全 文 ：第4 1卷第 3期 上海师范大学学报(自然科学版) Vol ． 41，No． 3
2 0 1 2 年 6 月 Journal of Shanghai Normal University(Natural Sciences) Jun ． ，2 0 1 2
拟南芥雄性不育突变体 pmi1 的遗传与定位
张 昉，王 哲，高 贝，司英语，周树敏，张 卫*
(上海大学 上海市能源作物育种及应用重点实验室，上海 200444)
摘 要:通过甲基磺酸乙酯(简称 EMS)诱变拟南芥 Col － 0 种子获得一株隐形雄性不育突变
体 pollen mitosis 1，pmi1．遗传分析结果显示突变体为配子体遗传．细胞学观察发现突变体花粉
粒发育出现异常:细胞塌陷，细胞核在单核靠边期后和花粉第一次有丝分裂(简称 PMI)前的
时间段发生降解．通过图位克隆方法将该基因定位在分子标记 T19L18 和 T1D16 之间，物理距
离 55Kb．测序分析证明这 55Kb区间中的 ERECTA基因的编码区在 3067bp的位置发生单碱基
替换，C /G变为 A /T．由此说明 ERECTA基因在拟南芥从单核小孢子到二细胞花粉的发育过程
中起着重要作用．
关键词:花粉粒;雄性不育;PMI;图位克隆
中图分类号:Q 344 文献标识码:A 文章编号:1000-5137(2012)03-0319-06
收稿日期:2012-03-26
基金项目:上海市教委浦江人才计划(08PJ1405500) ;国家自然科学基金面上项目(30870225)
作者简介:张 昉(1987 －) ，男，上海大学生命科学学院硕士研究生;张 卫(1966 －) ，男，博士，上海大学生命科学
学院教授．
* 通信作者
0 引 言
开花植物的雄配子发育是依赖于在花粉粒第一次有丝分裂(Pollen Mitosis I，PMI)．这次分裂导致花
粉粒内产生两个大小不一的细胞，大的为营养细胞(Vegetative Cell，VC) ，小的为生殖细胞(Generative
Cell，GC)． VC存储了丰富的代谢产物、大多数的质体和线粒体，而 GC缺乏代谢储备和一些细胞器． PMI
之后，两个子细胞便进入了不同的发育轨道，涉及细胞周期的不同调控、核染色质浓缩，并激活配子专有
基因［1 － 2］．
在真核生物中存在一个多元化和广泛的真核家族，由富含亮氨酸重复蛋白(Leucine-Rich Repeat
Proteins，LRRs)组成，这些蛋白一级结构中存在一些由短的富含亮氨酸的基序重复串联而成的不同大小
的结构域．在植物中，各种各样的 LRR 家族在许多重要的生理和发育调控途径中发挥着作用［3］． 例如
LRR类受体激酶家族(LRR-RLK)中［4 － 5］，EXTRA SPOROGENOUS CELL /EXCESS MICROSPOROCYTES1
(EXS /EMS1)基因调控花原基的细胞数目，而 ERECTA(ER)子家族(ER，ERL1 and ERL2)、MPK3 和
MPK6 被证实在花药发育早期的细胞分化作用中是冗余的［6］． 另外 RECEPTOR PROTEIN KINASE2
(RPK2)也影响着花药的发育，其突变体表现为雄性不育［7］．
在这里，发现一个拟南芥雄性不育突变体 pmi1 是从 EMS 诱变拟南芥生态型 Col － 0 所得突变体库
中筛选得到的．经亚历山大染色发现花粉粒不育，电镜结果显示花粉粒细胞塌缩，后经 4，6 －联脒 － 2 －
苯基吲哚(DAPI)染色发现花粉粒发育停滞在 PMI 之前，无法形成二细胞花粉．通过基因分析，pmi1 的
表型是由单隐性基因控制．在本研究中，突变的基因位点已被找到，位于 LRR-RLK基因家族 ERECTA基
因位点上，突变导致 ERECTA中 435 位的丝氨酸变为苯丙氨酸．本研究结果表明，ERECTA 基因不仅控
制花药发育早期的细胞分化，而且在晚期的花粉粒发育过程中也发挥着作用．
上海师范大学学报(自然科学版) 2012 年
1 材料与方法
1． 1 植物材料
实验中采用的植物包括拟南芥 Columbia 和 Lansberg erecta 两种生态型．植物生长于人工光照培养
间，22℃，16h光照，8h黑暗．营养液采用“花无缺”(上海永通华工有限公司生产) ，并按说明书进行稀
释．突变体 pmi1 是由本实验室用 EMS诱变 Col － 0 获得的雄性不育株系．
1． 2 方 法
1． 2． 1 图位克隆
突变体和拟南芥 Lansberg生态型杂交后得到 F1 代，F1 代自交后产生的 F2 代中大约 150 株具有突
变体表型的植株被用来定位基因．克隆基因的方法参见 Zhang 等［8］．定位所用分子标记见 amp． genom-
ics． org． cn网站．
1． 2． 2 植物 DNA抽提
植物基因组 DNA的抽提方法参照 Xin等［9］的方法．
1． 2． 3 亚历山大染色［10］
取完全打开的花苞在固定液(60%甲醇，30%氯仿，1%的 2，4，6 三硝基苯酚，1%氯化汞)中常温固
定 24h．用 70%、50%、30%的酒精各自脱水 30 min 后用水洗 2 次． 然后将材料放在亚历山大染色液
(9． 5%乙醇，25%甘油，4%醋酸，0． 01%孔雀绿，0． 05%的酸性品红，0． 005%的橙黄 G)中 45℃24h． 最
