全 文 ：书高温胁迫下紫花苜蓿抑制消减文库的构建
韩明鹏１，王彦华２，高永革２，张晓霞２，苏芳蕊３，许红１，王成章１
（１．河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州４５０００２；２．河南省饲草饲料站，河南 郑州４５０００８；
３．河南农业大学信息与管理科学学院，河南 郑州４５０００２）
摘要：为分离和获得紫花苜蓿高温胁迫诱导相关基因片段的ＥＳＴ序列。以秋眠６级的紫花苜蓿品种（ＡＢＩ７００）为
材料，以４５℃高温胁迫下的紫花苜蓿幼嫩茎叶ｃＤＮＡ为试验方（ｔｅｓｔｅｒ），以正常生长（２２℃）的紫花苜蓿幼嫩茎叶
ｃＤＮＡ为驱动方（ｄｒｉｖｅｒ），利用抑制性消减杂交技术（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）构建了高温胁迫
下紫花苜蓿幼嫩茎叶的正向抑制消减文库。从消减文库中随机挑取１２０个阳性克隆，进行菌液ＰＣＲ鉴定。结果显
示，消减文库的滴度为４２３０ｐｆｕ／ｍＬ，重组率为９７．８％，插入片段大小主要集中在３００～７５０ｂｐ。本研究为紫花苜
蓿抗热基因克隆和系统研究高温胁迫下紫花苜蓿基因的表达奠定了一定的理论基础。
关键词：紫花苜蓿；抑制消减杂交；高温胁迫
中图分类号：Ｑ９４３．１；Ｓ５４１＋．１０３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０５０１２６０７
　 紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是在世界范围内栽培历史最悠久、面积最广泛的豆科牧草，堪称“牧草之王”［１］。
紫花苜蓿具有产草量高、富含蛋白质、生物固氮能力强和适应性广的特性，对我国畜牧业的发展、食品安全等具有
重大作用。但随着人类活动的增加，全球气温逐年上升，高温热害变得非常突出，严重抑制植物特别是紫花苜蓿
的生长发育，影响到紫花苜蓿的产量和品质［２，３］。高温能使紫花苜蓿植株生长缓慢、枯萎甚至死亡，病虫害增多，
产量和品质下降，是限制其推广利用的重要环境因子之一。目前高温对紫花苜蓿的研究方面主要集中在高温对
紫花苜蓿生产性能的影响、紫花苜蓿适应高温胁迫的机制及其耐热性评价指标的选择和可靠性评价的方法等方
面［４７］，而针对在分子水平寻找紫花苜蓿耐热基因的研究还未有报道。
耐热性是目前抗性研究中的一个重要方面，但耐热性是一个非常复杂的性状，长期以来人们对紫花苜蓿耐热
性的了解主要来自于生理学的研究，如有机溶质的积累和热诱导蛋白的产生等［８１０］。随着分子生物技术的发展，
人们对耐热性的了解逐渐深入到分子水平。由于植物的高温胁迫反应是一个多基因参与的系统调控过程，尽管
传统的研究方法已取得一些成果，但是要想从根本上阐明高温胁迫机制尚有很大差距。这就需要在全基因组水
平上对其进行整合性研究。随着生物技术、基因组学和生物信息学的发展，目前已出现了一系列大规模分离差异
表达基因的方法。
抑制性消减杂交技术（ＳＳＨ）是由Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ等［１１］于１９９６年以ｍＲＮＡ差异显示技术为基础建立起来的筛
选未知差异基因的新技术。采用该技术在较短时间内即可获得差异表达基因的ｃＤＮＡ片段，可使低丰度的ｍＲ
ＮＡ得以高于１０００倍以上的富集，从而使某些低丰度表达的 ｍＲＮＡ有望被检出［１２］。近年来ＳＳＨ技术在植物
抗逆性研究上展现了良好的应用前景。刘春燕等［１３］构建了大豆花叶病毒胁迫诱导的消减文库并对其进行了初
步分析，研究了花叶病毒胁迫下大豆基因的表达调控。夏卓盛等［１４］以铝离子胁迫的紫花苜蓿幼根为材料，构建
了紫花苜蓿铝胁迫的抑制消减文库，研究了铝胁迫下的基因差异表达。Ｊｉｎ等［１５］以盐胁迫的紫花苜蓿１０日龄幼
苗为材料，构建了紫花苜蓿盐胁迫的抑制消减杂交文库，对文库及其部分耐盐基因进行了分析。而ＳＳＨ文库在
紫花苜蓿抗热性研究方面的报道很少。
本研究以秋眠６级的紫花苜蓿ＡＢＩ７００为材料，采用抑制性消减杂交技术构建了高温胁迫下紫花苜蓿幼嫩
茎叶的正向抑制消减ｃＤＮＡ文库，旨在为紫花苜蓿耐热机制研究和耐热相关基因的克隆提供理论依据。
１２６－１３２
２０１１年１０月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２０卷　第５期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５
 收稿日期：２０１１０１０６；改回日期：２０１１０４１４
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（ＣＡＲＳ３５）和国家‘十二五’科技支撑计划项目（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０４）资助。
作者简介：韩明鹏（１９８６），男，河南南阳人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｍｉｎｇｐｅｎｇ９９９＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｃｈｅｎｇｚｈａｎｇ＠２６３．ｎｅｔ
