全 文 ：分子植物育种，2009年，第 7卷，第 6期，第 1120-1129页
Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.6, 1120-1129
研究报告
Research Report
甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用
杨彩云 尹伟伦 夏新莉 *
北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程实验室,北京, 100083
*通讯作者, xiaxl@bjfu.edu.cn
摘 要 为了研究甘露糖正向筛选体系在拟南芥转化中的有效性，本研究参照GenBank上公布的 PMI基因序
列，通过 PCR从大肠杆菌克隆了 6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase, PMI)基因，替换植物表达
载体 pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase, HPT)基因，并将以 CaMV 35S和
AmCBL1P两种启动子调控的沙冬青 AmCBL1基因成功地构建到重组载体 pPMI上，并导入根癌农杆菌 E-
HA105中，然后通过农杆菌花序浸染法转入拟南芥。将获得的阳性植株通过 GUS组织化学法鉴定、氯酚红
(chlorophenol red, CPR)法及 PCR检测，证明 PMI基因已经转入拟南芥中。在不使用抗生素和除草剂的情况
下这种筛选体系为转基因拟南芥筛选提供了更加安全有效的方法，并且为以后 AmCBL1基因的功能验证及
植物抗逆性的改良奠定了基础。
关键词 磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因,甘露糖, AmCBL1,遗传转化,拟南芥
Establishment of Positive Selection System of Mannose and Application of
Genetic Transformation in Arabidopsis thaliana
Yang Caiyun Yin Weilun Xia Xinli *
College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, National Engineering Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding,
Beijing Forestry University, Beijing, 100083
* Corresponding author, xiaxl@bjfu.edu.cn
DOI: 10.3969/mpb.007.001120
Abstract In order to study on validity of positive selection system of mannose in the transformation of Arobidopsis
thaliana, we cloned the PMI gene from Escherichia coli by using PCR according to the sequence of PMI gene in
GenBank. The PMI gene replacement the HPT gene of plant expression vector pCAMBIA1301, and named vector
pPMI. As well as, the AmCBL1 gene of Ammopiptanthus mongolicus regulated by 35S promoter and promoter
AmCBL1P, was cloned into recombinant vector pPMI and transformed into Agrobacterium EHA105. Transgenic
plants were obtained through the flower dipping method mediated by Agrobacterium tumefacien, GUS histochemical
assay, CPR assay and PCR analysis indicated that PMI gene had really been introduced into the genomes of Aro－
bidopsis thaliana. This selection system would provides an efficient way for selecting transgenic plants in Aro－
bidopsis thaliana under the conditions of without antibiotics and herbicides, and it would lay a basis for verifying
of AmCBL1 gene function and improving plant tolerance to biotic and abiotic stresses.
Keywords Phosphomannose isomerase (PMI) gene, Mannose, AmCBL1, Genetic transformation, Arobidopsis
thaliana
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.007.001120
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30730077; 30972339)和国家十一五项目(2006BAD03A01)共同资助
随着生物技术的发展，转基因产品的安全性问
题，尤其是转基因植物中的抗性标记基因受到越来
越多的关注，植物遗传转化中广泛使用的抗生素和
除草剂等抗性基因虽然方便了植物的转化，但一旦
转化成功，标记基因便不再有用，甚至对生态环境和
食品安全存在潜在威胁。因此，选用安全性标记基因
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
代替传统的负向选择标记基因已经受到了许多研究
者的关注。利用无争议的生物安全性标记基因可以
避免使用抗生素标记基因和除草剂基因带来的众多