后于 DM2500 显微镜下进行观察．
1． 2． 4 扫描电子显微镜观察
将花粉散在粘有导电胶的铜台上，经过喷金处理后，在 JSM － 6700F 冷场发射扫描电子显微镜下
观察．
1． 2． 5 DAPI染色
把花药放置在载玻片上，滴上 DAPI 染液(Sodium Phosphate． 1 × 105mol /L，EDTA 1 × 103mol /L，
Triton X － 100 0． 1%) ，压片放置在 DM2500 荧光显微镜下进行观察．
1． 2． 6 基因测序
将突变位点附近的 ERECTA基因组序列分两段克隆到 pMD19 － T 载体(TAKARA 公司生产)上，送
到上海美吉生物医药科技有限公司完成测序．
2 结 果
2． 1 突变体 pmi1 的表型分析
突变体 pmi1 是从拟南芥野生型 Col － 0 的 EMS突变体库中筛选得到，与 Col － 0 回交后其表型在 F2
代中能够稳定遗传．与野生型 Col －0相比，pmi1的株型更像 Landsberg，节间缩短，果荚短小而空扁，完全不
育(图 1A)．经亚历山大染色后发现，与野生型红色的花粉粒相比，突变体花粉粒完全为蓝色(图 1B) ，而正
反杂交的实验证明其雌蕊是完全可育．这表明突变体 pmi1的不育表型是由其花粉粒所引起的．
接着又用扫描电镜(图 2)对 pmi1 的花粉粒进行了观察，发现与野生型相比，pmi1 的花粉粒像泄气
的皮球一样塌陷，而花粉壁正常． 所以，pmi1 的花粉粒不育可能与绒毡层无关，而是核的原因． 进而对
pmi1 的纯合子(图 3)和杂合子 DAPI染色(图 4)后发现，纯合子无法形成二细胞花粉，而在对照组杂合
子中不仅有二细胞花粉，甚至有三细胞花粉．所以，有缺陷的花粉粒发育停滞在单核靠边期之后，PMI 发
生之前．
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第 3 期 张 昉，王 哲，高 贝，等:拟南芥雄性不育突变体 pmi1 的遗传与定位 123
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2． 2 突变体 pmi1 的遗传分析
把 pmi1 突变体做母本与野生型杂交，F1 代表现为野生型表现，说明突变体表型是由隐形基因控制
的．在 829 株 F2 代植株中，74 株表现为不育，不符合传统的孟德尔遗传比例，这说明该基因可能导致突
变型配子体不育．
2． 3 突变体 pmi1 的基因定位
通过图位克隆方法来定位 pmi1 的突变基因，克隆所需的 marker 为网站(amp． genomics． org． cn)上
所提供的拟南芥生态型 Columbia与 Landsberg之间的多态性 marker．首先选用 19 对在拟南芥基因组均
匀分布的分子标记(表 1)进行粗定位，PCR结果显示突变基因与 2 号染色体的 nga1126 连锁(图 5A)．
之后利用新设计的分子标记(表 2)将基因 pmi1 定位在第 2 条染色体上 T19L18 与 T1D16 之间 55Kb 区
间内(图 5A)．接着，本文作者便设计引物(表 3)对这一区间的 ERECTA基因位点进行了测序，测序结果
与网站(www． arabidopsis． com)上的野生型序列比对后发现在该基因的 3067 位 C /G变为 A /T(图 5B) ，
即蛋白序列 435 位丝氨酸突变为苯丙氨酸．
(A)pmi1 突变位点分子标记连锁物理图谱;(B)pmi1 突变位点的测序结果
图 5 pmi1 突变位点分子标记连锁和测序结果
表 1 粗定位的分子标记
分子标记 上游引物 下游引物
nga63 ACCCAAGTGATCGCCACC AACCAAGGCACAGAAGCG
ciw12 AGGTTTTATTGCTTTTCACA CTTTCAAAAGCACATCACA
nga280 GGCTCCATAAAAAGTGCACC CTGATCTCACGGACAATAGTGC
nga111 TGTTTTTTAGGACAAATGGCG CTCCAGTTGGAAGCTAAAGGG
ciw2 CCCAAAAGTTAATTATACTGT CCGGGTTAATAATAAATGT
ciw3 GAAACTCAATGAAATCCACTT TGAACTTGTTGTGAGCTTTGA
nga1126 GCACAGTCCAAGTCACAACC CGCTACGCTTTTCGGTAAAG
nga168 GAGGACATGTATAGGAGCCTCG TCGTCTACTGCACTGCCG
nga162 CTCTGTCACTCTTTTCCTCTGG CATGCAATTTGCATCTGAGG
ciw11 CCCCGAGTTGAGGTATT GAAGAAATTCCTAAAGCATTC
ciw4 GTTCATTAAACTTGCGTGTGT TACGGTCAGATTGAGTGATTC
nga6 ATGGAGAAGCTTACACTGATC TGGATTTCTTCCTCTCTTCAC
ciw5 GGTTAAAAATTAGGGTTACGA AGATTTACGTGGAAGCAAT
ciw7 AATTTGGAGATTAGCTGGAAT CCATGTTGATGATAAGCACAA
nga1107 CGACGAATCGACAGAATTAGG GCGAAAAAACAAAAAAATCCA
