全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（２）：２２１ ２２６
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０２０２２１０６
利用 ＰＭＩ选择标记进行杨树转基因体系的研究
查 琳１，２，王伟东１，续 晨３，诸葛强１
（１．南京林业大学南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 ２１００３７；２．无锡市林木种苗管理站，江苏 无锡 ２１４０００；
３．南京晓庄学院生命科学系，江苏 南京 ２１００００）
收稿日期：２０１４１２１５
基金项目：国家科技部“８６３计划”课题（２０１３ＡＡ１０２７０３）、国家国际科技合作专项 （２０１４ＤＦＧ３２４４０）、江苏高校优势学科建设工程项目
（ＰＡＰＤ）
作者简介：查 琳，硕士研究生，工程师。主要研究方向：分子植物育种。Ｅｍａｉｌ：２８６５５５３３７＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者：诸葛强，博士生导师，教授。主要研究方向：分子植物育种。电话：０２５８５４２８７０１Ｅｍａｉｌ：ｑｚｈｕｇｅ＠ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
摘要：［目的］利用不同于抗生素的ＰＭＩ为选择标记基因的遗传转化体系，对杨树进行双抗虫基因（Ｂｔ和ＣｐＴＩ）的转
基因研究。建立杨树以 ＰＭＩ为安全标记基因的转基因体系，为安全、高效的林木转基因育种研究提供实验依据。
［方法］选择已有的转ＣｐＴＩ抗虫基因（利用Ｋｍｒ选择标记获得）的美洲黑杨杂种优良无性系南林８９５杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ×
ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ‘Ｎａｎｌｉｎ８９５’）为受体材料，对杨树叶片、叶片分化芽、茎段生根的甘露糖敏感性等筛选优化，采用农杆
菌介导的方法进行双抗虫基因的研究。［结果］较为适合的杨树叶片筛选培养基为：甘露糖８ｇ·Ｌ－１和蔗糖２２ｇ·
Ｌ－１；叶片分化芽筛选培养基为：甘露糖１０ｇ·Ｌ－１和蔗糖２０ｇ·Ｌ－１；茎段生根筛选培养基：甘露糖８ｇ·Ｌ－１和蔗糖
２２ｇ·Ｌ－１。在此基础上，获得了转Ｂｔ和ＣｐＴＩ双抗虫基因的植株８株。［结论］初步建立了以ＰＭＩ为安全标记基因
的杨树转基因体系：确定了ＰＭＩ筛选的最适选择压，成功构建了含ＰＭＩ选择标记基因的植物抗虫表达载体，通过农
杆菌介导的遗传转化最终获得了转双抗虫基因植株。
关键词：ＰＭＩ；选择标记；南林８９５杨；转基因体系；抗虫
中图分类号：Ｓ７９２．１１９ 文献标识码：Ａ
ＰｏｐｌａｒＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＳｙｓｔｅｍｂｙＵｓｉｎｇＰＭＩａｓＢｉｏｓａｆｅｔｙＳｅｌｅｃｔｉｖｅＭａｒｋｅｒ
ＺＨＡＬｉｎ１，２，ＷＡＮＧＷｅｉ－ｄｏｎｇ１，ＸＵＣｈｅｎ３，ＺＨＵＧＥＱｉａｎｇ１
（１．Ｃｏ－ＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＳｕｓｔａｉｎａｂｌｅＦｏｒｅｓｔｒｙｉｎＳｏｕｔｈｅｒｎＣｈｉｎａ，ＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；
２．ＷｕｘｉＦｏｒｅｓｔＳｅｅｄａｎｄＳｅｅｄｌｉｎｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｗｕｘｉ ２１４０００，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；
