～５］。基于此，质体
遗传转化已成为植物基因工程发展的新方向和科研工作者研究的热点之一，而扩大受体植物种类及非抗生素选
择标记的应用是质体基因工程发展亟待解决的问题。
近年来，由于西部大开发战略的实施以及生态建设事业的需要，培育优质抗逆的牧草和草坪草品种［６］日益成
为研究的热点问题。作为牧草之一的菊苣（犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊）为菊科菊苣属多年生草本植物，具有饲用、药用、
食用等多方面的开发潜力，大力开展菊苣的研究工作对农业产业化结构调整、退耕还林、还草和畜牧业的发展具
有重要的现实意义。有关菊苣驯化栽培技术方面的报道较多，但采用基因工程技术对菊苣进行遗传改良等方面
的研究较少。已报道的转基因菊苣涉及的目的基因主要包括筛选标记基因狀狆狋Ⅱ［７］、报告基因犌犝犛［８］和
犌犉犘［９］、抗冻基因犾狅犾１［１０］、成花基因犗狊犕犃犇犛１［１１］和犃犉犔２［１２］、抗坏血酸过氧化物酶基因犃犘犡［１３］以及Ｎａ＋／Ｈ＋
逆向转运蛋白基因犃狋犖犎犡１［１４］。总的看来，在当前的菊苣转基因研究中均采用农杆菌介导的细胞核遗传转化
７２－８１
２００９年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第６期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
收稿日期：２００９０６２２；改回日期：２００９０７１０
基金项目：国家自然科学基金（３０９００９１４，３０６７１０８２），陕西省教育厅专项（０９ＪＫ７７７）和西北大学西部资源生物与生物技术教育部重点实验室开
放基金资助。
作者简介：王玉华（１９７５），女，山东肥城人，讲师，博士。
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｙｈ＠ｎｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；ｊｉａｊｆ３８＠ｎｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
方法，外源基因的表达效率相对较低。国内外至今未见有关菊苣的质体转化方面的报道。
本研究以我国西部干旱地区广泛种植的牧草菊苣为试验材料，用植物来源的甜菜碱醛脱氢酶（ｂｅｔａｉｎｅａｌｄｅ
ｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＢＡＤＨ）基因犅犃犇犎 代替抗生素标记基因，构建无抗生素标记的质体定点整合体表达载
体，为建立高效、稳定的菊苣质体转化和无抗生素筛选体系奠定基础，拓宽质体遗传转化的受体植物种类，也为进
一步通过质体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良，或以菊苣质体作生物反应器生产动物
口服疫苗等搭建技术平台。同时安全标记基因犅犃犇犎 在质体中的高效表达可以提高受体植物体内甜菜碱的积
累水平，有望使菊苣的抗旱、耐盐能力大幅提高，这将为西部地区大面积干旱、盐碱地的有效开发利用带来契机。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料
菊苣品种普纳种子购自西安市种子公司，于２００８年播种于草碳土∶蛭石＝１∶１的营养土中，让其萌发成
苗，取成熟叶片用于质体基因组ＤＮＡ的提取。
１．２ 菌种和质粒
质粒载体ｐＡＧ由陕西省生物技术重点实验室构建并保存，其上含有由叶绿体基因强启动子狆狉狉狀驱动的筛
选标记基因犪犪犱犃（编码氨基糖苷３′磷酸转移酶）及报告基因犵犳狆的多顺反子表达盒；大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅
犾犻）ＤＨ５α、克隆载体ｐＵＣ１１９及ｐＭＤ１８Ｔ载体购自宝生物大连有限公司。
１．３ 方法
１．３．１ 菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因犅犃犇犎ｃＤＮＡ的克隆 取幼嫩的菠菜（犛狆犻狀犪犮犻犪狅犾犲狉犪犮犲犪）叶片１ｇ左右，用
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ，以试剂盒带的ＯｌｉｇｏｄＴ随机引物为引物，采用Ｐｒｏｍｅｇａ的 ＭＭＬＶ
反转录酶合成ｃＤＮＡ第一链作为ＲＴ－ＰＣＲ的模板，以ＮＣＢＩ上发表的菠菜犅犃犇犎 基因（ＡＹ１５６６９４）序列为模
板设计一对引物ＢＡＤＨＵ：５′ＴＴＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＧＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＣ３′（引入犘狊狋Ⅰ位点）和ＢＡＤＨＬ：５′
ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＣＡ３′（引入犛犪犾Ⅰ位点）进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，反应程序为：９４℃预变
性３ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５３℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ；３０个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ。扩增产物经琼脂糖凝胶
电泳分离，用胶回收试剂盒回收目的条带，经纯化的ＰＣＲ产物通过ＡＴ克隆法克隆进ｐＭＤ１８Ｔ载体，重组质粒
经酶切验证后由上海生工生物工程有限公司进行测序。
１．３．２ 菊苣质体ＤＮＡ的提取 取菊苣叶片３０ｇ左右，４℃黑暗饥饿过夜后用于质体ＤＮＡ提取，提取方法参考
高盐低ｐＨ法［１５］，结合差速离心技术，先分离纯化质体，然后用常规ＣＴＡＢ法提取质体ＤＮＡ。
１．３．３ 菊苣质体同源片段的克隆 利用质体基因组进化中高度保守的特点，选取烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）、玉
米（犣犲犪犿犪狔狊）、拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）和大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）质体基因组中狉狆狊７基因和１６犛狉犇犖犃 基因
的保守序列为模板，设计引物 Ｐ１：５′ＧＣＴＣＴＡＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＴ３′；Ｐ２：５′ＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧ
ＧＣＧＡＴＴＡＣＴＡ３′。以菊苣质体基因组ＤＮＡ为模板用高保真的ＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应程序
