全 文 ：书抗逆转录因子在百脉根中的功能分析
陶飞１，２，马江涛２，唐益雄２，李京生３，卢运明３，徐秉良１，吴燕民２
（１．甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 甘肃省草业工程实验室 中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，
甘肃 兰州７３００７０；２．中国农业科学院生物技术研究所，北京１０００８１；３．深圳市农科集团有限公司，广东 深圳５１８０４０）
摘要：为提高豆科牧草百脉根抗旱方面的能力，从沙生植物胡杨和铃铛刺中克隆了４个抗逆转录因子基因并进行
功能分析，从中筛选了２个具有抗旱特性的基因犘犲犇犚犈犅２犪和犎犺犈犚犉２，构建了以磷酸甘露糖异构酶为筛选标记
的单、双价植物表达载体，转化百脉根Ｌｅｏ品种，结果表明，转录因子基因明显改善了百脉根的抗旱特性，经过抗旱
复水试验证明转基因百脉根成活率达到１００％。
关键词：百脉根；转录因子；磷酸甘露糖异构酶（ＰＭＩ）；抗旱；转基因
中图分类号：Ｓ８１６；Ｑ９４５．７８　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０３０２５００９
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０３３３　　
　　百脉根（犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊）别名牛角花，是豆科百脉根属多年生牧草，原产于欧亚温暖地区，目前在世界各
地广泛种植［１］。作为优良饲草，百脉根营养含量居豆科牧草的首位，成熟收种后蛋白质含量可达１７．４６％［２］。含
皂素低，适口性好，耐牧性强，不会引起家畜膨胀病，为一般豆科牧草所不及［３，４］。同时，由于园林绿地一般都缺
乏根瘤菌，而根瘤菌侵入百脉根根毛具有共生固氮作用，有利于植株的生长发育，增加土壤肥力，改良盐渍化土
地［５］。所以百脉根也是建立人工草地、补播改良草场和建立人工放牧地的不可多得的牧草品种。近年从加拿大
引进的品种里奥（Ｌｅｏ），抗寒性强，但其耐旱耐盐特性较差，难以适应国内部分地区的不良环境［６］。
与干旱盐碱胁迫相关的基因，按其功能可分为两大类：一类是功能性基因，其基因表达产物直接进行抵御外
界环境胁迫。此类基因主要包括，参与水分跨膜的水通道蛋白（如：犕犻狆）；合成各种渗透调节所需的酶（如：可溶
性糖狅狋狊犃／犅、犜犘犛１、狊犪犮犅，脯氨酸合成酶基因犘５犮狊，甜菜碱合成关键酶犅犃犇犎、犆犕犗基因；多胺合成酶犗犱犮、犃犱犮
等）；保护大分子和膜的蛋白（如：ＬＥＡ蛋白 犎犃犞１、犕犈犾犲犪犖４、犚犃犅２１、犇１１）；蛋白质转换蛋白酶（狋犺犻狅犾蛋白
酶、犮犾狆蛋白酶和泛素等基因）；另一类是调控性基因，其在植物胁迫响应过程中调控信号传导和基因表达。调控
过程中主要包括２种相关蛋白参与，一种是信号传导相关蛋白，如Ｃａ２＋结合蛋白（钙调蛋白犆犪犕狊、钙调神经磷酸
酶Ｂ相关蛋白犆犅犔狊和Ｃａ２＋依赖蛋白激酶犆犇犘犓狊等）、细胞周期蛋白激酶（犕犃犘犓 和犕犃犘犓犓犓）和磷脂酶Ｃ
等；另一种是调控胁迫相关基因转录的蛋白，如犫犣犐犘转录因子、犈犚犉和犇犚犈犅 转录因子等［７，８］。
抗逆相关转录因子可以与下游多个相关基因结合，并激活促其表达。现已从大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）、玉米（犣犲犪
犿犪狔狊）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）等植物中克隆出多种犇犚犈犅和犈犚犉 类转录因子新基因。
对转化的拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）、水稻、马铃薯
（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）等植物进行抗旱耐盐生理生化检测，发现犇犚犈犅和犈犚犉 类转录因子较常规功能基因明显
提高了转基因植物对外界非生物胁迫的耐受性［９］。近年来，由于遗传转化技术在牧草方面的应用日趋成熟，利用
转录因子来改良牧草抗逆性成为一个重要发展方向［１０］。Ｚｈａｏ等［１１］为了改良高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犲犾犪狋犪）的耐旱特
性，将拟南芥犇犚犈犅１犃／犆犅犉３基因转化到高羊茅中，证明犇犚犈犅１犃／犆犅犉３激活了下游胁迫相关基因的表达，增
强了高羊茅的耐旱性。江腾等［１２］利用生物信息学方法分析发现犠犚犓犢 转录因子广泛参与植物的抗病、抗旱等
逆境的调控。Ｊｉｎ等［１３］通过转化获得带犌犿犇犚犈犅１的转基因紫花苜蓿，使苜蓿耐盐性提升到４００ｍｍｏｌ／Ｌ，为对
２５０－２５８
２０１３年６月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２２卷　第３期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３
收稿日期：２０１２０２１７；改回日期：２０１２０３１９
基金项目：“９７３”项目（２００７ＣＢ１０８９０２２）资助。
作者简介：陶飞（１９８６），男，甘肃临夏人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｓｋｙｆｉｔ１９８５＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｘｕｂｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；Ｗｕｙｍ６５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
照植株的２倍。但到目前为止，抗逆相关转录因子在牧草改良上的应用报道还是较少，因此，在这个领域探索的
空间比较大。
本试验以筛选出的犎犺犈犚犉２（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＦＪ０３２３６２）、犘犲犇犚犈犅２犪（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＥＦ５９７４９９）为目
的基因在载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２的基础上，拟构建ｒｄ２９Ａ：：犘犲犇犚犈犅２犪、ｒｄ２９Ａ：：犎犺犈犚犉２和 犘犲犇犚犈犅２犪：：
犎犺犈犚犉２三种单、双价安全型植物表达载体，用正向的选择标记狆犿犻代替传统的抗生素，通过农杆菌介导法转