３．ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮａｎｊｉｎｇ，ＸｉａｏｚｈｕａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００００，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＵｓｉｎｇｔｈｅＰＭＩｄｉｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｍａｒｋｅｒｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｔｏｓｔｕｄｙｐｏｐｌａｒ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｔｗｏｉｎｓｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓ（ＢｔａｎｄＣｐＴＩ）ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄａｔａｆｏｒｈｉｇｈｅｆｉｃｉｅｎｔａｎｄ
ｓａｆｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｒｅｅｂｒｅｅｄｉｎｇ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｐｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ‘Ｎａｎｌｉｎ８９５’ｇｅｎｅｔｉｃａｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｂｙＣｐＴＩｏｂ
ｔａｉｎｅｄｂｙｕｓｉｎｇＫｍｒｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍａｒｋｅｒｗａｓｃｈｏｓｅｎａｓａｒｅｃｅｉｐｔ，ａｎｄｔｈｅｍａｎｎｏｓｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｐｏｐｌａｒｌｅａｖｅｓ，ｂｕｄ
ｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｔｅｍｒｏｏｔｉｎｇｉｎａｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｐｏｐｌａｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｔｗｏｉｎｓｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓ
ｂｙｗａｙｏｆＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅｓｕｉｔａｂｌｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ
ｐｏｐｌａｒｌｅａｖｅｓｗａｓ：Ｍａｎｎｏｓｅ８ｇ·Ｌ－１＋Ｓｕｃｒｏｓｅ２２ｇ·Ｌ－１；ｆｏｒｂｕｄｇｒｏｗｔｈ：Ｍａｎｎｏｓｅ１０ｇ·Ｌ－１＋Ｓｕｃｒｏｓｅ２０ｇ·
Ｌ－１；ａｎｄｆｏｒｓｔｅｍｒｏｏｔｉｎｇ：Ｍａｎｎｏｓｅ８ｇ·Ｌ－１＋Ｓｕｃｒｏｓｅ２２ｇ·Ｌ－１．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ，ｅｉｇｈｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ
ｗｉｔｈＢｔａｎｄＣｐＴＩｇｅｎｅｓｗｅｏｂｔａｉｎｅｄ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓｙｓｔｅｍｏｆｐｏｐｌａｒｗａｓｉｎｉｔｉａｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｕｓｅ
ｏｆｂｉｏｓａｆｅｔｙｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍａｒｋｅｒＰＭＩ．Ｔｈｅｂｅｓｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅｐｌａｎｔａｎｔｉｉｎｓｅｃｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃ
ｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＰＭＩｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ａｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｏｐｌａｒｗｉｔｈｔｗｏｉｎｓｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓ
林 业 科 学 研 究 第２９卷
ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰＭＩ；ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍａｒｋｅｒ；Ｐｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ＇Ｎａｎｌｉｎ８９５＇；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓｙｓｔｅｍ；ｉｎｓｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
随着基因工程的不断发展，转基因物种的应用
日益增加，转基因物种释放后是否会将基因转移到
野生植物中，或是否会破坏自然生态环境，打破原有
生物种群的动态平衡。基因工程中普遍使用的选择
标记基因是否安全以及转基因物种中的选择标记是
否会对环境产生潜在的负面效应。这些问题已成为
当今基因工程研究的热点［１］。
磷酸甘露糖异构酶（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，
ＰＭＩ）基因编码可将６磷酸甘露糖转变为６磷酸果
糖的６磷酸甘露糖转移酶。在加有甘露糖的选择培
养基上，植物内源己糖激酶催化甘露糖磷酸化为６
磷酸甘露糖，而非转化细胞由于不具备磷酸甘露糖
异构酶基因，不能利用６磷酸甘露糖，因而植物细胞
缺少提供生长的碳源，导致生长停滞。而含有 ＰＭＩ
基因的转化细胞能催化６磷酸甘露糖转变为６磷酸
果糖，为细胞正常生长提供碳源。因此，在加有适当
量甘露糖的选择培养基上只有转化细胞（已整合
ＰＭＩ基因）才能正常生长，而非转化细胞因缺乏碳
源，生长逐渐停滞被淘汰［２］。据以 ＰＭＩ为选择标记
的转基因甜菜［３］、拟南芥［４］、玉米［５］、小麦［６］中 ＰＭＩ
基因所编码的蛋白质进行敏感性评估
$
毒性测试
$
农艺性状
$
组成分析等方面的安全性评价，认为
ＰＭＩ作为选择标记基因的遗传转化筛选体系对人体
健康和环境是安全的。
杨树作为林木植物的模式树种，利用ＰＭＩ为选
择标记基因对其进行的遗传转化研究在国内外尚未
见报导。为检证采用 ＰＭＩ为选择标记开展杨树转
基因研究的可行性，本研究以获得的转ＣｐＴＩ抗虫基
因的南林８９５杨为受体材料，采用农杆菌介导的方
法，利用不同于抗生素的 ＰＭＩ选择标记基因的遗传