为：９４℃预变性３ｍｉｎ（１个循环）；９４℃变性１ｍｉｎ，５８℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ（３０个循环）；最后７２℃延伸
１０ｍｉｎ。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用锋利的刀片割下目的产物，之后用胶回收试剂盒回收。经纯化的
ＰＣＲ产物通过ＡＴ克隆法克隆进ｐＭＤ１８Ｔ载体，重组质粒经酶切验证正确后由上海生工生物工程有限公司进
行测序，测序结果到ＮＣＢＩ上进行ＢＬＡＳＴ分析。
１．３．４ 菊苣质体表达载体的构建 首先对克隆到的质体同源片段进行序列分析，选取基因间隔区作为外源基因
的整合位点，并通过ＰＣＲ的方法引入适合的单一酶切位点作为外源基因的定点整合位点；以水稻质体强启动子
狆狉狉狀驱动筛外源基因表达盒，构建成嵌合基因犅犃犇犎 与犵犳狆多顺反子的菊苣质体表达载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ，并
对构建好的载体进行多重酶切验证，具体构建过程详见结果与分析。
２ 结果与分析
２．１ 菠菜犅犃犇犎 基因ｃＤＮＡ的克隆
Ｔｒｉｚｏｌ法抽提总ＲＮＡ（图１Ａ）为模板，采用Ｐｒｏｍｅｇａ的ＭＭＬＶ反转录酶进行ｃＤＮＡ合成，以ＮＣＢＩ上发表
的菠菜犅犃犇犎 基因（ＡＹ１５６６９４）序列为模板设计引物ＢＡＤＨＵ和ＢＡＤＨＬ，对菠菜ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，获
３７第１８卷第６期 草业学报２００９年
得长约１．５ｋｂ的条带（图１Ｂ）。将目的条带进行胶回
图１ 菠菜总犚犖犃（犃）及犅犃犇犎基因
犮犇犖犃的犚犜－犘犆犚扩增（犅）
犉犻犵．１ 犜狅狋犪犾犚犖犃（犃）犪狀犱犚犜－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳
犅犃犇犎犵犲狀犲犮犇犖犃（犅）狅犳狊狆犻狀犪犮犺
１～２：菠菜总ＲＮＡＴｏｔａｌＲＮＡｏｆｓｐｉｎａｃｈ；Ｍ：ＤＬ２０００分子标记
ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；３：犅犃犇犎 基因ｃＤＮＡＴｈｅｃＤＮＡｏｆ犅犃犇犎ｇｅｎｅ
图２ 菊苣犮狆犇犖犃及其限制性酶切分析
犉犻犵．２ 犮狆犇犖犃狅犳犮犺犻犮狅狉狔犪狀犱犻狋狊狉犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊
Ｍ：ＤＬ２０００＋ＤＬ１５０００分子标记 ＤＬ２０００＋ＤＬ１５０００ｍａｒｋｅｒ；１：
ｃｐＤＮＡ；２：犅犪犿ＨⅠ酶切 ＴｈｅｃｐＤＮＡｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犅犪犿ＨⅠ；
３：犘狊狋Ⅰ酶切 ＴｈｅｃｐＤＮＡｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犘狊狋Ⅰ
收，与 ｐＭＤ１８Ｔ 连 接 得 到 重 组 质 粒 ｐＭＤ１８Ｔ
ＢＡＤＨ，并转化大肠杆菌ＤＨ５α，经酶切验证正确的克
隆送公司测序。测序结果显示，该ｃＤＮＡ 片段全长
１４９４ｂｐ，与发表的序列完全一致。
２．２ 菊苣叶绿体ＤＮＡ的提取
采用改进的高盐低ｐＨ 法，结合２次差速离心技
术，提取菊苣叶绿体基因组ＤＮＡ（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔＤＮＡ，
ｃｐＤＮＡ），经琼脂糖凝胶电泳检测所提的ｃｐＤＮＡ质量
完好（图２，泳道１），除了有少量多糖或蛋白外，基本无
降解，分别用犅犪犿ＨⅠ和犘狊狋Ⅰ进行酶切检测ｃｐＤＮＡ
的质量。由图２泳道２和３可以看出，菊苣ｃｐＤＮＡ经
限制性酶切后电泳，可见一系列大小不同的条带，而非
基因组总ＤＮＡ酶切后呈完全弥散状，说明本研究采
用该方法提取的ｃｐＤＮＡ能够满足后续试验ＰＣＲ的
要求。
２．３ 菊苣质体同源片段的克隆与序列分析
由于质体载体一般具有物种特异性，因此要构建
菊苣特异的质体表达载体必须清楚其质体基因组序列
信息，而目前数据库中还没有菊苣质体基因组序列发
表。但质体基因组在进化中具有高度保守性，无论是
基因的碱基组成还是其排列方式等都非常保守。利用
这一特点，选取烟草、玉米、拟南芥和大豆质体基因组
中狉狆狊７基因和１６犛狉犇犖犃 基因的保守序列为模板设
计引物，从菊苣质体基因组中扩增包括狉狆狊７至１６犛
狉犇犖犃 基因在内的一段序列。从图３Ａ的扩增结果可
知，经引物Ｐ１和Ｐ２扩增后得到１条长约４．８ｋｂ的质
体同源片段Ｔ。ＰＣＲ产物回收纯化后与ｐＭＤ１８Ｔ载
体连接，得到重组质粒命名为ｐＭＤ１８ＪＦ３，送上海生
工生物工程有限公司测序。
对测序结果进行ＢＬＡＳＴ分析，结果表明，该片段
长４７５１ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＧＱ１９９４７８），包括狉狆狊７基因ＯＲＦ框的５′端４４９ｂｐ（缺少３′末端１９ｂｐ）、７９３ｂｐ
的狉狆狊１２基因序列、７２ｂｐ的狋狉狀犞基因序列、１６犛狉犇犖犃５′端１３１５ｂｐ序列（缺少３′末端１７６ｂｐ）以及大部分的基
因间隔区，绘制该片段的结构图如图４所示。该序列与烟草对应区段的相似性为９２％，与莴苣（犔犪犮狋狌犮犪狊犪狋犻狏犪）
对应区段的相似性为９７％，序列差异较大的区域主要位于基因间隔区，上述分析到的狉狆狊７基因、狉狆狊１２基因、
狋狉狀犞基因以及１６犛狉犇犖犃 基因序列高度保守，相似性均在９９％以上。
在构建菊苣质体表达载体前需要了解同源片段上的酶切位点情况，为此，利用ＤＮＡＭＡＮ软件对扩增到的
质体同源片段Ｔ进行限制性酶切分析，并绘制限制性酶切图谱（图５），该片段中共有１９个常见的限制性酶切位
点，且主要位于前１５００ｂｐ内。
２．４ 菊苣定点整合表达载体的构建与鉴定
先将获得的菊苣质体同源片段克隆进母体载体ｐＵＣ１１９，获得中间载体ｐＪＬＲ，然后将犪犪犱犃与犵犳狆 基因多
顺反子表达盒ｐＡＧ克隆进质体同源片段中间的单一酶切位点，获得菊苣质体定点整合表达载体ｐＪＡＧ１，最后用
４７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
犅犃犇犎 基因替换抗生素选择标记基因犪犪犱犃，获得非抗生素标记的菊苣质体定点整合表达载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ，
载体构建流程如图６所示。
２．４．１ 菊苣质体同源片段载体ｐＪＬＲ的构建及鉴定 根据序列分析结果，为方便载体构建，选取狋狉狀犞１６犛狉犇
犖犃 基因所在区段作为外源基因向质体基因组整合的右侧同源重组片段Ｒ（ｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅＲ），选取狉狆狊１２与
狋狉狀犞基因长间隔区作为左侧同源重组片段Ｌ（ｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅＬ），外源基因的整合位点位于邻近狋狉狀犞基因的