ciw8 TAGTGAAACCTTTCTCAGAT TTATGTTTTCTTCAATCAGTT
ciw9 CAGACGTATCAAATGACAAATG GACTACTGCTCAAACTATTCGG
ciw10 CCACATTTTCCTTCTTTCATA CAACATTTAGCAAATCAACTT
Mi310 GGCCCAAGAAGCCCACAACAC ACTTCATCACTTGCGGGACTG
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第 3 期 张 昉，王 哲，高 贝，等:拟南芥雄性不育突变体 pmi1 的遗传与定位
表 2 精细定位的分子标记
分子标记 上游引物 下游引物
F3P11 CTATGACCAGTTGTACCAATG CGACCACATACCACTTCAA
F3N11 TCTGAGACTGAGACTCCATT TACTGTCGCCATCAAGGT
T19L18 TTATGGAGTTAGGTGTTCCT GTCTCTCCCTCTCAATAGC
T1D16 CAGAAAATCTGGAGAGAGA TTATGGAGTTAGGTGTTCCT
nga361 ACATATCAATATATTAAAGTAGC AAAGAGATGAGAATTTGGAC
T6A23 AGAAGATGACTCAAGCAAGA CAGAATCCTACGGACAACA
F12L6 ACTTCTCTCACAACTCTCTC TTCAGTAGTGGTTCTCGTT
表 3 pmi1 测序引物
引物 上游引物 下游引物
Erecta － 1 CGCGGATCCGGTTATGTGTAGCAGATGTTG GAAGTGAAGAGAAGGTTGGT
Erecta － 2 TGATGAGATTGGTGACTGTT ACGCGTCGACTCACGCGCTGTATGAGTTC
Erecta － 3 CACCGGTTATGTGTAGCAGATGTTG GAAGTGAAGAGAAGGTTGGT
Erecta － 4 TGATGAGATTGGTGACTGTT TCACGCGCTGTATGAGTTC
3 讨 论
通过对 pmi1 遗传分析表明，pmi1 不符合经典孟德尔遗传定律，因此该基因的功能应该和配子体发
育有关．接着，电子显微镜实验也证实了突变体的花粉粒外壁正常，是核发生了降解．通过 DAPI 染色观
察，本研究发现 pmi1 花粉粒核的降解发生在单核靠边期之后 PMI之前．因此，ERECTA基因可能参与了
花粉粒的不对称的第一次有丝分裂，当然这还需要进一步研究证实．
利用图位克隆技术将 pmi1 的突变基因定位于第 2 条染色体上 T19L18 与 T1D16 之间 55Kb 范围
内．而此区间内的 ERECTA 基因与拟南芥 Landsberg 的株型有着直接的联系，并且前人的研究证实
ERECTA与花药发育早期的细胞分化作用有关［6］，所以便对突变体的 ERECTA基因序列进行测序，测序
结果发现该基因的 3067 位 C /G变为 A /T．
ERECTA属于 LRR-RLK蛋白，含有一个细胞质蛋白激酶催化结构域，一个跨膜区，和一个外富含亮
氨酸重复．已被证实的是，它参与了叶片表皮细胞的不对称分裂从而产生气孔复合体［11］，并与茎尖分生
组织的器官特化有关［11］．所以本文作者猜想，正如 LRR-RLK 家族的蛋白一样，富含亮氨酸重复的结构
域识别胞外信号，随后细胞质蛋白激酶催化结构域响应信号启动了胞内信号途径，从而使得花粉粒进
入 PMI．
参考文献:
［1］ TANAKA． Differentiation of generative and vegetative cells in angiosperm pollen ［J］． Sex Plant Reprod，1997，10
(1):1 － 7．
［2］ TWELL D，PARK S K，LALANNE E． Asymmetric division and cell-fate determination in developing pollen［J］． Trends
Plant Science，1998，3(8):305 － 310．
［3］ VERNON D M，FORSTHOEFEL N R． Leucine-rich repeat proteins in plants:diverse roles in signaling and development
［M］∥PANDALI S G． Research signpost:recent research developments in plant biology．India:Trivadrum，2002．
［4］ MORRIS E R，WALKER J C． Receptor-like protein kinases:the keys to response ［J］． Curr Opin Plant Biol，2003，6
(4):339 －342．
323
上海师范大学学报(自然科学版) 2012 年
［5］ SMET I D，VOSS U，JURGENS G，et al． Receptor-like kinases shape the plant［J］． Nat Cell Biol，2009，11(10):1166