转化体系，进行双抗虫基因（Ｂｔ和ＣｐＴＩ）的转基因研
究，建立杨树以 ＰＭＩ为安全标记基因的转基因体
系，为安全、高效的林木转基因育种研究提供实验
依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
材料为南林８９５杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ×ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ‘Ｎａｎ
ｌｉｎ８９５’）已转 ＣｐＴＩ抗虫基因的无菌苗，该植株利用
Ｋｍｒ选择标记获得［７］。农杆菌 ＥＨＡ１０５为实验室保
存，含ＰＭＩ选择标记基因的表达载体ｐＮＯＶ２８１９由美
国Ｎｏｖａｒｔｉｓ公司惠赠（图１）、含 Ｂｔ抗虫基因的载体
ｐＢＩ１２１２ｋ由中国林科院卢孟柱研究员惠赠（图２）。
图１ 质粒ｐＮＯＶ２８１９
图２ 质粒ｐＢＩ１２１２ｋ
甘露糖购自南京Ｓｕｎｓｈｉｎｅ有限公司。各种限制
性内切酶购自 ＴａＫａＲａ公司，质粒提取试剂盒购自
Ａｘｙｇｅｎ公司，引物合成和 ＤＮＡ测序由 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公
司完成。
１．２ 甘露糖选择压的确定
１．２．１ 叶片分化的甘露糖敏感性试验 选取南林
８９５杨（已转ＣｐＴＩ）无菌苗，取上部第３ ５叶片，剪
去叶边缘，去除主叶脉，剪成０．５ １．０ｃｍ２小片，叶
片的近轴面接触甘露糖分化筛选培养基，培养基的
浓度各异［１，８］，设置１６个浓度梯度分别为：甘露糖＋
蔗糖 ＝０＋３０，２＋２８，４＋２６，６＋２４，８＋２２，１０＋２０，
１２＋１８，１４＋１６，１６＋１４，１８＋１２，２０＋１０，２２＋８，２４
＋６，２６＋４，２８＋２，３０＋０（ｇ·Ｌ－１）。
每一浓度梯度共处理 １２个叶片，叶片背面朝
下，在温度为（２５±２）℃，１２ｈ光／暗周期，光照度１
５００ ２０００ｌａｘ的条件下培养，４周后观察叶片的分
化生长状态。
２２２
第２期 查 琳，等：利用ＰＭＩ选择标记进行杨树转基因体系的研究
１．２．２ 叶片分化芽的甘露糖敏感性试验 待叶片
分化的不定芽长至１．５ｃｍ高时，选择生长状态良
好，大小一致的不定芽，置于含有不同浓度ＰＭＩ的叶
片分化芽培养基中进行培养，根据预筛选结果设置
６种不同ＰＭＩ浓度梯度分别为：甘露糖 ＋蔗糖 ＝０
＋３０，２＋２８，４＋２６，６＋２４，８＋２２，１０＋２０（ｇ·
Ｌ－１）。每处理５瓶，每瓶２个不定芽。３周后观察
叶片分化芽状态，统计不定芽生长率。
１．２．３ 茎段生根的甘露糖敏感性试验 选取组培
苗生长一致的健壮茎段，切成３ｃｍ长，接种在不同
浓度ＰＭＩ的生根培养基上，根据预筛选情况，设置６
种不同ＰＭＩ浓度梯度分别为甘露糖 ＋蔗糖 ＝０＋
３０，２＋２８，４＋２６，６＋２４，８＋２２，１０＋２０（ｇ·Ｌ－１）。
每处理５瓶，每瓶２个茎段。３周后观察茎段生根及
生长状况，以确定生根筛选培养时 ＰＭＩ最适选择压
浓度。
１．３ 含 ＰＭＩ选择标记植物抗虫基因表达载体的
构建
１．３．１ 含 Ｂｔ基因的 ＤＮＡ片段扩增及测序分析
以含有ｃｒｙ３Ａａ基因的克隆载体为模板，采用增加了
酶切位点ＨｉｎｄＩＩ和 ＳａｌＩ的引物 Ｂｔｕｐｐｅｒｙａｏ３：５′
ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ
３′；３５ＳＮＯＳｌｏｗｅｒ：５′ＣＴＧＧＴＣＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＴＡ
ＧＴＡＡＣＡＴＡＧＡＴＧ３′，对目的片段 ＣＡＭＶ３５ＳＢｔ
ＮＯＳ进行 ＰＣＲ扩增。扩增出目的条带，大小在
３０００ｂｐ左右。