消极影响，这种标记基因不会杀死非转化细胞，而是
利用转化细胞的生理或生长方面的优势，从而区别
转化与非转化细胞。近年来发现的安全标记基因主
要包括化合物解毒酶基因、糖类代谢酶基因和与激
素代谢途径相关的基因等正向选择性标记基因，与
常规标记基因不同，这些标记基因没有抗生素或除
草剂抗性，对生物是安全的。
甘露糖磷酸异构酶(phosphomannose isomerase,
PMI)基因在自然界中广泛存在，人们从细菌、酵母、
动物及人体中都已分离到编码该蛋白的基因。然而，
除肉桂(Cinnamomum cassia)和一些豆类外，自然界的
植物中大都没有编码 PMI的基因(Lee and Matheson,
1984)，因此以甘露糖为筛选剂的正向筛选系统在绝
大多数植物的遗传转化中都可以应用。甘露糖磷酸
异构酶(phosphomannose isomerase, PMI)基因在自然
界中广泛存在，人们从细菌、酵母、动物及人体中都
已分离到编码该蛋白的基因。然而，除肉桂(Cin－
namomum cassia)和一些豆类外，自然界的植物中大
都没有编码 PMI的基因(Lee and Matheson, 1984)，因
此以甘露糖为筛选剂的正向筛选系统在绝大多数植
物的遗传转化中都可以应用。PMI作为一种正向筛选
标记基因，它不同于大多数抗生素和除草剂负向筛选
标记，首先甘露糖作为筛选剂，它对植物没有直接的
毒害作用，它是作为一种额外的糖源，转化细胞可以
将甘露糖转变成 6-磷酸果糖，可继续代谢为细胞提
供能量(Weisser et al., 1996)，因此表现为生长方面的
优势。而非转化细胞由于没有 PMI基因催化后的产
物 6-磷酸甘露糖，因而不能利用甘露糖作为碳源。
近年来，PMI基因作为一种新型的正向选择标记已
经被成功地应用于甜菜(Joersbo et al., 1998; 2000)、
木薯(Zhang et al., 2000)、玉米(Wang et al.; 2000)、小麦
(Wright et al., 2001)、甜橙(Boscariol et al., 2003)、水稻
(He et al., 2004)、番茄(彭世清和陈守才, 2005)、棉花
(岳建雄等, 2005)、苹果(Degenhardt et al., 2006)、甘蔗
(Jain et al., 2007)、柑橘(Ballester et al., 2008)等各种
不同植物中。因此 PMI/甘露糖筛选体系是较理想的
遗传转化选择系统，具有广阔的应用前景。
CBL1基因最早在拟南芥 (Arabiadopsis thaliana)
中有克隆报道，并且有关 AtCBL1基因功能及 AtCBL1
基因家族的研究较为详细，虽然其调控的机理目前还
不是特别的清楚，但通过一些研究可以肯定的是
AtCBL1基因是植物对胁迫响应早期信号转导期的
一个重要调控因子，它不仅可以被多种逆境胁迫所
诱导，还可以调节其它逆境基因的表达(Cheong et al.,
2003)。AmCBL1基因目前还没有报道，通过沙冬青
CBL1基因在各种逆境下的响应情况可以研究 Am－
CBL1基因的功能，验证 CBL1基因在沙冬青中有无
特异表现，从而达到进一步改善和提高木本植物的抗
逆性。本实验克隆了甘露糖异构酶基因(PMI)，并将两
种不同启动子调控的沙冬青 AmCBL1基因构建到含
有安全性选择标记 PMI 基因的植物表达载体
pCAMBIA1301上，将其转化拟南芥后获得了转基因
植株，这为下一步验证沙冬青 AmCBL1基因的功能
以及研究两种不同启动子对基因表达影响的差异奠
定了基础。
1 材料与方法
1.1实验材料
本实验所用材料野生型哥伦比亚拟南芥(Aro－
bidopsis thaliana)种子，根癌农杆菌 (Agrobacterium
tumefaciens) EHA105菌株，植物表达载体 pCAMBI-
A1301由作者实验室保存、质粒 PBI121 分别含有
AmCBL1基因(由本实验室克隆并注册, GeneBank注
册号为 AY902246)和 AmCBL1P (由本实验室克隆并
申请专利,专利申请号为 200710107294.8) 由作者实
验室构建和保存，大肠杆菌(Escherichia coli)感受态
TOP10 购自天为时代公司，PMD18-T Vector 购自
TaKaRa公司。
各种限制性内切酶和 DNA修饰酶购自 TaKaRa
公司，质粒提取试剂盒和 DNA凝胶纯化回收试剂盒
购自天根生化科技(北京)有限公司，抗生素为 Sigma
公司产品，其它生化试剂购自拜尔迪等公司，引物及
DNA序列测定由上海生工完成。
1.2拟南芥的培养
拟南芥种子用 70%乙醇消毒十几秒，10%次氯酸
钠消毒 10 min后，无菌水冲洗 5遍，然后播种于 MS
固体培养基中，4℃春化 3 d，然后在 21℃、16 h/8 h光
照条件下培养。待拟南芥长出 2~3片真叶时，移栽到
基质(蛭石:营养土=1:1)中继续培养。拟南芥长到一定
大小时，陆续会有大量花开放，当拟南芥植株形成
2~3个角果时，即可进行农杆菌的转化。
1.3甘露糖选择压的确定
设置不同甘露糖的浓度梯度为 0、0.1 mmol/L、
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.0011201121
0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、
3.0 mmol/L、4.0 mmol/L、5.0 mmol/L、7.0 mmol/L、
10.0 mmol/L、13.0 mmol/L和 20.0 mmol/L，培养基
为：MS+琼脂糖 7 g/L+不同浓度甘露糖(mmol/L)+蔗
糖，将野生型拟南芥种子接种在含有不同浓度甘露
糖的MS培养基上，共设置 14个梯度，每个梯度 3
个重复，10~15 d 后观察拟南芥种子的生长发育状
况，根据拟南芥种子的萌发及植株的生长情况最终
确定适合的甘露糖筛选浓度。
1.4 植物表达载体的构建
1.4.1 PMI基因克隆
将从-80℃冰箱中取出的大肠杆菌菌株接种在
LB 液体培养基中，37℃震荡过夜培养，然后用
CTAB法提取大肠杆菌基因组 DNA。根据 NCBI数
据库所提供的基因序列设计引物，为了方便载体构
建在引物前都设计了 XhoⅠ的酶切位点，并在引物
两边加入保护碱基。扩增片段大小 1.2 kb左右，引物
序列为：Ppmi-1: 5-GCACTCGAGCATGCAAAAAC
TCATTAACTCAG-3；Ppmi-2: 5-GCACTCGAGCT
CTTACAGCTTGTTGTAAAC-3。