基因间隔区。依据同源片段的限制性酶切图谱结果（图５），以重组质粒ｐＭＤ１８ＴＪＦ３为模板，设计引物ＪＦＬＵ：
５′ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＣＴＴＴＣＣＧＴＴＴ３′（引入犈犮狅犚Ⅰ）和ＪＦＬＬ：５′ＣＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴ
ＴＧＡＡＣＡＡＣＴ３′（引入犎犻狀犱Ⅲ），扩增１５８８ｂｐ的左侧同源重组片段Ｌ（图３Ｂ，泳道２；图４），同时设计引物
图３ 菊苣质体同源片段的扩增
犉犻犵．３ 犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮犺犻犮狅狉狔犮犺犾狅狉狅狆犾犪狊狋犺狅犿狅犾狅犵狅狌狊犳狉犪犵犿犲狀狋狊
Ｍ１：ＤＬ１５０００分子标记 ＤＬ１５０００ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ２０００分子标记 ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１～３：质体同源片段
Ｔ、Ｌ和ＲＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｆｒａｇｍｅｎｔＴ，ＬａｎｄＲ
图４ 菊苣质体同源片段结构
犉犻犵．４ 犛犮犺犲犿犪狋犻犮犱犻犪犵狉犪犿狊狅犳犮犺犻犮狅狉狔犮犺犾狅狉狅狆犾犪狊狋犺狅犿狅犾狅犵狅狌狊犳狉犪犵犿犲狀狋狊
图５ 菊苣质体同源片段犜限制性酶切图谱
犉犻犵．５ 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犿犪狆狊狅犳犮犺犻犮狅狉狔犮犺犾狅狉狅狆犾犪狊狋犺狅犿狅犾狅犵狅狌狊犳狉犪犵犿犲狀狋犜
５７第１８卷第６期 草业学报２００９年
图６ 菊苣质体表达载体狆犑犅犃犇犎犌犉犘的构建
犉犻犵．６ 犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犮犺犻犮狅狉狔犮犺犾狅狉狅狆犾犪狊狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犑犅犃犇犎犌犉犘
６７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
ＪＦＲＵ：５′ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＣＴＴＡＧＧＡＴＴＡＧＴＣＡ３′（引入犎犻狀犱Ⅲ）和ＪＦＲＬ：５′ＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧ
ＧＡＣＧＧＧＴＴＴＴＴＧＧ３′（引入犘狊狋Ⅰ），扩增１５９０ｂｐ的右侧同源重组片段Ｒ（图３Ｂ，泳道３；图４），为方便外源基
因的克隆，在２同源片段中间引入单一切点 犎犻狀犱Ⅲ，另一端分别引入犈犮狅犚Ⅰ和犘狊狋Ⅰ切点，扩增产物分别用
犈犮狅犚Ⅰ／犎犻狀犱Ⅲ及犎犻狀犱Ⅲ／犘狊狋Ⅰ进行双酶切。同时用ＴａｋａＲａ的ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ去除母体载体ｐＵＣ１１９上
的犎犻狀犱Ⅲ切点并自连，然后用犘狊狋Ⅰ／犈犮狅犚Ⅰ双酶切不含犎犻狀犱Ⅲ切点的载体ｐＵＣ１１９，之后与两质体同源重组
片段Ｌ、Ｒ连接得到菊苣质体同源片段载体ｐＪＬＲ（约６．３ｋｂ）。对重组质粒ｐＪＬＲ进行多重酶切验证，均得到预
期大小的片段（图７），证明重组质粒ｐＪＬＲ构建正确。
图７ 重组质粒狆犑犔犚的酶切验证
犉犻犵．７ 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犑犔犚
Ｍ：ＤＬ２０００＋ＤＬ１５０００分子标记 ＤＬ２０００＋ＤＬ１５０００ｍａｒｋｅｒ；１：犈犮狅犚Ⅰ
和犘狊狋Ⅰ双酶切 Ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犈犮狅犚Ⅰａｎｄ犘狊狋Ⅰ；２：犈犮狅犚Ⅰ和犎犻狀犱Ⅲ
双酶切 Ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犈犮狅犚Ⅰａｎｄ犎犻狀犱Ⅲ；３：犎犻狀犱Ⅲ和犘狊狋Ⅰ双酶切
Ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犎犻狀犱Ⅲａｎｄ犘狊狋Ⅰ；４：犅犪犿ＨⅠ和犘狊狋Ⅰ双酶切
Ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犅犪犿ＨⅠａｎｄ犘狊狋Ⅰ；５：犅犪犿ＨⅠ和犎犻狀犱Ⅲ
双酶切 Ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犅犪犿ＨⅠａｎｄ犎犻狀犱Ⅲ
２．４．２ 外源基因表达盒与菊苣质体同源片段的连接
先将载体ｐＪＬＲ用犘狊狋Ⅰ酶切，酶切产物回收、纯化之
后用ＴａｋａＲａ的ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ将粘端补平并自
连，以此去除载体ｐＪＬＲ上的犘狊狋Ⅰ位点，将该载体命
名为ｐＪＬＲ１。以 犎犻狀犱Ⅲ酶切载体ｐＡＧ，回收包含多
顺反子表达盒在内的２．１ｋｂ的小片段，将其克隆进经
相同酶切处理并去磷酸化的载体ｐＪＬＲ１上，得到中间
载体ｐＪＡＧ１。对载体ｐＪＡＧ１进行犎犻狀犱Ⅲ酶切验证，
所获得的３个克隆均能切出２．１ｋｂ的小片段（图８，泳
道２和４），而对照载体ｐＪＬＲ则无小片段切出（图８，
泳道１），初步表明外源基因表达盒已经成功克隆进菊
苣质体同源片段中间。此外，因外源基因表达盒是以
相同的２个粘端连接进载体ｐＪＬＲ的犎犻狀犱Ⅲ位点的，
以犈犮狅犚Ⅰ和犡犫犪Ⅰ对载体ｐＪＡＧ１进行双酶切以验证
外源基因表达盒的插入方向，图９的酶切结果显示，３
个克隆中有２个（图９，泳道１和２）属于一种插入方
向，均切出３．３和５．１ｋｂ的条带，将载体命名为
ｐＪＡＧ１Ａ，另有１个克隆插入方向与前完全相反，切出
２．０和６．４ｋｂ的条带（图９，泳道３），命名为ｐＪＡＧ１Ｂ。
图８ 重组质粒狆犑犃犌１的犎犻狀犱Ⅲ酶切鉴定
犉犻犵．８ 犎犻狀犱Ⅲ狉犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犑犃犌１
Ｍ：ＤＬ１５０００分子标记 ＤＬ１５０００ｍａｒｋｅｒ；１：犎犻狀犱Ⅲ酶切质粒ｐＪＬＲ
ＰｌａｓｍｉｄｐＪＬＲｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犎犻狀犱Ⅲ；２～４：犎犻狀犱Ⅲ酶切质粒
ｐＪＡＧ１ＰｌａｓｍｉｄｐＪＡＧ１ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犎犻狀犱Ⅲ
图９ 重组质粒狆犑犃犌１的犈犮狅犚Ⅰ和犡犫犪Ⅰ双酶切鉴定
犉犻犵．９ 犈犮狅犚Ⅰ犪狀犱犡犫犪Ⅰ狉犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊
狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犑犃犌１
Ｍ：ＤＬ２０００＋ＤＬ１５０００分子标记 ＤＬ２０００＋ＤＬ１５０００ｍａｒｋｅｒ；
１～３：３个不同的质粒克隆 Ｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｓｍｉｄｃｌｏｎｅｓ
７７第１８卷第６期 草业学报２００９年
２．４．３ 菊苣质体定点整合表达载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ的构建与鉴定 选取ｐＪＡＧ１Ａ为基础进行后续载体构建，
犘狊狋Ⅰ和犛犪犾Ⅰ双酶切质粒ｐＭＤ１８ＴＢＡＤＨ，切下１．５ｋｂ的目的基因犅犃犇犎，以此替换载体ｐＪＡＧ１Ａ上的０．８
ｋｂ左右的犪犪犱犃基因片段，得到最终的菊苣质体定点整合表达载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ。
对构建好的载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ进行酶切分析，由载体构建流程图（图６）可以看出，载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ质体
同源片段狉狆狊１２外侧有１个犈犮狅犚Ⅰ位点，而目的基因犅犃犇犎 上游５７７ｂｐ处有１个犈犮狅犚Ⅰ位点。因此，如果目
的基因成功插入，以犈犮狅犚Ⅰ对载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ进行酶切，应该切出２．３和６．８ｋｂ的２个片段，图１０Ａ的酶切
结果显示载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ构建正确；同理，因目的基因犅犃犇犎 上游９２８ｂｐ处有１个犎犻狀犱Ⅲ位点，加上载体
上原来的２个犎犻狀犱Ⅲ位点，以犎犻狀犱Ⅲ对载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ酶切，也切出了预期的１．１，１．７和６．３ｋｂ３个片段
（图１０Ｂ），进一步说明载体构建正确。同时对所得３个克隆进行犅犃犇犎 基因的ＰＣＲ扩增，扩增结果（图１１）
进一步证实犅犃犇犎基因已成功克隆进载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ中。综上说明构建的载体ｐＪＢＡＤＨＧＦＰ符合预期
设计。
图１０ 重组质粒狆犑犅犃犇犎犌犉犘的犈犮狅犚Ⅰ（犃）和犎犻狀犱Ⅲ酶切（犅）
犉犻犵．１０ 犈犮狅犚Ⅰ（犃）犪狀犱犎犻狀犱Ⅲ（犅）狉犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犑犅犃犇犎犌犉犘
Ｍ１：ＤＬ１５０００分子标记 ＤＬ１５０００ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ２０００＋ ＤＬ１５０００分子标记 ＤＬ２０００＋ ＤＬ１５０００ｍａｒｋｅｒ；
１～３：３个不同的质粒克隆 Ｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｓｍｉｄｃｌｏｎｅｓ
３ 讨论
图１１ 重组质粒狆犑犅犃犇犎犌犉犘的犘犆犚验证
犉犻犵．１１ 犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀狋狅犮狅狀犳犻狉犿犪狋犲狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋
狆犾犪狊犿犻犱狆犑犅犃犇犎犌犉犘
Ｍ：ＤＬ２０００分子标记 ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１～３：３个不同
的质粒克隆 Ｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｓｍｉｄｃｌｏｎｅｓ
３．１ 质体转化的受体植物范围有待进一步扩大
通过质体转化技术已在模式植物烟草［１６］中获得
了大量稳定的转基因植株，另外仅在拟南芥［１７］、水稻
（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）［１８］、油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊）［１９］、马铃薯
（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）［２０］、棉 花 （犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌
狋狌犿）［２１］、矮牵牛（犘犲狋狌狀犻犪犺狔犫狉犻犱犪）［２２］、大豆［２３］、莴
苣［２４］、胡萝卜（犇犪狌犮狌狊犮犪狉狅狋犪）［２５］、番茄（犛狅犾犪狀狌犿
犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）［２６］、甘蓝（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪）［２７］、杨树
（犘狅狆狌犾狌狊犪犾犫犪）［２８］等十余种植物中有相关报道，从而
限制了该技术的应用范围，所以扩大叶绿体转化的受
体植物种类不仅具有重大的理论意义，而且具有深远
的实践意义。本研究尝试开展菊苣的质体转化工作，
但是，质体转化的表达载体基本上都具有植物种的特
异性，因此构建菊苣的质体表达载体是开展其质体转
化的前提和基础。
８７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
３．２ 质体转化亟需非抗生素筛选标记
叶绿体基因组以高拷贝数存在，而同时转化这么多基因组是不可能的，极易出现转化的与未转化的叶绿体组
成的异质体，无法保证获得的性状稳定遗传下去。这个问题的解决是通过向叶绿体中转入筛选标记基因进行抗
性筛选，淘汰掉未转化的叶绿体来实现的。多种选择标记已经在叶绿体转化中得到应用，如叶绿体内源选择标
记［２９］、负选择标记［３０］和抗生素抗性选择标记［３１］。最常用的还是抗生素选择标记，如壮观霉素［３１］、链霉素［３１］、卡
那霉素抗性［３２］等，它们都是人类和动物用来控制细菌感染的常用抗生素。
转基因植物中存留的抗生素筛选基因可能会危害人类肠道内的正常菌落或传播到周围环境中引起基因污
染，一直是引起人们担心的主要原因。虽然外源基因在大多数植物的叶绿体中遵循母性遗传规律，不会随花粉飘
逸，然而，筛选标记基因被转移到近缘野生种或者微生物的可能性并没有完全排除。因此，开展有效的无筛选标
记基因的叶绿体转化研究势在必行。以往曾有研究在获得叶绿体转化植株后，通过“ｌｏｏｐｏｕｔ”重组系统［３３］去除
筛选标记基因，但这种方法操作起来很困难，因为同质化转基因植株的获得是无法预料的。另一种在叶绿体中去
除筛选标记基因的方法是用“Ｃｒｅ／Ｌｏｘ”系统［３４］，该方法需要额外的二次转化及有性杂交过程来引入和随后去除
ＣＲＥ重组酶。