将ＰＣＲ回收产物连接 Ｔ载体 ＰＭＤ１９上，得到
载体 ＰＭＤ１９３５ＳＢｔＮＯＳ。经过转化，蓝白斑筛选，
选择白斑进行摇菌，通过酶切鉴定转化子。将阳性
克隆测序，再利用ＢＬＡＳＴ软件对测序结果进行相似
性比较。经测序认为正确后，进行下一步的酶切。
１．３．２ 酶切与连接 将 ＰＭＤ１９３５ＳＢｔＮＯＳ采用
ＨｉｎｄＩＩ和ＳａｌＩ进行双酶切，回收纯化目的片段，连
接到利用相同双酶切的ｐＮＯＶ２８１９大片段中。连接
产物 转 化 大 肠 杆 菌，进 行 酶 切 来 确 定 载 体
ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ是否构建成功。
１．３．３ 农杆菌转化与保菌 提取 ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ，将
其转入农杆菌ＥＨＡ１０５，经ＰＣＲ及酶切鉴定后，将菌
株ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ（ＥＨＡ１０５）进行保菌。
１．４ ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ植物表达载体转化南林８９５杨
（已转ＣｐＴＩ基因）
将预培养的南林８９５杨外植体放入已稀释的
农杆菌菌液中浸染，期间不断轻轻摇动，用干燥无
菌滤纸将叶盘表面多余菌液吸去，置于暗箱 ３ｄ
后，放到分化培养基上进行共培养。共培养 ４ｄ
后，先用加有头孢的无菌水（２００ｍｇ·ｍＬ－１）冲洗
３次，再用无菌水冲洗２次，以去除农杆菌，并转移
到叶盘分化筛选培养基中。叶盘放到分化筛选培
养基上后，两周更换培养基，直至分化出可见的抗
性芽（转化率 ＝抗性芽分化叶盘数／总叶盘数）；当
叶盘上长出不定芽时，将其转入芽伸长筛选培养基
上；待抗性芽长至１ｃｍ左右，须将每个抗性芽独立
接入芽伸长培养基上培养；培养一段时间后将芽移
入壮苗筛选培养基上培养直至长到２ｃｍ左右，移
入生根筛选培养基。在这个过程中，要及时用加有
头孢的无菌水冲洗，及时更换培养基。培养过程培
养条件为：温度为 ２２℃，光照 ４０００ｌａｘ，光照时间
１６ｈ·ｄ－１的温室。
１．５ 转基因植株的分子检测
分别选取经 ＰＭＩ筛选获得的双抗虫基因南林
８９５杨植株叶片，提取基因组 ＤＮＡ进行 ＰＣＲ检测。
Ｂｔ基因的引物为：Ｕｐｐｅｒ：５′ＣＧＣＴＡＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴ
ＧＧＣＡＧ３′；Ｌｏｗｅｒ：５′ＧＡＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＣ
ＴＡ３′。ＣｐＴＩ基因的引物为：Ｐｒｉｍｅｒ１：５′ＡＧＡＧＧＣ
ＴＡＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧ３′；Ｐｒｉｍｅｒ２：５′ＡＴＣ
ＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴ３′。以质粒 ＤＮＡ
为阳性对照，未转化的植株 ＤＮＡ为阴性对照。扩增
Ｂｔ基因的反应体系（２０μＬ），ＰＣＲ反应条件为：９４℃
３ｍｉｎ预变性后，９４℃ ３０ｓ，６０℃ ３０ｓ，７２℃ ４５ｓ，共
３４个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。扩增 ＣｐＴＩ基因
的反应体系（２０μＬ），ＰＣＲ反应条件为：９４℃ ３ｍｉｎ
预变性后，９４℃ ３０ｓ，５５℃ ３０ｓ，７２℃ ４５ｓ，共３４个
循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
２ 结果与分析
２．１ ＰＭＩ筛选最适选择压的确定