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　植物材料　本试验以秋眠６级的紫花苜蓿（ＡＢＩ７００）为材料，产地为美国，以４５℃高温处理过的幼嫩茎
叶为处理组（ｔｅｓｔｅｒ），以同一植株正常条件（２２℃）下生长的幼嫩茎叶为对照组（ｄｒｉｖｅｒ）。整个试验于２０１０年５月
－２０１０年１０月在中国农业科学院棉花研究所（安阳）重点实验室进行。
１．１．２　菌株及载体　大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）菌株ＤＨ５α电转化感受态细胞（犈．犮狅犾犻ＥｌｅｃｔｒｏＣｅｌＤＨ５α）、
ｐＭＤ１８ＴＶｅｃｔｏｒ［（抗性标记为氨苄青霉素（Ａｍｐ）］，购自ＴａＫａＲａ公司。
１．１．３　试剂和酶　总ＲＮＡ提取试剂盒ＲＮＡｉＳｏＰｌｕｓ、ｍＲＮＡ纯化试剂盒ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ
ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ、ＤＮＡ片段纯化试剂盒ＴａＫａＲａＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０、ＴａｑＤＮＡ聚合酶均
购自ＴａＫａＲａ公司；抑制消减杂交试剂盒ＰＣＲＳｅｌｅｃｔＴＭｃＤＮＡＳｕｂｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ和聚合酶ＡｄｖａｎｔａｇｅｃＤＮＡＰｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅＭｉｘ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；其他生化试剂为国产分析纯。
１．２　方法
１．２．１　总ＲＮＡ的提取和ｍＲＮＡ的分离纯化　紫花苜蓿幼嫩茎叶总ＲＮＡ的提取采用宝生物公司（ＴａＫａＲａ）的
ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ试剂，经紫外分光光度计测定后，置于－７０℃冰箱保存。ｍＲＮＡ 的分离纯化使用宝生物公司
（ＴａＫａＲａ）的ｍＲＮＡ纯化试剂盒 ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ，按照试剂盒说明书纯化
ｍＲＮＡ，并用紫外分光光度计检测其浓度，立即进行下一步实验。
１．２．２　抑制消减杂交（ＳＳＨ）　具体实验步骤按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司（美国）的ＰＣＲＳｅｌｅｃｔＴＭｃＤＮＡＳｕｂｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ
的方法进行。以４５℃高温胁迫下的紫花苜蓿幼嫩茎叶为试验方（ｔｅｓｔｅｒ），以正常条件下（２２℃）生长的紫花苜蓿
幼嫩茎叶为驱动方（ｄｒｉｖｅｒ），把从总ＲＮＡ中分离纯化的ｔｅｓｔｅｒ和ｄｒｉｖｅｒ组的 ｍＲＮＡ分别逆转录成双链ｃＤＮＡ，
然后用四碱基序列的限制性内切酶ＲｓａＩ将其充分酶切。酶切产物用常规的酚、氯仿和异戊醇纯化。将酶切过
的ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ平均分成２份，在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下分别与接头１和２Ｒ连接，１６℃连接过夜，制成ｔｅｓｔｅｒ
１ｃＤＮＡ和ｔｅｓｔｅｒ２ＲｃＤＮＡ，并进行接头连接效率的分析。对已经加上接头１和２Ｒ的ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ分别与过量
的未加接头的ｄｒｉｖｅｒｃＤＮＡ进行第１次消减杂交，杂交条件为９８℃１．５ｍｉｎ，６８℃８ｈ。之后，再加入新鲜变性的
ｄｒｉｖｅｒｃＤＮＡ于第１次杂交的２组产物中，６８℃杂交过夜，结束后加入２００μＬ无菌水进行稀释，混匀，６８℃温浴７
ｍｉｎ。杂交稀释后，根据接头１和２Ｒ外侧序列设计的ＰＣＲ（聚合酶链式反应）引物１对消减杂交产物进行第１次
ＰＣＲ扩增；第１次ＰＣＲ扩增产物用无菌水稀释１０倍，再用巢式ＰＣＲ引物Ｎｅｓｔｅｄｐｒｉｍｅｒ１和Ｎｅｓｔｅｄｐｒｉｍｅｒ２Ｒ
进行第２次ＰＣＲ扩增。具体接头和引物序列见产品使用说明书。
１．２．３　ｃＤＮＡ消减文库的构建　第２次ＰＣＲ产物经ＴａＫａＲａＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０纯化后，
取４μＬ与ｐＭＤ１８ＴＶｅｃｔｏｒ克隆载体连接，１６℃连接过夜，经乙醇沉淀后，取２μＬ加入电转化感受态细胞
（犈．犮狅犾犻ＥｌｅｃｔｒｏＣｅｌＤＨ５α）中，混合液注入于冰水中预冷的０．１ｃｍ电击杯（ＢｉｏＲａｄ）中。１．５ｋＶ电压、２００Ω
电阻冲击后，向电击杯中迅速加入１ｍＬ预冷的ＬＢ培养基。将菌液置于离心管中３７℃振荡培养１ｈ（１８０
ｒ／ｍｉｎ）。取１００μＬ涂于含有氨苄青霉素的ＬＢ／Ｘｇａｌ／ＩＰＴＧ的固体平板上，３７℃培养过夜，放入４℃冰箱１ｈ充
分显色。培养皿上可见蓝白分明的菌落。剩余培养液加入甘油，液氮速冻后，－７０℃保存。