植物中有一种甜菜碱醛脱氢酶（由犅犃犇犎 基因编码），能够将有毒的甜菜碱醛（ｂｅｔａｉｎｅａｌｄｅｈｙｄｅ，ＢＡ）转化
为无毒的甜菜碱（ｇｌｙｃｉｎｅｂｅｔａｉｎｅ），这种酶在有限的几种干旱、盐碱地区植物叶绿体中存在，因此可在多种农作物
中用做筛选标记。犅犃犇犎 基因用作标记基因较安全，有巨大的潜在优势：１）基因来源及产物安全；２）催化形成的
终产物甜菜碱对受体植物有益，它是高等植物天然的渗透调节物质，可提高植物的抗渗透胁迫能力［３５］；３）筛选程
序简单，只要在培养基中添加适量的甜菜碱醛提供筛选压即可，无须其他辅助设备。Ｄａｎｉｅｌ 等［３６］以ＢＡ为筛选
剂进行烟草叶绿体转化获得了成功，用ＢＡ为筛选剂，１２ｄ内可从８０％的叶盘获得转基因幼苗，平均每个叶盘有
２３株幼苗；而以目前通用的壮观霉素为筛选剂，４５ｄ可从１５％的叶盘获得转基因幼苗，平均每个叶盘有１～２株
幼苗。可见ＢＡ筛选比壮观霉素筛选提高２５倍，且再生速度明显加快。因此，本研究以菠菜中天然存在的基因
犅犃犇犎 作为筛选基因，构建菊苣的非抗生素标记的质体定点整合表达载体，可有效缓解公众对转基因植物的排
斥心理。
３．３ 犅犃犇犎 基因在质体中的高表达可提高植物的耐盐能力
犅犃犇犎 除了用作筛选标记外，常用在农作物的抗旱耐盐基因工程改良中，因此可以通过基因工程手段将
犅犃犇犎 基因导入盐敏感植物体内，提高甜菜碱积累水平，从而提高其耐盐能力。已有研究报道转犅犃犇犎 基因的
胡萝卜［２５］、番茄［３７］、烟草［３８］和早熟禾（犘狅犪狆狉犪狋犲狀狊犻狊）［３９］抗盐能力都有很大提高。因此，如果通过叶绿体转化技
术，使犅犃犇犎 在植物叶绿体中高效表达，除了可以用ＢＡ对转化子进行抗性筛选外，同时赋予转基因受体植物较
强的抗旱和耐盐特性，可谓一箭双雕。
参考文献：
［１］ ＳｈｉｍｉｚｕＭ，ＧｏｔｏＭ，ＨａｎａｉＭ，犲狋犪犾．Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｂｙｍｕｔａｔｅｄａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏ
ｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｇｅｎｏｍｅｏｆｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００８，１４７（４）：１９７６１９８３．
［２］ ＡｒｌｅｎＰＡ，ＦａｌｃｏｎｅｒＲ，ＣｈｅｒｕｋｕｍｉｌｉＳ，犲狋犪犾．Ｆｉｅｌｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｌ
ｐｈａ２ｂ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ，２００７，５（４）：５１１５２５．
［３］ ＡｒｌｅｎＰＡ，ＳｉｎｇｌｅｔｏｎＭ，ＡｄａｍｏｖｉｃｚＪＪ，犲狋犪犾．ＥｆｆｅｃｔｉｖｅｐｌａｇｕｅｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｖｉａｏｒａｌｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｐｌａｎｔｃｅｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＦ１Ｖａｎ
ｔｉｇｅｎｓｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，２００８，７６（８）：３６４０３６５０．
［４］ ＣｈｅｂｏｌｕＳ，ＤａｎｉｅｌＨ．ＳｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧａｌ／ＧａｌＮａｃｌｅｃｔｉｎｏｆ犈狀狋犪犿狅犲犫犪犺犻狊狋狅犾狔狋犻犮犪ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓａｎｄｉｍｍｕｎｏ
ｇｅｎｉｃｉｔｙｉｎｍｉｃｅｔｏｗａｒｄｓｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｏｒａｍｏｅｂｉａｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ，２００７，５（２）：２３０２３９．
［５］ ＳｈａｏＨＢ，ＨｅｄＭ，ＱｉａｎＫＸ，犲狋犪犾．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎＥ２ｇｅｎｅｉｎｔｏｂａｃｃｏｃｈｌｏｒｏ
ｐｌａｓｔｓｆｏｒａｐｐｌｙｉｎｇｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓａｓｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＣｏｍｐｔｅｓＲｅｎｄｕｓＢｉｏｌｏｇｉｅｓ，２００８，３３１（３）：１７９１８４．
［６］ 王婷婷，徐国荣，张举仁，等．细胞工程技术选育的草地早熟禾新种质的耐热性分析［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（２）：６０６５．
［７］ ＡｂｉｄＭ，ＰａｌｍｓＢ，ＤｅｒｙｋｅＲ，犲狋犪犾．ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｃｏｒｙａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｕｉｄＡａｎｄｎｐｔⅡｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅ
９７第１８卷第６期 草业学报２００９年
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ，１９９５，４６（２８４）：３３７３４６．
［８］ ＰｉéｒｏｎＳ，ＷａｔｉｌｏｎＢ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｃｈｉｍｅｒｉｃ犌犝犛ｇｅｎｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｓａｔｏｏｌｔｏｓｔｕｄｙｎｏｄｕｌｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｃｈｉｃｏｒｙｌｅａｖｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ，２００１，６６（３）：１５９１６５．
［９］ 宋书锋，曹凤，杨培志，等．普那菊苣高效再生体系建立和遗传转化研究［Ｊ］．分子植物育种，２００６，４（４）：５６５５７０．