２．１．１ 叶片分化筛选抗性芽 ＰＭＩ最适选择压的确
定 在行农杆菌侵染之前，对外植体进行抗生素的
敏感性测定是必要的，一般认为附加一定浓度的筛
选培养基中存活下来的细胞可初步认为是转化体。
不同甘露糖浓度对外植体芽分化的影响不同，在续
晨［１］基础上，设置了不同的甘露糖和蔗糖浓度，来确
定叶片分化ＰＭＩ的临界浓度，筛选出转化芽，ＰＭＩ对
叶片分化的影响见表１（其中分化系数＝总芽数／有
芽叶片数）。
从表１可以看出，甘露糖对转基因杨树的叶片
３２２
林 业 科 学 研 究 第２９卷
表１ 甘露糖浓度对杨树叶片分化的影响
甘露糖／
（ｇ·Ｌ－１）
蔗糖／
（ｇ·Ｌ－１）
参试叶
片数／个
有芽叶
片数／个
总芽
数／个
叶片分
化率／％
分化系
数／％
０ ３０ １２ １２ ２２０ １００ １８．３
２ ２８ １２ １２ １５７ １００ １３．１
４ ２６ １２ １２ ７１ １００ ５．９
６ ２４ １２ １０ １９ ８３ １．７
８ ２２ １２ ０ ０ ０ ０
１０ ２０ １２ ０ ０ ０ ０
１２ １８ １２ ０ ０ ０ ０
１４ １６ １２ ０ ０ ０ ０
１６ １４ １２ ０ ０ ０ ０
１８ １２ １２ ０ ０ ０ ０
２０ １０ １２ ０ ０ ０ ０
２２ ８ １２ ０ ０ ０ ０
２４ ６ １２ ０ ０ ０ ０
２６ ４ １２ ０ ０ ０ ０
２８ ２ １２ ０ ０ ０ ０
３０ ０ １２ ０ ０ ０ ０
分化有显著影响。在甘露糖为６ｇ·Ｌ－１时仍有８３％
的叶片能够分化，但分化系数却显著降低，总芽数明
显减少。经过约半个月的观察发现，甘露糖为８ｇ·
Ｌ－１时没有芽分化，叶片呈黄绿色，而甘露糖为１０ｇ
·Ｌ－１时叶片边缘已经褐化，甘露糖为１６ｇ·Ｌ－１及
以上时叶片整个全部褐化死亡。随着甘露糖浓度的
增加，芽的生长明显受到了抑制，可能是甘露糖对外
植体产生拮抗作用。当甘露糖浓度为８ｇ·Ｌ－１时，
完全不分化，因此该浓度为南林８９５杨叶片分化的
本底临界浓度。结果显示采用甘露糖８ｇ·Ｌ－１＋蔗
糖２２ｇ·Ｌ－１作为南林８９５杨筛选浓度较为理想。
２．１．２ 叶片分化芽筛选时 ＰＭＩ最适选择压的确定
将由叶片分化的不定芽接种到含有不同甘露糖浓
度的叶片分化芽培养基上，培养３周左右时，可观察
到不同甘露糖浓度对不定芽的生长有一定的影响。
由表２可知，在甘露糖为８ｇ·Ｌ－１时叶片分化芽生
长状态良好，其中甘露糖分别为０、２、４、６、８ｇ·Ｌ－１
浓度时几乎都发生芽生长，差异不是很明显，但甘露
糖为１０ｇ·Ｌ－１开始，芽长势不好。因此，选择甘露
糖１０ｇ·Ｌ－１＋蔗糖２０ｇ·Ｌ－１作为筛选叶片分化芽
培养基。
２．１．３ 茎段生根筛选 ＰＭＩ最适选择压的确定 转
化植株在生长和扩繁过程中必须加入选择筛选标
记，不加或加入的量较少，可能会造成目的基因丢
失，但如果过量，会抑制转化植株生长甚至造成死
亡。当甘露糖为０ｇ·Ｌ－１时，培养约一周茎段的基
部就膨大，并很快产生不定根，根系特别发达。当甘
露糖为２ｇ·Ｌ－１时，茎段基部也快速膨大，根系呈星
状，生长旺盛；但随甘露糖浓度的增加，生根率明显
下降，并且根的生长状况越来越差（图３）。结果显
示（表３）采用甘露糖８ｇ·Ｌ－１＋蔗糖２２ｇ·Ｌ－１作
为南林８９５杨的筛选生根浓度较为理想。
表２ 甘露糖浓度对杨树叶片分化芽的影响
甘露糖／
（ｇ·Ｌ－１）
蔗糖／
（ｇ·Ｌ－１）
参试芽
数／个
叶片分化
芽数／个
芽生长
率／％
芽的生长
情况
０ ３０ １０ １０ １００ 芽生长状态良好
２ ２８ １０ １０ １００ 芽生长状态良好
４ ２６ １０ １０ １００ 芽生长状态良好
６ ２４ １０ １０ １００ 芽生长状态良好
８ ２２ １０ １０ ８０ 芽生长状态良好
１０ ２０ １０ ０ ０
芽生长状态不好，几
乎不生长
１２ １８ １０ ０ ０