１．２．４　ＰＣＲ鉴定重组子　随机挑取１２０个白色单菌落，接种于含１ｍＬＬＢ液体培养基（含氨苄青霉素）的离心
管中，３７℃轻摇６～８ｈ。直接取１μＬ菌液作为ＰＣＲ模板，以Ｎｅｓｔｅｄｐｒｉｍｅｒ１和Ｎｅｓｔｅｄｐｒｉｍｅｒ２Ｒ作为引物，
ＰＣＲ扩增插入片段。１０μＬ的反应体系：模板１μＬ、Ｎｅｓｔｅｄｐｒｉｍｅｒ１（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．８μＬ、Ｎｅｓｔｅｄｐｒｉｍｅｒ２Ｒ（１０
μｍｏｌ／Ｌ）０．８μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌｅａｃｈ）０．８μＬ、１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ１μＬ、Ｔａｑ酶０．３μＬ，补无菌水至总体积为
１０μＬ。反应程序：９４℃１０ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６６℃３０ｓ，７２℃９０ｓ，３０个循环；７２℃５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电
泳检测。将单克隆菌液加入无菌甘油至终浓度１５％，用液氮速冻后，置于－７０℃冰箱长期保存。
２　结果与分析
２．１　总ＲＮＡ的提取和ｍＲＮＡ的分离纯化
总ＲＮＡ经１％琼脂糖凝胶电泳检测，其２８Ｓ和１８ＳＲＮＡ带型清晰可见，且比例适当（图１）。紫外分光光度
７２１第２０卷第５期 草业学报２０１１年
计检测其ＯＤ２６０／２８０在１．９～２．０，表明总ＲＮＡ质量好，
图１　紫花苜蓿幼嫩茎叶总犚犖犃及犿犚犖犃
犉犻犵．１　犜狅狋犪犾犚犖犃犪狀犱犿犚犖犃犳狉狅犿狋犲狀犱犲狉
狊狋犲犿狊犪狀犱犾犲犪狏犲狊狅犳犪犾犳犪犾犳犪
　　　Ｍ：ＤＮＡ分子量标记ＤＬ２０００；１：驱动方总ＲＮＡ；２：试验方总ＲＮＡ；
３：驱动方 ｍＲＮＡ；４：试验方 ｍＲＮＡ。Ｍ：ＤＮＡＤＬ２０００；１：ｄｒｉｖｅｒｔｏｔａｌ
ＲＮＡ；２：ｔｅｓｔｅｒｔｏｔａｌＲＮＡ；３：ｄｒｉｖｅｒｍＲＮＡ；４：ｔｅｓｔｅｒｍＲＮＡ．
图２　紫花苜蓿反转录犮犇犖犃犚狊犪犐未酶切与酶切
犉犻犵．２　犚犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀犮犇犖犃狅犳犪犾犳犪犾犳犪犪犳狋犲狉
犚狊犪犐犱犻犵犲狊狋犻狅狀犪狀犱狀狅狋犚狊犪犐犱犻犵犲狊狋犻狅狀
　　　Ｍ：ＤＮＡ分子量标记 ＤＬ２０００；１，３，５：未经过 ＲｓａＩ酶切的驱动方
ｃＤＮＡ、试验方ｃＤＮＡ、对照ＲＮＡｃＤＮＡ；２，４，６：经过酶切的驱动方ｃＤ
ＮＡ、试验方ｃＤＮＡ、对照ＲＮＡｃＤＮＡ。Ｍ：ＤＮＡｌａｄｄｅｒＤＬ２０００；１，３，５：
ｄｒｉｖｅｒｃＤＮＡ，ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡａｎｄｃｏｎｔｒｏｌＲＮＡｃＤＮＡａｆｔｅｒｎｏｔＲｓａＩｄｉ
ｇｅｓｔｉｏｎ；２，４，６：ｄｒｉｖｅｒｃＤＮＡ，ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡａｎｄｃｏｎｔｒｏｌＲＮＡｃＤＮＡａｆ
ｔｅｒＲｓａＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．
纯度高，满足文库构建的要求。总ＲＮＡ经纯化试剂
盒纯化后，经１％琼脂糖凝胶电泳检测，可见其带型呈
弥散状（图１），紫外分光光度计检测其ＯＤ２６０／２８０≈２．０，
表明纯化后的ｍＲＮＡ质量好，纯度高，满足文库构建
的要求。
２．２　ｃＤＮＡ合成以及ｃＤＮＡ酶切效果分析
ｍＲＮＡ反转录为双链ｃＤＮＡ后用限制性四碱基
内切酶ＲｓａＩ酶切，经１％的琼脂糖凝胶电泳分析反转
录及酶切效果。结果表明（图２），反转录后的双链
ｃＤＮＡ片段大部分集中在１０００～３０００ｂｐ，符合实验
的要求。酶切后的片段明显较未经酶切片段减小，说
明酶切比较完全，可以用于下一步实验。
２．３　接头连接效率检测
ｄｓｃＤＮＡ与接头连接效率的高低是决定抑制性消
减杂交成败非常关键的一步。利用紫花苜蓿管家基因
Ａｃｔｉｎ的３′端（ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＧＴＣＡＴＡＣＴＧＧＴ）和５′
端（ＴＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＧＣＴＴＣＧＴ）特异引物（产物
８３ｂｐ）以及试剂盒所带的３′端特异引物与ＰＣＲＰｒｉｍ
ｅｒ１（产物）对２组分别连接有 Ａｄａｐｔｏｒ１（接头１）和
Ａｄａｐｔｏｒ２Ｒ（接头２Ｒ）的ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩
增，产物用２．０％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示（图
３），管家基因的３′端特异引物与接头的外侧引物
Ｐｒｉｍｅｒ１组合的扩增片段（连接接头的ＰＣＲ产物）大
于管家基因３′端、５′端特异引物组合的扩增片段，与预
期结果一致，灰度分析表明２组ｄｓｃＤＮＡ接头连接效
率均在５０％以上，接头已经成功的连接。
２．３　消减杂交效率的检测
以蒺藜状苜蓿的管家基因αｔｕｂｕｌｉｎ为依据，设计