以大肠杆菌基因组 DNA作为 PCR 扩增 manA
基因的模板。利用 Ppmi-1和 Ppm-2作为引物进行
PCR扩增，其扩增程序如下：94℃ 4 min预变性后，
94℃ 45 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共 35个循环，最后
72℃延伸 10 min。PCR反应结束后琼脂糖凝胶电泳
确认 PCR反应产物是否符合目的基因条带。扩增所得
的目的片段纯化回收后与克隆载体 PMD18-T连接转
化大肠杆菌，重组质粒命名为 Pt-pmi。从培养好的每
个平板上随机挑取 5 个白色单菌落接种于含 Amp
(100mg/mL)的 LB液体培养基中，37℃，200 r/min振荡
培养过夜，分别取菌液做菌落 PCR检测，并提取质
粒做酶切鉴定后，进一步对阳性重组子 Pt-pmi送至
公司做 DNA序列测定。
1.4.2植物表达载体 PCAMBIA1301-PMI的构建
将 PCAMBIA1301 上的筛选标记基因 hpt 用
XhoⅠ切下，同时用 XhoⅠ酶切 Pt-pmi得到目的基因
PMI，然后用 PMI基因替代 hpt作为转基因植物的筛
选标记。然后回收切除 hpt的 PCAMBIA1301的载体
片段和 PMI，用 T4 DNA连接酶连接。产物转化大肠
杆菌，涂布于 Kan抗性平板，28℃过夜，挑取单菌落
进行酶切、PCR鉴定，获得阳性克隆，并鉴定正反向，
重组载体命名为 pPMI。
1.4.3植物表达载体 pPMI-35S-AmCBL1-nos的构建
用 XbaⅠ和 HindⅢ分别酶切重组质粒 PBI121-
35S和 PCAMBIA1301-PMI，回收 PBI121的 35S片
段及 PCAMBIA1301-PMI的大片段，用 T4 DNA连接
酶连接，得到重组质粒 PCAMBIA1301-PMI-35S。然
后用 XbaⅠ和 EcoRⅠ酶切重组质粒 PBI121-Am-
CBL1 和 PCAMBIA1301-PMI-35S，回收 AmCBL1
片段和大片段，用连接酶连接，连接产物转化大肠杆
菌，以转化的重组质粒的新鲜菌液为模板做菌液 PCR
检测及质粒酶切检测，以确定载体是否构建成功。
1.4.4 植物表达载体 pPMI-AmCBL1P-AmCBL1-nos
的构建
用 XbaⅠ和 EcoRⅠ分别酶切重组质粒 PBI121-
AmCBL1和 pPMI，然后分别回收目的片断，用 T4连
接酶连接，产物转化大肠杆菌，挑菌进行 PCR检测，
重组载体命名为 pPMI-AmCBL1-nos。根据启动子
AmCBL1P的序列设计引物，为了便于载体构建在引
物两边分别加酶切位点 PstⅠ和 SalⅠ，引物为：PstⅠ-
AmCBL1P : 5-CGCTGCAGAAATGGATTTAATTG
GTATAAAT-3；SalⅠ-rAmCBL1P: 5-gtcgacaTGGA
GGAAATCTAGGCAAAG-3。
将 AmCBL1基因启动子 AmCBL1P从 PBI121-
AmCBL1P 上克隆下来，与克隆载体 PMD18-T 连
接，然后用限制性内切酶 SalⅠ单酶切，将 AmCBL1P
片段定向插入中间表达载体 pPMI-AmCBL1的多克
隆位点。然后转化大肠杆菌进行 PCR检测和酶切鉴
定，并进行正反向鉴定。
1.5植物表达载体转化拟南芥
重组质粒 pPMI-35S-AmCBL1-nos、pPMI-AmC-
BL1P-AmCBL1-nos分别导入根癌农杆菌 EHA105，
待拟南芥长到一定时期适合转化时，将准备好的农杆
菌菌液，用花序浸染法转化拟南芥。采用根瘤农杆菌
介导的花序浸染法转化拟南芥，待拟南芥生长到一
定时期时将长有拟南芥的营养钵倒扣于盛有农杆菌
侵染液的烧杯上，保证莲座以上部分浸没于菌液上；
侵染 2~3 min后取出来，侧置于托盘上，并覆盖保鲜
膜以保持湿度。然后暗培养 24 h左右将其直立，仍覆
盖保鲜膜 3~4 d，根据情况在培养 3~4 d或一周后，再
侵染一次；待浸染转化后种子成熟以后，收获种子于
离心管中，置于 37℃条件下干燥 7~10 d，然后放在干
燥器或 4℃冰箱内贮存以备下一步试验使用。
转基因拟南芥的筛选：转化后的拟南芥待到种
甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用
Establishment of Positive Selection System ofMannose and Application of Genetic Transformation in Arabidopsis 1122
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
子成熟时，将转化收获的 T0代种子播种在含有 MS+
琼脂糖 7 g/L+甘露糖的筛选培养基上，10 d以后观
察种子萌发生长情况。
1.6转基因植株的检测
待筛选培养基上筛选出来的苗长出两片子叶
后，即可将其移栽到培养基质中，然后等其长大后，
取拟南芥植株的少量叶片用于检测。
1.6.1氯酚红(chlorophenol red, CPR)法
用甘露糖筛选出来的 T0转化植株首先用氯酚红
(chlorophenol red, CPR)检测，CPR检测参照 Boscariol
等(2003)的方法进行，氯酚红法可以用来检测磷酸甘
露糖异构酶的活性。检测培养基 MSM：MS+甘露糖
5 g/L+CPR 50 mg/L，pH 6.4。超净工作台中，将待测
组织小块接种到加有MSM的离心管中，27℃暗培养
4~5 d后观察颜色变化并统计 CPR阳性植株比例。
1.6.2 GUS组织化学法染色鉴定
将待测转基因 T1代拟南芥幼苗及野生型对照浸
入适量染色液中，真空抽虑 12 h，肉眼观察染色结果并
拍照。如材料存在色素干扰问题，染色后用酒精脱色，
使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存。染色液为
100 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，内含 0.5 mg/mL
X-GluC、1% Triton X-100、1% DMSO 和 10 mmol/L
EDTA。
1.6.3转基因植株的 PCR检测
取筛选出来的拟南芥植株的少量叶片采用
CTAB法提取基因组 DNA进行 PCR检测。引物为：
Ppmi-1 : 5-GCACTCGAGCATGCAAAAACTCATT
AACTCAG-3；Ppmi-2: 5-GCACTCGAGCTCTTAC
AGCTTGTTGTAAAC-3。以质粒 DNA 为模板的