芽生长状态不好，几
乎不生长
１４ １６ １０ ０ ０
芽生长状态不好，几
乎不生长
注：（１）甘露糖为０ｇ·Ｌ－１时生根情况（２）甘露糖为２ｇ·Ｌ－１时生
根情况（３）甘露糖为４ｇ·Ｌ－１时生根情况（４）甘露糖为６ｇ·Ｌ－１
时生根情况（５）甘露糖为８ｇ·Ｌ－１时生根情况
图３ 不同甘露糖浓度对茎段生根的影响
表３ 甘露糖浓度对杨树茎段生根的影响
甘露糖／
（ｇ·Ｌ－１）
蔗糖／
（ｇ·Ｌ－１）
茎段
数／个
生根
数／个
生根
率／％
茎段生根及
生长情况
０ ３０ １０ １０ １００
生长旺盛，根系
发达，呈星状
２ ２８ １０ １０ １００
生长旺盛，
根系呈星状
４ ２６ １０ ８ ８０
生长良好，根系
一部分呈星状，
一部分呈放射状
６ ２４ １０ ５ ５０
一部分生根，
茎段基部膨大
８ ２２ １０ ０ ０
生长受抑制，茎段
几部不膨大
４２２
第２期 查 琳，等：利用ＰＭＩ选择标记进行杨树转基因体系的研究
２．２ 含ＰＭＩ选择标记基因植物抗虫表达载体构建
２．２．１ 含Ｂｔ基因片段的扩增及序列分析 以含有
ｃｒｙ３Ａａ基因的克隆载体为模板，采用增加了酶切位
点 ＨｉｎｄＩＩ和 ＳａｌＩ的引物 Ｂｔｕｐｐｅｒｙａｏ３和 ３５Ｓ
ＮＯＳｌｏｗｅｒ，对目的片段 ＣａＭＶ３５ＳＢｔＮＯＳ进行 ＰＣＲ
扩增。扩增获得了目的条带，大小在３０００ｂｐ左右，
与预期一致（图４）。
注：Ｍ：ｐｌｕｓＤＬ２０００；１：Ｂｔ基因表达盒
图４ Ｂｔ基因表达盒的ＰＣＲ扩增结果
将ＰＣＲ扩增片段测序结果在ＮＣＢＩ数据库进行
比对，发现它与 Ｂｔ８８６Ｃｒｙ３Ａａ序列高度同源，同源性
达９９％，表明扩增出的条带应是Ｂｔ基因表达盒。
２．２．２ 酶切和连接 将获得的载体ＰＭＤ１９３５ＳＢｔ
ＮＯＳ采用ＨｉｎｄＩＩ和ＳａｌＩ进行双酶切，回收纯化目
的片段，连接到利用相同双酶切的 ｐＮＯＶ２８１９大片
段中。构建了 ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ的植物表达载体（图
５），可以用于植物遗传转化。
注：Ｍ：１ＫｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ；１ ４：ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ转化子
图５ ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ表达载体的酶切鉴定
２．３ 农杆菌介导的遗传转化
２．３．１ 菌液浓度对芽生长的影响 采用分光光度
计测定农杆菌的浓度，设置 ＯＤ值为０．５、１．０、１．５
三个梯度来研究农杆菌侵染适宜的浓度。通过试验
发现，ＯＤ值达到１．５时，菌液中有大量的白色絮状
沉淀，说明农杆菌进入生长平台期，开始有大量菌死
亡，转化率也大大降低。而 ＯＤ值在０．５时，菌液较
清澈，不混浊，且后期统计的转化率非常低。ＯＤ值
为１．０时，菌液混浊，后期统计的转化率比其他两个
浓度要高的多。
２．３．２ 转基因杨树的获得 载体 ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ利
用农杆菌ＥＨＡ１０５介导，共转化法转化南林８９５杨。
统计其转化叶盘在筛选培养基上分化产生的抗性芽
数量。转化率评价指标为筛选培养基上培养 ３０ｄ
后产生抗性芽的外植体数。各次转化的分化情况统
计结果如表４。
表４ 转化效率
转化次数 总叶盘数／个 分化叶盘数／个 转化率／％
１ ７５ １２ １６．００
２ ７９ １５ １８．９９
３ ６８ １０ １４．７１
４ ８２ １９ ２３．１７
５ ９９ ２１ ２１．２１
６ ７３ ８ １０．９６
７ ７８ １１ １４．１０
８ ８９ ７ ７．８６
９ ８７ １３ １４．９４