引物进行消减杂交效率的检测。引物序列为：３′（ＣＡ
ＣＡＴＴＧＣＡＡＧＣＣＧＧＴＡＴＧＴ）和 ５′（ＡＣＣＧＧＴＣＴ
ＣＡＣＴＧＡＡＧＡＡＳＧ）。同时，以未经抑制性消减杂交
的ｃＤＮＡＴｌｃ（在制备ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ连接２种接头时，
将刚加好样还没有进行连接反应的连接有Ａｄａｐｔｏｒ１
和Ａｄａｐｔｏｒ２Ｒ的ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ各取２μＬ混合，然后
进行连接反应即可）作为对照进行ＰＣＲ。ＰＣＲ反应条
件为：９４℃预变性２ｍｉｎ，然后９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ扩增，并分别在第１８，２３，２８和３３循环处各取５
μＬ进行电泳，检测消减杂交效率。结果如图４所示，未消减产物中看家基因１４７ｂｐ片段在第２８循环时出现，而
消减产物中看家基因１４７ｂｐ片段未出现。由此可见，消减产物中看家基因表达丰度已大大下降，消减杂交已有
效完成。
２．４　消减ＰＣＲ结果
第１次和第２次ＰＣＲ扩增结束后，分别取ｔｅｓｔｅｒ消减、ｔｅｓｔｅｒ未消减、对照ＲＮＡ消减、对照ＲＮＡ未消减、
８２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５
ＰＣＲ阳性对照产物６μＬ并排进行电泳检测。消减杂
图３　接头连接效率检测
犉犻犵．３　犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犾犻犵犪狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔狅犳犪犱犪狆狅狉
　　　Ｍ：ＤＮＡ分子量标记ＤＬ２０００；１，２：以ｔｅｓｔｅｒ１１（与接头１连接）作模
板ＰＣＲ的产物；３，４：以ｔｅｓｔｅｒ１２（与接头２Ｒ连接）作模板ＰＣＲ的产
物；１，３：以ＰＣＲ引物１和看家基因３′引物；２，４：以看家基因３′和５′
引物ＰＣＲ的产物。Ｍ：ＤＮＡｌａｄｄｅｒＤＬ２０００；１，２：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｕｓｉｎｇ
ｔｅｓｔｅｒ１１（Ａｄａｐｔｏｒ１ｌｉｇａｔｅｄ）ａｓｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅ；３，４：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｕｓｉｎｇ
ｔｅｓｔｅｒ１２（Ａｄａｐｔｏｒ２Ｒｌｉｇａｔｅｄ）ａｓｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅ；１，３：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｕ
ｓｉｎｇｈｏｕｓｅｋｅｅｐｅｒｇｅｎｅ３′ｐｒｉｍｅｒａｎｄＰＣＲｐｒｉｍｅｒ１；２，４：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｕｓｉｎｇｈｏｕｓｅｋｅｅｐｅｒ３′ａｎｄ５′ｐｒｉｍｅｒｓ．
图４　消减杂交效率检测
犉犻犵．４　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狊狌犫狋狉犪犮狋犻狅狀犲犳犳犻犮犻犲狀犮狔
　　　Ｍ：ＤＮＡ分子量标记ＤＬ２０００；１～８：αｔｕｂｕｌｉｎ的ＰＣＲ扩增产物，其
中１～４为消减ｃＤＮＡ的扩增产物，５～８为未消减ｃＤＮＡ的扩增产物；
１，５：１８个循环；２，６：２３个循环；３，７：２８个循环；４，８：３３个循环。Ｍ：
ＤＮＡｌａｄｄｅｒＤＬ２０００；１～８：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆαｔｕｂｕｌｉｎ，ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄｃＤ
ＮＡ（１～４），ｕｎｓｕｂｔｒａｃｔｅｄｃＤＮＡ（５～８）；１，５：１８ｃｙｃｌｅｓ；２，６：２３ｃｙｃｌｅｓ；
３，７：２８ｃｙｃｌｅｓ；４，８：３３ｃｙｃｌｅｓ．
交第１次ＰＣＲ结果（图５）显示，第１次ＰＣＲ扩增的电
泳带较弱，经抑制消减杂交后扩增出的ｃＤＮＡ片段大
小介于２５０～１０００ｂｐ，而未经抑制消减杂交处理扩增
出的ｃＤＮＡ片段大小介于１００～２０００ｂｐ，并且经过消
减杂交后扩增出的ＰＣＲ产物亮度明显弱于未经过消
减杂交的ＰＣＲ产物，这也说明消减杂交有效的完成。
消减杂交第２次ＰＣＲ结果（图６）显示，经过２轮消减
杂交和２轮ＰＣＲ后，消减杂交后扩增出的ＰＣＲ产物
亮度和未经过消减杂交的ＰＣＲ产物相当，ｔｅｓｔｅｒ中的
差异表达基因得到有效地富集和扩增，这也说明消减
杂交是成功的。
２．５　消减文库中插入片段的ＰＣＲ鉴定
经过２次选择性ＰＣＲ富集的消减产物第２次
ＰＣＲ 产物纯化后与 ｐＭＤ１８Ｔ 进行连接，转化到
ＤＨ５α电转化感受态细胞（犈．犮狅犾犻ＥｌｅｃｔｒｏＣｅｌ）中培
养扩增，得到消减文库。对阳性克隆进行菌液ＰＣＲ鉴
定插入片段，引物采用第２次ＰＣＲ时的巢式引物１和
２Ｒ。ＰＣＲ产物经２％琼脂糖凝胶电泳检测（图７）显