PCR扩增产物作为阳性对照，未转化的拟南芥植株
基因组 DNA为模板的 PCR扩增反应产物为阴性对
照。PCR反应体系为：25 μL，将各种成分混合后进行
PCR反应，PCR反应条件如下：94℃ 4 min预变性后，
94℃ 45 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共 35个循环，最后
72℃延伸 10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
2 结果与分析
2.1 PMI基因及序列分析
根据 NCBI数据库提供的 PMI基因序列设计引
物,并考虑到植物表达载体以及基因自身的酶切位点
的限制，在引物前加入了 XhoⅠ的酶切位点。然后将
大肠杆菌基因组作为 PCR扩增的模板进行 PCR扩
增反应。PCR扩增产物回收后与 PMD18-T载体连
接，连接产物经 PCR检测得到约 1.2 kb长度的片段
(图 1)。并且重组质粒经 XhoⅠ酶切获得小片断长约
1.2 kb。对重组质粒进行测序结果表明，该片段长为
1 176个 bp，该序列与 NCBI上 GenBank中发表的
已知核苷酸序列进行同源性比对,只有在 1 091处的
碱基不同，同源性达到 99.91% (图 2)。其编码的氨基
酸序列比对，同源性达到 100% (图 3)，结果表明该片
断为磷酸异构酶基因 PMI。
2.2 植物表达载体的构建及检测
2.2.1植物表达载体 PCAMBIA1301-PMI的构建
pCAMBIA1301-PMI的构建策略是用 PMI替换
pCAMBIA1301中的 hpt，而 hpt的启动子和终止子
图 1 Pt-pmi质粒的电泳检测
注: M: DNA markerⅢ; 1~2: PCR产物
Figure 1 Electrophoresis detection scheme for Pt-pmi plasmids
Note: M: DNA markerⅢ; 1~2: PCR product
图 2核苷酸比对结果
Figure 2 Results of nucleotide blast
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.0011201123
保持不变。由于 hpt两端的酶切位点只有 XhoⅠ，因
此设计引物时在引物两端分别加上 XhoⅠ位点，这
样 PMI替换 PCAMBIA1301中原有的标记基因 hpt
构建成重组质粒 pPMI。由于 XhoⅠ是单酶切连接，
因此对重组质粒菌液进行 PCR检测，需要鉴定插入
的方向，采用 PCR方法鉴定插入方向：在载体上插
入目的基因 PMI的启动子 35S上靠近目的基因处设
计上游引物，在 PMI基因内部设计下游引物，若基因
片段正向插入时可扩增出特定大小的产物，若基因
片段反向插入就无法扩增出产物，由此判断有 PMI
的插入。并且通过 XhoⅠ酶切检测进一步证明 PMI
基因已成功插入(图 4)。
2.2.2植物表达载体 pPMI-35S-AmCBL1-nos的构建
由于目的基因必须定向克隆到启动子和终止子
之间才能表达，因此载体构建策略是将 AmCBL1及
启动子 CaV35S及终止子 nos一起插入已经构建好
的中间表达载体 pPMI的多克隆位点，鉴于表达载体
PBI121-AmCBL1和 pPMI上酶切位点的限制以及基
因内部酶切位点的局限性，不能将 AmCBL1及启动
子 CaMV35S及终止子 nos一起切下来共同插入多
克隆位点，因此只能分步酶切。首先从载体 PBI121
上将 35S片断用 XbaⅠ和 HindⅢ切下来，插入中间
表达载体 pPMI 的克隆位点，然后再用 XbaⅠ和
EcoRⅠ分别酶切重组质粒 PBI121-AmCBL1 和 pP-
MI-35S， 回 收 PBI121-AmCBL1-NOS 的 Am－
CBL1-NOS片段和 pPMI-35S的大片段，并在连接酶
的作用下进行连接，转化挑菌后进行菌液 PCR 检
测，结果证明载体构建成功(图5)。
2.2.3 植物表达载体 pPMI-AmCBL1P-AmCBL1-nos
的构建
载体构建思路是将目的基因 AmCBL1 及其自
图 3氨基酸比对结果
Figure 3 Alignment of amino acid sequences
图 4载体 PCAMBIA1301-PMI构建图谱
Figure 4 Construct of plant expression vector pPMI
甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用
Establishment of Positive Selection System ofMannose and Application of Genetic Transformation in Arabidopsis 1124
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
身启动子 AmCBL1P及终止子 nos序列共同插入中
间表达载体 pPMI的多克隆位点。鉴于对植物表达载
体以及基因酶切位点的考虑，首先用 XbaⅠ和 EcoRⅠ
分别酶切重组质粒 PBI121-AmCBL1和 pPMI，因此
将 AmCBL1-nos片段同时从表达载体 PBI121 上切
下来，然后回收目的片段和 Ppmi的大片段进行连接。
因为 AmCBL1P构建在 PBI121上面，而它两端的酶
切位点不能用，因此只有根据启动子 AmCBL1P的序
列设计引物将其克隆下来，为了便于载体构建在引物
两端分别加酶切位点 PstⅠ和 SalⅠ，PCR产物与克隆
载体 PMD18-T连接，连接后发现 AmCBL1P两端都
有 SalⅠ酶切位点，并且发现用 SalⅠ单酶切可以将
目的片段切下来，而其它的酶切方式均不成功。因此
最终选择限制性内切酶 SalⅠ单酶切，最后将 Am－
CBL1P片段定向插入中间表达载体 pPMI-AmCBL1
的多克隆位点。然后转化大肠杆菌进行 PCR检测并
鉴定正反向：在载体上靠近目的基因 AmCBL1P位点
处设计上游引物，在 AmCBL1P基因内部设计下游引
物，进行 PCR检测。最终结果表明植物表达载体
pPMI-AmCBL1P-AmCBL1-nos构建成功(图 6)。
2.3植物表达载体转化拟南芥
2.3.1甘露糖选择压的确定
为了确定拟南芥对甘露糖的天然耐性，在转化拟
南芥之前首先要做甘露糖的敏感性测试，以便获得最
佳筛选浓度。将拟南芥种子播种在含有 0、0.1 mmol/L、