１０ ７１ １８ ２５．３５
１１ ６５ １２ １８．４６
１２ ７２ １０ １３．８９
从表４可知，每次转化效率都不同，所受影响因
素很多。平均转化率为１６．６４％。
２．４ 转基因植株的分子检测
所用的转ＣｐＴＩ基因植株经多次继代后，可能会
导致原有基因的逃逸。在利用 ＰＭＩ作为选择标记
基因进行双抗虫基因（Ｂｔ和 ＣｐＴＩ）的遗传转化前需
进行分析筛选（图６）。
注：Ｍ：ＭａｒｋｅｒⅢ；ＣＫ＋：质粒 ｐＦＺＹ１（阳性对照）；ＣＫ：非转化植株
（阴性对照）；１ ８：部分转化植株）
图６ 部分转ＣｐＴＩ植株的ＰＣＲ检测
通过ＰＣＲ分析（图７），初步证明Ｂｔ基因已转入
杨树基因组中，并获得了一批转双抗虫基因（Ｂｔ和
ＣｐＴＩ）的杨树植株。
３ 讨论
含ＰＭＩ选择标记基因的植物抗虫表达载体
ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ的构建采用了先克隆出含 Ｂｔ基因的
表达盒，经测序后获得了 Ｂｔ基因的序列，再酶切连
接的方法。采用这一构建路线的原因是如果采用直
接酶切的方法，存在不精确的情况，有可能会影响到
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林 业 科 学 研 究 第２９卷
注：Ｍ：ＭａｒｋｅｒⅢ；ＣＫ＋：质粒 ｐＮＯＶ２８１９Ｂｔ（阳性对照）；ＣＫ：非
转化植株（阴性对照）；１ ８：转化植株
图７ 转Ｂｔ植株的ＰＣＲ检测
连接，因此，将启动子、终止子和基因片段一起插入
ｐＮＯＶ２８１９载体，可以有效解决这一问题。
杨树作为木本植物，其生根时间和难度远远大
于一些农作物［９－１０］、草本植物［１１］和花卉［１２］。采用
传统的抗生素或除草剂等筛选方法获得的转基因芽
再生根相当困难，而甘露糖筛选从原理上是促进生
根，对转基因芽生根能力的抑制要减少许多，能够在
相对较短的时间里得到更多数量的转基因苗。
ＰＭＩ作为一种正向筛选标记基因，它不同于大
多数抗生素和除草剂等负筛选标记，对植物没有直
接的毒害作用，而是作为一种额外的糖源，转化细胞
可以将甘露糖转变成６磷酸果糖，并继续代谢为细
胞提供能量，因此表现为生长方面的优势［１３］。而非
转化细胞由于没有 ＰＭＩ基因催化后的产物６磷酸
甘露糖，因而不能利用甘露糖作为碳源，生长受抑停
止。近年来，该筛选体系已成功应用于甜菜［３］、拟南
芥［４］、玉米［５］、小麦［６］等植物的遗传转化。因此甘
露糖筛选体系是较理想的遗传转化选择系统，具有
广阔的应用前景。但是，此系统也有一定的局限性，
并不是所有的植物都可以用此系统进行筛选［１４］。
如甘露糖对烟草没有筛选作用，通过试验发现烟草
叶片对甘露糖不敏感。不同植物对甘露糖有不同的
敏感性。可能的原因是：植物中的新陈代谢途径相
当复杂，不同植物新陈代谢途径差异较大，有些植物
可能缺少将甘露糖转变为６磷酸甘露糖的酶。此
外，甘露糖是糖蛋白和细胞壁的重要糖分子，有些植
物可以利用１磷酸甘露糖合成糖蛋白、细胞壁中的
多糖物质、维生素 Ｃ等。有些植物也可能有自身的
酶将 ６磷酸甘露糖转变为 ６磷酸果糖，如 ＰＭＭ。
如果植物中内源的甘露糖酶活性太高，则植物可能
不会对甘露糖敏感。因此，有些植物不适用甘露糖
做筛选剂［１５］。
４ 结论
研究首次建立了 ＰＭＩ为选择标记基因的杨树
转基因筛选体系，确定了 ＰＭＩ筛选的最适选择压，
成功构建了含 ＰＭＩ选择标记基因的植物抗虫表达
载体，通过农杆菌介导的遗传转化，获得了转基因杨
树，为安全、高效的杨树转基因育种研究提供了实验
依据。
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（责任编辑：张 研）
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