示，文库克隆的重组率为９９％，片段大小集中分布于
２５０～７５０ｂｐ。
２．６　ｃＤＮＡ文库的滴度和重组率测定
从ｃＤＮＡ文库中取５０μＬ，涂于含ＩＰＴＧ和Ｘｇａｌ
的平板上，培养过夜后，计算菌斑个数，按下式计算
ｃＤＮＡ文库的滴度。分别计数蓝斑和白斑的个数，计
算重组率。结果表明，文库滴度为４２３０ｐｆｕ／ｍＬ；重
组率为９７．８％。
２．７　ＢｌａｓｔＸ分析及功能的预测
随机挑取１２０个白色菌落进行ＰＣＲ鉴定，其中的
阳性克隆送至北京华大基因公司进行测序。将测得的
序列去除引物、接头和载体序列，提交到 ＮＣＢＩ（ｈｔ
ｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）进行序列比
对，部分比对结果如表１。
３　讨论
Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ等［１１］于１９９６年建立了一种应用ＰＣＲ
方法的抑制消减杂交技术。抑制消减杂交技术利用了
消减杂交技术、限制性内切酶与抑制性ＰＣＲ相结合的
方法，经过２次杂交和２次ＰＣＲ，以富集和获得目标
片段，具有以下优点：１）假阳性率被大大降低，可获得较多的特异性表达产物，阳性率达９４％［１６］；２）具有高敏感
性，均等化富集目标片段，避免了表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）分析中高丰度基因重复测序的缺
点，使得低丰度ｍＲＮＡ也能被检测到［１７］。因此ＳＳＨ技术被广泛应用于植物差异表达基因的分离［１８２１］。
９２１第２０卷第５期 草业学报２０１１年
图５　消减产物第１次犘犆犚
犉犻犵．５　犜犺犲犳犻狉狊狋犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳狊狌犫狋狉犪犮狋犲犱
图６　消减产物第２次犘犆犚
犉犻犵．６　犜犺犲狊犲犮狅狀犱犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳狊狌犫狋狉犪犮狋犲犱
　Ｍ：ＤＮＡ分子量标记ＤＬ２０００；１：消减杂交ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物；２：未消减杂交ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物；３：对照消减杂交ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物；４：对照未
消减杂交ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物；５：阳性对照。Ｍ：ＤＮＡｌａｄｄｅｒＤＬ２０００；１：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｓｕｂｔｒａｃｔｅｄｃＤＮＡ；２：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｕｎｓｕｂｔｒａｃｔｅｄｃＤＮＡ；
３：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｃｏｎｔｒｏｌｓｕｂｔｒａｃｔｅｄｃＤＮＡ；４：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｃｏｎｔｒｏｌｕｎｓｕｂｔｒａｃｔｅｄｃＤＮＡ；５：ＰＣＲｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．
图７　犘犆犚检测消减犮犇犖犃文库克隆插入片段
犉犻犵．７　犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犻狀狊犲狉狋犲犱犮犇犖犃犳狉犪犵犿犲狀狋狊犻狀狊狌犫狋狉犪犮狋犻狏犲犮犇犖犃犾犻犫狉犪狉狔犫狔犘犆犚
　Ｍ：ＤＮＡ分子量标记ＤＬ２０００；１～２９：消减ｃＤＮＡ文库中随机挑选的２９个阳性克隆菌液ＰＣＲ检测插入片段大小。Ｍ：ＤＮＡｌａｄｄｅｒＤＬ２０００；１～
２９：ｔｈｅ２９ｒａｎｄｏｍｌｙｐｉｃｋｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｆｒｏｍｔｈｅｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ．
表１　犛犛犎犮犇犖犃文库的犅犾犪狊狋犡分析及其功能蛋白的预测
犜犪犫犾犲１　犅犾犪狊狋犡犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犛犛犎犮犇犖犃犾犻犫狉犪狉狔犪狀犱狋犺犲狆狉犲犱犻犮狋犻狅狀狅犳犳狌狀犮狋犻狅狀犪犾狆狉狅狋犲犻狀狊
克隆编号
Ｃｌｏｎｅ
Ｎｏ．
长度
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
同源基因功能注释
Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｎｏｔａｔｉｏｎ
Ｅ值
Ｅｖａｌｕｅｓ
同源性
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ
同源物种
Ｉｄｅｎｔｉｔｙｓｐｅｃｉｅｓ