0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、
3.0 mmol/L、4.0 mmol/L、5.0 mmol/L、7.0 mmol/L、
10.0 mmol/L、13.0 mmol/L和 20.0 mmol/L甘露糖的
MS培养基上，10 d后发现浓度小于 4 mmol/L时，叶
片呈绿色的苗太多，假阳性的可能性很大。在甘露糖
图 5载体 PCAMBIA1301-PMI-35S-AmCBL1-nos物理图谱
Figure 5 Physics map of expression vector PCAMBIA1301-PMI-
35S-AmCBL1-nos
图 6载体 PCAMBIA1301-PMI-AmCBL1P-AmCBL1-nos物理
图谱
Figure 6 Physics map of expression vector PCAMBIA1301-PMI-
AmCBL1P-AmCBL1-nos
的浓度达到 4 mmol/L时，部分种子的萌发受到抑
制，子叶和根的生长也受到了抑制，只有少数种子萌
发和生长正常。当浓度大于 4 mmol/L时，大多数种子
的生长和萌发都受到严重抑制，生长缓慢，随着培养
时间的延长，大部分长出的子叶逐渐由绿色变为黄
色，最终黄化死亡。而加入蔗糖后，发现种子受甘露
糖的抑制作用被缓解，种子均萌发长出子叶，根也很
长，恢复正常生长状态(表 1)。因此，确定甘露糖的最
佳筛选浓度为 4 mmol/L。
2.3.2转基因拟南芥的筛选
将转化收获的 T0代种子播种在含有MS+琼脂糖
7 g/L+4 mmol/L甘露糖的筛选培养基上，5 d以后观察
种子萌发生长情况。发现大部分种子均萌发，只有少
数萌发受到抑制。经过 10 d左右，将那些长势比较好，
根较长，叶片大且保持绿色的植株移栽至基质中，将
这些植株初步认定为转基因植株，待其长大后用于转
基因检测。最终得到的两个启动子调控的表达载体的
阳性植株分别为 35S 60株，AmCBL1P 48株。
2.4转基因拟南芥的检测
甘露糖筛选出来的阳性植株必须通过进一步的
检测才能真正确定其是否是转基因植株。因此待初步
筛选的转基因苗长大后，用 CPR 法、GUS 染色和
PCR检测可以初步确定其是否为真正的转基因植株。
2.4.1氯酚红(CPR)法检测
经甘露糖筛选得到的拟南芥阳性植株，首先用
氯酚红(CPR)法检测，氯酚红显色法基于甘露糖代谢
时可使培养基酸化的原理。指示剂氯酚红在 pH 6.0
时呈红色，随着 pH值下降转变成黄色。待测材料在
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.0011201125
甘露糖浓度(mmol/L)
Mannose concertration (mmol/L)
0.0
0.1
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0
4.0
5.0
7.0
10.0
13.0
20.0
4.0+1%蔗糖
4.0+1% sucrose
表 1不同浓度的甘露糖对拟南芥种子萌发生长的影响
Table 1 Effect of mannose concentration on Arabidopsis thaliana seed germination and growth
萌发率(%)
Germination rate (%)
99.26±0.75*
99.67±0.33
99.01±0.50
95.63±1.03
96.52±0.44
94.37±0.73
71.42±3.10
52.36±7.57
16.04±1.50
7.64±2.10
5.03±0.70
3.37±0.99
2.28±0.38
97.48±2.53
注: *:标准误差
Note: *: Standard error
生长情况
Development
子叶生长正常,根短
Cotyledon with normal growth, short root
子叶生长正常,根短
Cotyledon with normal growth, short root
子叶生长正常,根短
Cotyledon with normal growth, short root
子叶生长正常,无根
Cotyledon with normal growth, no root
子叶生长正常,无根
Cotyledon with normal growth, no root
子叶期生长受到抑制,无根
Growth inhibition in cotyledon stage, no root
子叶期生长受到抑制,无根
Growth inhibition in cotyledon stage, no root
子叶生长受到抑制,无根
Growth inhibition in cotyledon stage, no root
萌发受抑制
Inhibition of germination
萌发受抑制
Inhibition of germination
萌发受抑制
Inhibition of germination
萌发受抑制
Inhibition of germination
萌发受抑制
Inhibition of germination
生长正常,长势很好
Normal growth, good
呈蓝色，而对照野生型植株却没有出现蓝色，并且实
验发现染色时经过真空抽虑且用酒精脱色几次后染
色效果较好，用肉眼可直接观察，结果可以初步证明
转基因的成功(图 8)。
2.4.3 PCR检测
CTAB 法将筛选出来的 T1代拟南芥植株的少
量叶片提取基因组 DNA并进行 PCR检测，结果显
示 70%以上的植株出现大小约为 1.2 kb 的特异性
条带，部分检测结果如图 9所示。初步表明 PMI基
因已经整合到拟南芥基因组，并且 T-DNA插入植
物基因组的顺序一般是从左边界到右边界，而 PMI
基因位于 T-DNA的右边界位置，且 PMI基因不存
黑暗条件下培养 4~5 d后，如培养基仍呈红色或紫
色，说明材料没有 PMI活性；如培养基呈黄色或桔红
色，则说明材料中有活性 PMI存在。选取转基因拟南
芥叶片用于显色反应，部分显色图如图 7所示，通过
颜色的反应，可以估计是不是转基因植株。红色或紫
色表明没有酶活性，黄色或橘黄色表明 PMI活性。经
CPR法染色后出现黄色或桔红色的植株分别为 35S
45株、AmCBL1P 30株。
2.4.2 GUS组织化学法测定
对筛选出的转基因 T1代植株幼苗进行 GUS组
织化学染色检测，结果发现经过 T0代 CPR法显色反
应得到的阳性植株经过 GUS染色后几乎所有的都
甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用
Establishment of Positive Selection System ofMannose and Application of Genetic Transformation in Arabidopsis 1126
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
化细胞生长的碳源，因此转基因植株表现为更加突出
的生长优势。而非转化植株由于缺乏 PMI基因的表
达，因而不能利用甘露糖作为碳源，作为筛选剂的甘
露糖在体内己糖激酶的催化下转化为不能被细胞进
一步代谢利用的 6-磷酸甘露糖，并且其积累到一定
程度时就会影响细胞的正常生长代谢如抑制糖酵解
(Reed et al., 2001)，并导致 ATP新陈代谢受阻和磷酸
根离子的大量消耗，从而生长受到抑制(Joersbo et al.,
1999)，但它不会出现坏死细胞，释放有毒物质导致植
物致死，而只是使非转基因植株处于饥饿状态。PMI
基因编码的产物安全，筛选剂价格低廉，筛选程序简
单，能够高效安全的起到筛选作用，并且不影响转化
植物代谢平衡，对生态环境和食用安全性问题影响
极小，因此 PMI/甘露糖筛选系统现在越来越受到人
们的关注。
以大肠杆菌 PMI为筛选标记的甘露糖筛选体系
自 Joersbo等(1998)首次在甜菜转基因中报道后，已
经陆续在不少单子叶植物和双子叶植物上取得了成
功，PMI已经成为了一种新的选择标记基因。但是不
同植物对所需的甘露糖筛选压最适浓度差别很大，
对总碳源量及配比的要求也不相同，为了获得最佳
选择压力，有的需要在选择培养基中混合使用甘露
糖和其他糖类(如蔗糖、葡萄糖等)。Negrotto等(2000)
转化玉米时筛选培养基中碳源的最佳组合为 10 g/L
甘露糖+5g/L蔗糖；Lucca等(2001)转化水稻时，采用
甘露糖浓度不变(30g/L)，而蔗糖浓度由 30 g/L逐次
递减至 5 g/L；Todd和 Tague (2001)转化拟南芥时用
的碳源只有甘露糖浓度为 2 mmol/L；Kim 等(2002)
转化辣椒时筛选培养基中碳源最佳组合为 20 g/L蔗
图 7转基因拟南芥氯酚红显色反应
注: 1:非转基因叶片; 2~7:转基因拟南芥的叶片;红色表明没
有 PMI活性,黄色表明具有 PMI活性
Figure 7 Chlorophenol-red (CPR) assay of transgenic Arabidopsis
thaliana
Note: 1: Control leaves (non-transgenic plant); 2~7: Leaves of tr-
ansgenic Arabidopsis thaliana, red indicates no activity of en-
zyme, yellow indicates activity of phosphomannose-isomerase
enzyme
图 8转基因拟南芥 GUS染色反应
注: A~E:转基因植株; F:非转基因植株
Figure 8 GUS assay of transgenic Arabidopsis thaliana plant
Note: A~E: transgenic Arabidopsis thaliana plant, F: non-trans-
genic plant
在于拟南芥基因组中，因此可以断定表达载体已成功
转入拟南芥中。
3讨论
PMI/ 甘露糖筛选体系在拟南芥转化中成功应
用，在 PMI转基因植物中，PMI (manA)基因编码 6-
磷酸甘露糖转移酶，在其催化作用下 6-磷酸甘露糖
可转化为 6-磷酸果糖，6-磷酸果糖可经糖酵解途径
被细胞利用(Reed et al., 2001)，从而使甘露糖作为转
图 9转基因拟南芥的 PCR检测结果
注: 1~6:转基因拟南芥植物; 7:阴性对照; 8~10:阳性对照,分
别为质粒 Ppmi; PCAMBIA1301-PMI-35S-AmCBL1-nos; PC-
AMBIA1301-PMI-AmCBL1P-AmCBL1-nos
Figure 9 PCR analysis of transgenic plants
Note: 1~6: Transgenic Arabidopsis thaliana plant; 7: Negative
control; 8~10: Positive control, plasmid Ppmi; PCAMBIA1301-
PMI-35S-AmCBL1-nos ; PCAMBIA1301-PMI-AmCB-L1P-A-
mCBL1-nos
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.0011201127
糖+15 g/L甘露糖；彭世清和陈守才(2005)在转化樱
桃番茄 AV6时，MS基本培养基中添加的碳源为甘
露糖浓度 3 g/L左右，蔗糖为 30 g/L；在转化甘蔗时，
Jain等(2007)在筛选培养基中添加的碳源为甘露糖
浓度 3 g/L，蔗糖为 20 g/L。本实验最终确定MS培养
基添加糖源甘露糖浓度为 4 mmol/L，这是因为在试
验过程中用 2 mmol/L甘露糖筛选时筛选效果不明
显，且存在的假阳性比例太大，而如果浓度过大又会
对植物的生长出现抑制作用，并且在实验时发现如果
在培养基中适量添加蔗糖会对甘露糖的抑制起缓解
作用，这与 Todd和 Tague (2001)的结论一致。本实验
认为最佳的筛选时间为 10 d左右，时间长了即使是长
势好的也会慢慢出现黄化。这是因为刚开始在筛选压
下，即使是阳性植株也不可能完全抵抗甘露糖，只有
经过几轮的筛选得到纯合体才能真正成为抗性苗。
甘露糖筛选的转化效率因不同植物而存在差异
性，即使是同一种系的不同品种也有很大差别，并且
不同的转化方式也对转化率存在很大影响。本实验使
用甘露糖阳性筛选系统得到的阳性筛选率达到了
54%~60%，而 Todd和 Tague (2001)在实验中得到的
转化效率仅为 2.5%。而在其他植物中也都各自不同，
如 Negrotto等(2000)转化玉米转化率为 30%；Wright
等(2001)用于农杆菌转化玉米和小麦转化率分别高达
45%和 20%以上；Boscariol等(2003)转化甜橙时转化
率为 3%~23.8%；Degenhardt 等(2006)用农杆菌转化
苹果外植体时转化率达到 24%；Jain转化甘蔗时转化
率高达 56% (Jain et al., 2007)；Ballester等(2008)在转