［１０］ ＷｉｌｉａｍｓＦＭＫ，ＤａｖｅｙＭＲ，ＰｏｗｅｒＪＢ，犲狋犪犾．Ｃｈｉｃｏｒｙ（犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊Ｌ．）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｈｅ犾狅犾１ｇｅｎｅｅｘｈｉｂｉｔｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｏｆｉｃｅｒｅｃｒｙｓｔａｌｉｓａｔｉｏｎ［Ａ］．Ｉｎ：ｖａｎＨｉｎｔｕｍＴＪＬ，ＬｅｂｅｄａＡ，ＰｉｎｋＤ，犲狋犪犾．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＥｕｃａｒｐｉａＭｅｅｔｉｎｇｏｎＬｅａｆｙ
ＶｅｇｅｔａｂｌｅｓＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００３［Ｃ］，Ｎｏｏｒｄｗｉｊｋｅｒｈｏｕｔ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２００３．１３７１４２．
［１１］ ＬｉｍＨＴ，ＰａｒｋＥＪ，ＬｅｅＪＹ，犲狋犪犾．Ｈｉｇｈｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｅｃｔｏｐｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犗狊犕犃犇犛１ｇｅｎｅｉｎｒｏｏｔｃｈｉｃｏｒｙ（犆犻
犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊Ｌ．ｖａｒ．狊犪狋犻狏狌狊）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ，２００３，５（４）：２１５２１９．
［１２］ 程林梅，曹秋芬，高洪文，等．菊苣再生体系建立及转犃犉犔２基因的研究［Ｊ］．草地学报，２００４，１２（３）：１１９２０３．
［１３］ 程林梅，孙毅，王亦学，等．菊苣农杆菌介导转化受体系统的研究［Ｊ］．草业学报，２００８，１７（１）：１３０１３４．
［１４］ 赵宇玮，王英娟，步怀宇，等．犃狋犖犎犡１基因对菊苣的转化和耐盐性研究［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（３）：１０３１０９．
［１５］ 龚小松，阎隆飞．高等植物质体ＤＮＡ提取方法改进［Ｊ］．科学通报，１９９１，３６（６）：４６７４６９．
［１６］ ＣｈａｋｒａｂａｒｔｉＳＫ，ＬｕｔｚｋＡ，ＬｅｒｔｗｉｒｉｙａｗｏｎｇＢ，犲狋犪犾．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｃｒｙ９Ａａ２Ｂ．Ｔ．ｇｅｎｅｉｎｔｏｂａｃｃｏｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓｃｏｎｆｅｒｓｒｅ
ｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｐｏｔａｔｏｔｕｂｅｒｍｏｔ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，２００６，１５（４）：４８１４８８．
［１７］ ＳｉｋｄａｒＳＲ，ＳｅｒｉｎｏＧ，ＣｈａｕｄｈｕｒｉＳ，犲狋犪犾．Ｐｌａｓｔｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔ，１９９８，
１８（１）：２０２４．
［１８］ ＬｅｅＳＭ，ＫａｎｇＫ，ＣｈｕｎｇＨ，犲狋犪犾．Ｐｌａｓｔｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓｃｅｒｅａｌｃｒｏｐ，ｒｉｃｅ（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）ａｎｄ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｔｏｔｈｅｉｒｐｒｏｇｅｎｙ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｓａｎｄＣｅｌｓ，２００６，２１（３）：４０１４１０．
［１９］ ＨｏｕＢＫ，ＺｈｏｕＹＨ，ＷａｎＬＨ，犲狋犪犾．Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｏｉｌｓｅｅｄｒａｐｅ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，１２（１）：
１１１１１４．
［２０］ ＮｇｕｙｅｎＴＴ，ＮｕｇｅｎｔＧ，ＣａｒｄｉＴ，犲狋犪犾．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃｐｌａｓｔｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｏｆａｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｃｕｌｔｉｖａｒｏｆｐｏｔａｔｏ
（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿Ｌ．）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００５，１６８（６）：１４９５１５００．
［２１］ ＫｕｍａｒＳ，ＤｈｉｎｇｒａＡ，ＤａｎｉｅｌＨ．Ｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｔｔｏｎｐｌａｓｔｉｄｇｅｎｏｍｅａｎｄｍａｔｅｒｎａｌｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００４，５６（２）：２０３２１６．
［２２］ ＺｕｂｋｏｔＭＫ，ＺｕｂｋｏｔＥＩ，ｖａｎＺｕｉｌｅｎＫ，犲狋犪犾．Ｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｅｔｕｎｉａｐｌａｓｔｉｄｓ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，２００４，
１３（６）：５２３５３０．
［２３］ ＤｕｆｏｕｒｍａｎｔｅｌＮ，ＴｉｓｓｏｔＧ，ＧｏｕｔｏｒｂｅＦ，犲狋犪犾．ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｏｙｂｅａｎｐｌａｓｔｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＢａｃｉｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｔｓ／ｃｒｙ１Ａｂｐｒｏｔｏｘｉｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００５，５８（５）：６５９６６８．
［２４］ ＲｕｈｌｍａｎＴ，ＡｈａｎｇａｒｉＲ，ＤｅｖｉｎｅＡ，犲狋犪犾．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎＢｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎｌｅｔｔｕｃｅａｎｄｔｏｂａｃｃｏｃｈｌｏ