ＭＰ１３８ １７０ 叶绿素ａ／ｂ结合蛋白ＣＰ２４前体Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌａ／ｂｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＣＰ２４ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ１ｅ７９ １６８／１７０ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ９４ １６７ ＭＡＤＳｂｏｘ转录因子ＳｒＭＡＤＳ１ＭＡＤＳｂｏｘｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＳｒＭＡＤＳ１ ５ｅ５４ １３１／１３７ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ９ １７４ ＤｅａｄｂｏｘＲＮＡ解旋酶 ＤｅａｄｂｏｘＡＴＰｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｈｅｌｉｃａｓｅ ２ｅ５９ １４２／１４９ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ７０ ３５６ 叶绿体小热激蛋白Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓｍａｌｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ ３ｅ１１９ ２６２／２７４ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ６２ １６３ 叶绿体脱镁叶绿酸加氧酶Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅａｏｘｙｇｅｎａｓｅ ５ｅ４４ １０２／１０３ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ１２５ ４２２ 假定反转录转座子蛋白 Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ｐｕｔａｔｉｖｅ ４ｅ７９ １７６／１８２ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ３５ ３５８ 核酸结合蛋白 Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ １ｅ１７８ ３５３／３５８ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ１９ ２２０ 热激蛋白７０Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ７０ ７ｅ９９ ２１３／２２０ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ６ ４１１ 叶绿体小热激蛋白Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓｍａｌｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ ０．０ ３９３／４１２ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ８ ２８９ 热激蛋白２６Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ２６ ２ｅ５１ １１６／１１７ 蒺藜苜蓿犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
ＭＰ１０６ ４７３ 热激蛋白１８．１Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ１８．１ ０．０ ３９８／４０２ 紫花苜蓿犕．狊犪狋犻狏犪
０３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５
　　本研究首次建立了紫花苜蓿高温胁迫下差异表达基因的抑制消减ｃＤＮＡ文库，对ＳＳＨ文库的各个关键步
骤如：总ＲＮＡ及ｍＲＮＡ质量、ＲａｓＩ的酶切效果、接头的连接效率、消减效率和转化效率等的检测显示，消减文
库有较高的质量。构建一个好的差异表达ｃＤＮＡ文库对起始ｍＲＮＡ的完整性和纯度要求非常高。本试验的结
果表明，试验获得的总ＲＮＡ含量高，完整性好，紫外分光光度计检测其ＯＤ２６０／２８０在１．９～２．０。ｍＲＮＡ的完整度
和纯度也达到了文库构建的要求，紫外分光光度计检测其ＯＤ２６０／２８０≈２．０。本试验抑制消减杂交试验中，从反转
录合成ｃＤＮＡ及ＲａｓＩ酶切的检测、加接头后的接头连接效率到消减ｃＤＮＡ片段的消减效率分析，都随时监控着
各个试验环节，保证最终获得高质量的差异表达ｃＤＮＡ文库。利用Ｔ／Ａ克隆技术，将特异性扩增的ＰＣＲ产物直
接与Ｔ载体进行连接，文库的构建采用ＤＨ５α电转化感受态细胞，大大提高了文库的转化效率。扩增文库后，经
过初步蓝白班筛选１２０个阳性克隆，菌落ＰＣＲ扩增电泳图谱检测，文库滴度为４２３０ｐｆｕ／ｍＬ，文库克隆的重组率