化两种不同的柑橘最高转化率分别达到 30%和
13%。本实验中除了应用常规的 GUS染色法还应用
氯酚红法来检测阳性植株，这种方法操作简单、结果
直观，不仅可以检测外源基因的导入，在筛选初期报
告外源基因的整合,同时可以说明基因在植株体内获
得表达，可以在早期筛选转化植株，并且这种方法已
成功应用于很多植物中，如玉米(Wright et al., 2001)、
小麦(Wright et al., 2001)、甜橙(Boscariol et al., 2003)、
苹果 (Degenhardt et al., 2006)、柑橘 (Ballester et al.,
2008)中，氯酚红检测阳性植株颜色反映从黄色到橙
色的不同深度可能与 PMI基因插入位点及插入拷贝
数有关(Degenhardt et al., 2006)。
本研究建立了 PMI/甘露糖安全性筛选系统，再
次证明了不用抗生素和除草剂的这种筛选体系的成
功应用，为转基因拟南芥筛选提供了更加安全有效
的方法，并分别将两种不同启动子调控下的沙冬青
AmCBL1基因构建到含 PMI标记的安全性表达载体
中，为进一步研究 AmCBL1基因的功能提供了安全
性前提。AmCBL1P是从具有高抗逆性的沙冬青中克
隆得到的，是对应于 AmCBL1基因的自身启动子，推
测 AmCBL1P是一个诱导型启动子，受多种逆境因
子和激素的诱导。构建两种不同的启动子来调控基
因就可以在后续的研究中对诱导型启动子驱动基因
表达与 CaMV35S组成型启动子进行比较检测两种
启动子作用方式的差异并进一步探讨目的基因的功
能，对提高植物抗逆性具有重要的科学意义。本试验
已成功获得了转基因植株，有关基因功能的验证正
在进行，并在探讨以 PMI为筛选标记的筛选体系在
其它不同的植物如木本植物杨树中的应用。
参考文献
Ballester A., Cervera M., and Pe觡A L., 2008, Evaluation of selec-
tion strategies alternative to nptⅡ in genetic transformation
of citrus, Plant Cell. Rep., 27(6): 1005-1015
Boscariol R.L., Almeida W.A.B., Derbyshire M.T.V.C., Mourao
Filho F.A.A., and Mendes B.M.J., 2003, The use of the PMI/
mannose selection system to recover transgenic sweet or-
ange plants (Citrus sinensis L. Osbeck), Plant Cell Rep., 22
(2): 122-128
Cheong Y.H., Kim K.N., Pandey G.K., Gupta R., Grant J.J., and
Luan S., 2003, CBL1, a calcium sensor that differentially
regulates salt, drought, and cold responses in Arabidopsis,
The Plant Cell, 15: 1833-1845
Degenhardt J., Poppe A., Montag J., and Szankowski I., 2006,
The use of the phosphomannose-isomerase/mannose selec-
tion system to recover transgenic apple plants, Plant Cell
Rep., 25(11): 1149-1156
He Z., Fu Y., Si H., Hu G.C., Zhang S., Yu Y., and Sun Z., 2004,
Phosphomannose isomerase gene as a selectable marker for
rice transformation via Agrobacterium, Plant Science, 166
(1): 17-22
Jain M., Chengalrayan K., Abouzid A., and Gallo M., 2007,
Prospecting the utility of a PMI/mannose selection system for
the recovery of transgenic sugarcane (Saccharum spp. hybrid)
plants, Plant Cell Rep., 26(5): 581-590
Joersbo M., Donaldson I., Kreibeg J., Petersen S.G., Brunstedt J.,
and Okkels F.T., 1998, Analysis of mannose selection used
for transformation of sugar beet, Molecular Breeding, 4 (2) :
111-117
Joersbo M., Mikkelsen J.D., and Brunstedt J., 2000, Relationship
between promoter strength and transformation frequencies
using mannose selectionfor the production of transgenic sug-
ar beet, Molecular Breeding, 6(2): 207-213
Joersbo M., PetersenS.G., and OkkelsS.G., 1999, Parameters in-
甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用
Establishment of Positive Selection System ofMannose and Application of Genetic Transformation in Arabidopsis 1128
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
teracting with mannose selection employed for the produc-
tion of transgenic transgenic sugar beet, Physiologia Plan-