－ 1173
［6］ HORD C L，SUN Y J，PILLITTERIE L，et al． Regulation of Arabidopsis early anther development by the mitogen-activated
protein kinases，MPK3 and MPK6，and the ERECTA and related receptor-like kinases［J］． Molecular Plant，2008，1(4):
654 － 658．
［7］ MIZUNO S，OSAKABE Y，MARUYAMA K，et al． Receptor-like protein kinase2 (RPK2)is a novel factor controlling anther
development in Arabidopsis thaliana［J］． The Plant Journal，2007，50(5):751 － 766．
［8］ ZHANG W，SUN Y J，TIMOF EJEVA L，et al． Regulation of Arabidopsis tapetum development and function by DYSFUNC-
TIONAL TAPETUM1 (DYT1)encoding a putative bHLH transcription factor ［J］． Development，2006，133(6):3085
－ 3095．
［9］ XIN Z G，VELTEN J P，OLIVER M J． High-throughput DNA extraction method suitable for PCR［J］． Biotechniques，
2003，34(4):1 － 6．
［10］ 韦嘉励，周树敏，袁晓君，等．遗传定位一个花粉发育相关的拟南芥新基因 SPG1［J］．上海师范大学学报:自然科
学版，2011，40(5):522 － 527．
［11］ ZANTEN M V，BASTEN L S，MARCEL C G，et al． The many functions of ERECTA［J］． Trends in Plant Science，2009，
14(4):214 － 218．
Identification of arabidopsis male sterile mutant pmi1
ZHANG Fang，WANG Zhe，GAO Bei，SI Ying-yu，ZHOU Shu-min，ZHANG Wei*
(Shanghai Key laboratory of bio-energy crops，Shanghai University，Shanghai 200444，China)
Abstract:An Arabidopsis male sterile mutant pollen mitosis 1，pmi1 was obtained through ethyl methane sulfonate (EMS)muta-
genesis on wild type accession Col － 0． Genetic analysis indicated that the male sterility phenotype of the mutant was inherent
through gametophyte． Cytological observation suggested that the development of mutant pollen was abnormal，and its nucleus de-
graded before it entered into pollen mitosis I stage (PMI)． Map-based cloning using F2 population from the crossing between the
pmi1 and wild type Ler had localized the impaired gene PIM1 to the chromosomal region between two molecular markers，T19L18
and T1D16 which are 55Kb apart． A single base substitution was found at the 3067bp locus of ERECTA open reading frame in this
55Kb region． Taken together，our results suggested the ERECTA gene might play an important role in the development progress
from uninucleate microspore to binucleate pollen in Arabidopsis．
Key words:pollen;male sterile;PMI;map-based cloning
(责任编辑:顾浩然)
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