为９７．８％，片段长度集中分布于２５０～７５０ｂｐ。这些结果直接说明获得了高质量的正向差异表达ｃＤＮＡ文库。
综上所述，利用ＳＳＨ技术构建紫花苜蓿高温胁迫差异表达基因文库，通过ＥＳＴ技术研究抗热过程差异表达
的抗热相关基因的表达情况，从总体上阐述紫花苜蓿抗热机制已成为可行的研究方法。抗热基因的研究不仅仅
是抗热过程的识别和抗热基因的开启，更是注重抗热过程中系列基因的表达以及抗病信号的传递和级联反应，这
将更加有助于对抗热机制的深入研究。
参考文献：
［１］　王鑫，李永强，李娟．紫花苜蓿营养成分及主要生物学特性［Ｊ］．草业科学，２００３，２０（１０）：３９４１．
［２］　邓振镛，张强，徐金芳，等．高温热浪与干热风的危害特征比较研究［Ｊ］．地球科学进展，２００９，２４（８）：８６５８７３．
［３］　胡跃高，储国良，戚志强，等．苏南丘陵山地紫花苜蓿生产适应性分析［Ａ］．中国国际草业发展大会暨中国草原学会第六届
代表大会论文集［Ｃ］．北京：中国草学会，２００２：５１５４．
［４］　韩明鹏，高永革，王成章，等．高温胁迫对紫花苜蓿的影响及其适应机制的相关研究［Ｊ］．基因组学与应用生物学，２０１０，
２９（３）：５６３５６９．
［５］　张鹤山，刘洋，田宏，等．１９个紫花苜蓿品种的耐热性研究［Ｊ］．中国草地学报，２００８，３０（６）：１６２１．
［６］　张晓霞，高永革，严学兵，等．紫花苜蓿抗热性鉴定与评价的研究进展［Ｊ］．草业科学，２０１０，２７（２）：１１３１１８．
［７］　杨红善，常根柱，周学辉，等．美国引进苜蓿品种半湿润区栽培试验［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（１）：１２１１２７．
［８］　莫亿伟，郭振飞．温度胁迫对苜蓿和柱花草光合作用及Ｎ还原的影响［Ｊ］．草地学报，２００８，１６（１）：１００１０２．
［９］　ＧａｏＨＢ，ＢｒａｎｄｉｚｚｉＦ，ＢｅｎｎｉｎｇＣ，犲狋犪犾．Ａｍｅｍｂｒａｎｅｔｅｔｈｅｒｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｄｅｆｉｎｅｓａｂｒａｎｃｈｏｆｔｈｅｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００８，１０５（４２）：１６３９８１６４０３．
［１０］　邹亚丽，韩方虎．耿丽英，等．温度和湿度对紫花苜蓿土壤氮矿化的影响［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（４）：１０１１０７．
［１１］　ＤｉａｔｃｈｅｎｋｏＬ，ＬａｎＹＦ，ＣａｍｐｂｅｌＡＰ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｒｅｇｕｌａ
ｔｅｄｏｒｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｃＤＮＡｐｒｏｂｅｓａｎｄｌｉｂｒａｒｉｅｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９９６，９３：６０２５６０３０．
［１２］　ＧｕｒｓｋａｙａＮＧ，ＤｉａｔｃｈｅｎｋｏＬ，ＣｈｅｎｃｈｉｋＡ，犲狋犪犾．ＥｑｕａｌｉｚｉｎｇｃＤＮＡｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ｃｌｏｎｉｎｇｏｆＪｕｒｋａｔｃｅｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎａｎｄｐｈｏｒｂｏｌ１２ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３ａｃｅｔａｔｅ［Ｊ］．Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，２４０：９０９７．
［１３］　刘春燕，王伟权，陈庆山，等．大豆花叶病毒胁迫诱导的消减文库构建及初步分析［Ｊ］．生物工程学报，２００５，２１（２）：３２０
３２２．
［１４］　夏卓盛，吴跃明，李新伟，等．紫花苜蓿铝胁迫抑制消减文库的构建和初步分析［Ｊ］．农业生物技术学报，２００７，１５（５）：
８０５８０９．
［１５］　ＪｉｎＨＣ，ＳｕｎＹ，ＹａｎｇＱＣ，犲狋犪犾．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｇｅｎｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｆｒｏｍａｌｆａｌｆａ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓ，
２０１０，３７：７４５７５３．
［１６］　ＶｏｎＳｔｅｉｎＯＤ，ＴｈｉｅｓＷＧ，ＨｏｆｍａｎｎＭ．Ａｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｒａｒｅｌｙｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ
［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（１３）：２５９８２６０２．