tarum, 105(1): 109-115
Kim J.Y., Jung M., Kim H.S., Lee Y.H., Choi S.H., Lim Y.P.,
Min B.W., Yang S.G., and Harn C.H., 2002, A new selec-
tion system for peppre regeneration by mannose, J. Plant
Biotechnol., l4(3): 129-134
Lee B.T., and Matheson N.K., 1984, Phosphomannoisomerase
and phosphoglucoisomerase in seeds of Cassia coluteoides
and some other legumes that synthesize galactomannan,
Phytochemistry, 23(5): 983-987
Lucca P., Ye X.D., and Potrykus I., 2001, Effective selection and
regeneration of transgenic rice plants with mannose as selec-
tive agent, Molecular Breeding, 7(1): 43-49
Negrotto D., Jolley M., Beer S., Wenck A.R., and Hansen G.,
2000, The use of phosphomannose-isomerase as a selectable
marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via
Agrobacterium transformation, Plant Cell Rep., 19 (8):
798-803
Peng S.Q., and Chen S.C., 2005, A novel selection system for toma-
to transformation by mannose, Nongye Shengwu Jishu Xue-
bao (Journal of Agricultural Biotechnology), 13(2): 141-144
(彭世清,陈守才, 2005,甘露糖阳性选择系统的建立及在
番茄转化中的应用,农业生物技术学报, 13(2): 141-144)
Reed J., Privalle L.S., Powell M.L., Meghji M., Dawson J., Dun-
der E., Suttie J., Wenck A., Launis K., Kramer C., Chang Y.
F., Hansen G., and Wright M., 2001, Phosphomannose iso-
merase: an efficient selectable marker for plant transforma-
tion, In Vitro Cell Dev. Biol. Plant, 37: 127-132
Todd R., and Tague B.W., 2001, Phosphomannose isomerase: A
versatile selectable marker for Arabidopsis thaliana germ-line
transformation, Plant Mol. Biol. Rep., 19: 307-319
Wang A.S., Evans R.A., Altendorf P.R., Hanten J.A., Doyle M.C.,
and Rosichan J.L., 2000, A mannose selection system for
production of fertile transgenic maize plants from protoplasts,
Plant Cell Rep., 19(7): 654-660
Weisser P., Kramer R., and Sprenger G.A, 1996, Expression of
the Escherichia coli pmi gene, encoding phosphomannosei-
somerase in Zymomonas mobilis, leads to utilization of man-
nose as a novel growth substrate, which can be used as a se-
lective marker, Applied and Environmental Microbiology,
62(11): 4155 -4161
Wright M., Dawson J., Dunder E., Suttie J., Reed J., Kramer C.,
Chang Y., Novitzky R., Wang H., and Artim-Moore L., 2001,
Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and
wheat (Triticum aestivum L.) using the phosphomannose i-
somerase gene, pmi, as the selectable marker, Plant Cell
Rep., 20(5): 429-436
Yue J.X., Meng Z.H., Zhang L.H., Han S.J., Lin Q.T., and Wang
W., 2005, Cotton transformation with mannose as selective
agent, Mianhua Xuebao (Cotton Sicence), 17(1): 3-7 (岳建
雄,孟钊红,张炼辉,韩少杰,林亲铁,王巍, 2005,以甘露
糖作为筛选剂的棉花遗传转化,棉花学报, 17(1): 3-7)
Zhang P., Potrykus I., and Puonti J.K., 2000, Efficient production
of transgenic cassava using negative and positive selection,
Transgenic Res., 9: 405-415
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.007.0011201129