ｒｏｐｌａｓｔｓｏｒａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｉｎｓｕｌｉｔｉｓｉｎｎｏｎｏｂｅｓｅｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
２００７，５（４）：４９５５１０．
［２５］ ＫｕｍａｒＳ，ＤｈｉｎｇｒａＡ，Ｄａｎｉｅｌ Ｈ．Ｐｌａｓｔｉｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂａｔａｉｎｅａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｉｎｃａｒｒｏｔｃｕｌｔｕｒｅｄｃｅｌｓｒｏｏｔｓ，ａｎｄ
ｌｅａｖｅｓｃｏｎｆｅｒｓｅｎｈａｎｃｅｄｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，１３６（１）：２８４３２８５４．
［２６］ ＷｕｒｂｓＤ，ＲｕｆＳ，ＢｏｃｋＲ．Ｃｏｎｔａｉｎｅｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎｔｏｍａｔｏｅｓｂｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇｅｎｅｓｆｒｏｍ
ｔｈｅｐｌａｓｔｉｄｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００７，４９（２６）：２７６２８８．
［２７］ ＬｉｕＣＷ，ＬｉｎＣＣ，ＣｈｅｎＪＪ，犲狋犪犾．Ｓｔａｂｌｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｃａｂｂａｇｅ（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪Ｌ．ｖａｒ．犮犪狆犻狋犪狋犪Ｌ．）ｂｙ
ｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔ，２００７，２６（１０）：１７３３１７４４．
［２８］ ＯｋｕｍｕｒａＳ，ＳａｗａｄａＭ，ＰａｒｋＹＷ，犲狋犪犾．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｏｐｌａｒ（犘狅狆狌犾狌狊犪犾犫犪）ｐｌａｓｔｉｄｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏ
ｔｅｉｎｓｉｎｔｒｅｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，２００６，１５（５）：６３７６４６．
［２９］ ＳｖａｂＺ，ＨａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚＰ，ＭａｌｉｇａＰ．Ｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｔｉｄｓｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅ
ｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，１９９０，８７（２１）：８５２６８５３０．
［３０］ ＣｏｒｎｅｉｌｅＳ，ＬｕｔｚＫ，ＳｖａｂＺ，犲狋犪犾．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｈｅｐｌａｓｔｉｄｇｅｎｏｍｅｂｙｔｈｅＣＲＥｌｏｘ
ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００１，２７（２）：１７１１７８．
［３１］ ＳｖａｂＺ，ＭａｌｉｇａＰ．Ｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙｐｌａｓｔｉｄｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎｉｎｔｏｂａｃｃｏｂｙｓｅｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒｃｈｉｍｅｒｉｃ犪犪犱犃ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ
０８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，１９９３，９０（３）：９１３９１７．
［３２］ ＣａｒｒｅｒＨ，ＨｏｃｋｅｎｂｅｒｒｙＴＮ，ＳｖａｂＺ，犲狋犪犾．Ｋａｎｎａｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓａｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｐｌａｓｔｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｏｂａｃ
ｃｏ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９９３，２４１（１２）：４９５６．
［３３］ ＩａｍｔｈａｍＳ，ＤａｙＡ．Ｒｅｍｏｖａｌｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｓｔｉｄｓ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，
１８（１１）：１１７２１１７６．
［３４］ ＨａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚＰＴ，ＧｉｌｂｅｒｔｓｏｎＬ，ＳｔａｕｂＪＭ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｐａｔｈｗａｙｓｆｏｒＣｒｅ／ｌｏｘｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎｐｌａｓｔｉｄｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｊｏｕｒｎａｌ，２００１，２７（２）：１６１１７０．
［３５］ 王玉祥，张博，王涛．盐胁迫对苜蓿叶绿素、甜菜碱含量和细胞膜透性的影响［Ｊ］．草业科学，２００９，２６（３）：５３５６．
［３６］ ＤａｎｉｅｌＨ，ＷｉｅｂｅＰＯ，ＭｉｌａｎＡＦＳ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｆｒｅｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－ａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｙｆｒｉｅｎｄｌｙａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．
ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００１，６（６）：２３７２３９．
［３７］ ＪｉａＧＸ，ＺｈｕＺＱ，ＣｈａｎｇＦＱ，犲狋犪犾．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｏｍａｔｏｗｉｔｈｔｈｅ犅犃犇犎ｇｅｎｅｆｒｏｍＡｔｒｉｐｌｅｘｉｍｐｒｏｖｅｓｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．
ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔ，２００２，２１（２）：１４１１４６．
［３８］ 司怀军，张宁，王蒂．转甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草抗旱及耐盐性［Ｊ］．作物学报，２００７，３３（８）：１３３５１３３９．
［３９］ 徐冰，韩烈保，姚娜，等．草地早熟禾转ＣＭＯＢＡＤＨ 双基因和转ＣＭＯ基因耐盐性分析［Ｊ］．草地学报，２００８，１６（４）：
３５３３５８．
犆犾狅狀犻狀犵狅犳犺狅犿狅犾狅犵狅狌狊狋犪狉犵犲狋犻狀犵狊犲狇狌犲狀犮犲狊犪狀犱犮狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犪狀狋犻犫犻狅狋犻犮犳狉犲犲
狆犾犪狊狋犻犱狊犻狋犲狊狆犲犮犻犳犻犮犻狀狋犲犵狉犪狋犻狅狀犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狅犳犮犺犻犮狅狉狔
ＷＡＮＧＹｕｈｕａ，ＨＡＯＪｉａｎｇｕｏ，ＪＩＡＪｉｎｇｆｅｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；
ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＷｅｓｔｅｒｎＣｈｉｎａ，Ｘｉ’ａｎ７１００６９，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎａｍｐｌｉｆｙｉｎｇｐｌａｓｔｉｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｃｈｉｃｏｒｙｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖａ
ｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｂｏｔｈ狉狆狊７ａｎｄ１６犛狉犇犖犃 ｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｔｏｂａｃｃｏ，ｍａｉｚｅ，犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪ａｎｄｓｏｙｂｅａｎ
ｐｌａｓｔｉｄｇｅｎｏｍｅｓ．Ｔｈｅ４．８ｋｂｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃｈｉｃｏｒｙｐｌａｓｔｉｄｇｅｎｏｍｅ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａ
ｔｅｄｔｈａｔｔｈｉｓｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓ４７５１ｂｐｉｎｓｉｚｅ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＧＱ１９９４７８），ａｎｄｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆ４４９ｂｐ
５′ｅｎｄｏｆｔｈｅ狉狆狊７ｇｅｎｅ，７９３ｂｐｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ狉狆狊１２ｇｅｎｅ，７２ｂｐｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅ狋狉狀犞ｇｅｎｅ，１３１５ｂｐ５′ｅｎｄｏｆ
ｔｈｅ１６犛狉犇犖犃ｇｅｎｅａｎｄｍｏｓｔｇｅｎｅｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｒｅｇｉｏｎｓ．ＴｈｅＢＬＡＳＴｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆｔｈｉｓ
ｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈｔｏｂａｃｃｏａｎｄｌｅｔｔｕｃｅｗｅｒｅ９２％ａｎｄ９７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｕｓｉｎｇｔｈｉｓｆｒａｇｍｅｎｔａｓａｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｃｈｉｃｏｒｙｓｐｅｃｉｆｉｃｐｌａｓｔｉｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＪＢＡＤＨ
ＧＦＰｔｈａｔｃａｒｒｉｅｓｔｈｅｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｏｆ狆狉狉狀犅犃犇犎犵犳狆狆狊犫犃３′．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈｉｓ．Ｔｈｉｓｐｌａｓｔｉｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｉｓｄｅｓｉｒａｂｌｅｂｏｔｈｆｏｒｕｓｅｉｎｅｓｔａｂｌｉｓｈ
ｍｅｎｔｏｆａｃｈｉｃｏｒｙａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｆｒｅｅｐｌａｓｔｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｔｒａｉｔｓｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｃｈｉｃｏｒｙｏｒｆｏｒｕｓｅａｓａ
ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｔｏｐｒｏｄｕｃｅｅｄｉｂｌｅｖａｃｃｉｎｅｓｆｏｒａｎｉｍａｌｓｖｉａｐｌａｓｔｉｄｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｃｈｉｃｏｒｙ；ｐｌａｓｔｉｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｆｒａｇｍｅｎｔｓ；ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｆｒｅｅ；ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ
１８第１８卷第６期 草业学报２００９年