［１７］　徐碧玉，苏伟，金志强．香蕉果实采后抑制差减文库的构建与鉴定［Ｊ］．分子植物育种，２００５，３（４）：４９０５０２．
［１８］　沈国顺，刘丽霞．抑制性差减杂交技术（ＳＳＨ）及其研究应用进展［Ｊ］．中国兽医学报，２００４，２４（５）：５１１５１４．
［１９］　张建文，王跃进，朱自果，等．中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析［Ｊ］．中国农业科学，２００９，４２（３）：
９６０９６６．
１３１第２０卷第５期 草业学报２０１１年
［２０］　蔡勤安，王玉成，董玉芝，等．干旱胁迫下白花柽柳抑制性消减文库的构建与分析［Ｊ］．农业生物技术学报，２００７，１５（２）：
３５４３５５．
［２１］　王新超，杨亚军，陈亮茶，等．茶树休眠芽与萌动芽抑制消减杂交文库的构建与初步分析［Ｊ］．茶叶科学，２０１０，３０（２）：
１２９１３５．
犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犾狔犲狓狆狉犲狊狊犲犱犮犇犖犃犾犻犫狉犪狉狔狅犳犪犾犳犪犾犳犪犫狔狌狊犻狀犵狊狌狆狆狉犲狊狊犻狅狀
狊狌犫狋狉犪犮狋犻狏犲犺狔犫狉犻犱犻狕犪狋犻狅狀狌狀犱犲狉狋犺犲犺犻犵犺狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲
ＨＡＮＭｉｎｇｐｅｎｇ１，ＷＡＮＧＹａｎｈｕａ２，ＧＡＯＹｏｎｇｇｅ２，ＺＨＡＮＧＸｉａｏｘｉａ２，
ＳＵＦａｎｇｒｕｉ３，ＸＵＨｏｎｇ１，ＷＡＮＧＣｈｅｎｇｚｈａｎｇ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ
４５０００２，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＦｏｒａｇｅａｎｄＦｅｅｄＳｔａｔｉｏｎｏｆＨｅｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００８，Ｃｈｉｎａ；
３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＭａｎａｇｅｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｉｓｏｌａｔｅｔｈｅｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｄＥＳＴｓｆｒｏｍａｌｆａｌｆａ，ｗｅｔｏｏｋｔｈｅａｌｆａｌｆａｖａｒｉｅｔｙ
‘ＡＢＩ７００’ａｓｍａｔｅｒｉａｌｗｈｏｓｅｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙｌｅｖｅｌｗａｓ６，ａｎｄｔａｋｉｎｇｔｈｅｃＤＮＡｆｒｏｍａｌｆａｌｆａｔｅｎｄｅｒｓｔｅｍｓａｎｄ
ｌｅａｖｅｓｕｎｄｅｒ４５℃ａｓｔｅｓｔｅｒ，ｗｈｉｌｅｔａｋｉｎｇｔｈｅｉｒｃＤＮＡｕｎｄｅｒ２２℃ （ｎｏｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ）ａｓｄｒｉｖｅｒ．Ｔｈｅｆｏｒｗａｒｄｓｕｐ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｌｉｂｒａｒｙｏｆａｌｆａｌｆａｕｎｄｅｒｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂ
ｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｈｏｏｓｉｎｇ１２０ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｓｔｏｃｈａｓｔｉｃａｌｙｆｒｏｍｔｈｅｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｌｉｂｒａｒｙｔｏｔａｋｅｂａｃｔｅｒｉａｌ
ＰＣＲ，ｉｔｄｉｓｐｌａｙｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｌｉｂｒａｒｙｃｌｏｎｅｓｗａｓ９７．８％．Ｔｈｅｓｉｚｅｏｆｉｎｓｅｒｔｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｍａｉｎ
ｌｙｂｅｔｗｅｅｎ３００－７５０ｂｐ．Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｈｅａｌｆａｌｆａｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈａｓｌａｉｄａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅ
ｃｌｏｎｉｎｇｏｆｈｅａｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｕｎｄｅｒｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）；ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ
２３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５