化百脉根，研究由抗逆转录因子介导的百脉根的抗旱性。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　基因材料　本研究所用基因是从沙生植物胡杨（犘狅狆狌犾狌狊犲狌狆犺狉犪狋犻犮犪）和铃铛刺（犎犪犾犻犿狅犱犲狀犱狉狅狀犺犪犾狅
犱犲狀犱狉狅狀）中克隆的２个转录因子基因：犘犲犇犚犈犅２犪和犎犺犈犚犉２，均为本实验室所克隆并保存。
１．１．２　植物材料　百脉根：栽培品种里奥“Ｌｅｏ”，市售。
１．１．３　菌株与载体　大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）菌株ＤＨ５、Ｔｏｐ１０购于北京全式金生物技术有限公司，根癌农
杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）菌株ＬＢＡ４４０４和植物表达载体狆犜４犃均为本实验室保存，克隆载体犘犝犆１９、
狆犕犇１９犜 购于北京六合通经贸有限公司。
１．１．４　工具酶和主要生物学试剂　试验所用限制性内切酶、ＤＮＡ连接酶等均购自Ｔａｋａｒａ公司、ＮＥＢ公司；Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｂｕｆｆｅｒ、ＤＮＡ分子标量 Ｍａｒｋｅｒ购于北京全式金生物技术有限公司；Ｓｕ
ｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭⅢ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭｋｉｔ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；其他试剂均为市售国产或进口
分析纯。
１．１．５　培养基　１）ＬＢ培养基（１Ｌ）、ＹＥＢ培养基（１Ｌ）：用去离子水定容至１Ｌ，高压蒸气灭菌（１２１℃，１．０３４×
１０５Ｐａ）１５ｍｉｎ。２）ＭＳ固体培养基：用去离子水定容至１Ｌ，用ＮａＯＨ调ｐＨ约为５．８６，高压灭菌１５ｍｉｎ。３）Ｂ５
培养基：用去离子水定容至１Ｌ，用ＮａＯＨ调ｐＨ约为５．８６，高压灭菌１５ｍｉｎ。４）百脉根再生培养基［１４］：ＭＳＢ培
养基＋６ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋Ｃｅｆ１００ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ。
１．１．６　引物与测序　目的基因ＰＣＲ引物序列（表１）利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计；引物合成、基因测序工作均由北
京奥科生物技术有限公司完成。
表１　目的基因的引物序列
犜犪犫犾犲１　犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳狋犪狉犵犲狋犵犲狀犲狊
目的基因和启动子Ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｒ 目标片段长度Ｌｅｎｇｔｈｏｆｆｒａｇｍｅｎｔ（ｂｐ） 引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
犘犲犇犚犈犅２犪 １１４８ Ｕ：ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡ
Ｌ：ＡＧＴＧＧＴＴＡＣＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＡＴＧＡ
犘犲犇犚犈犅２犫 ８９０ Ｕ：ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡ
Ｌ：ＡＧＴＧＧＴＴＡＣＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＴＴ
犎犺犇犚犈犅２ ５３９ Ｕ：ＧＴＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡ
Ｌ：ＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣＴＡＴＡＴＡＣＧＣＴＣＴＧＴＴＡＡ
犎犺犈犚犉２ ７６０ Ｕ：ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＣＧＣＴＡＴＣ
Ｌ：ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡ
１．２　试验方法
１．２．１　安全型高效植物表达载体的构建　首先利用狉犱２９两对引物扩增出目的基因条带，回收并插入克隆载体
ＰＵＣ１９中，构建２个中间克隆载体；之后，再以犘犲犇犚犈犅２犪和犎犺犈犚犉２两对引物分别从ｐＭＤ１８Ｔ载体上扩增
出２个基因的完整开放阅读框（ＯＲＦ），并纯化回收基因片段。将回收的 犎犺犈犚犉２基因片段连接入酶切后的
ＰＵＣ１９狉犱２９犃２载体，构建ＰＵＣ１９狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２载体。同时根据狀狅狊设计引物，从狆犜４犃质粒中扩增目的
１５２第２２卷第３期 草业学报２０１３年
片段，获得ＰＵＣ１９狉犱２９犃１：：狀狅狊１和ＰＵＣ１９狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２载体。将构建载体转化大肠，将提取质粒
酶切获得这２个片段插入ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２狆犿犻植物表达载体，获得ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃１：：狀狅狊１和
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２；接着将 犘犲犇犚犈犅２犪 基因插入ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃１：：
狀狅狊１载体，从而获得ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃１：：犘犲犇犚犈犅２犪：：狀狅狊１植物表达载体。
双价载体在ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃１：：犘犲犇犚犈犅２犪：：狀狅狊１构建过程中，利用中间产物ＰＵＣ１９狉犱２９犃１：：
狀狅狊１，采用犎犻狀犱Ⅲ和犡犫犪Ⅰ双酶切将狉犱２９犃１：：狀狅狊１插入ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２位点，
获得ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃１：：狀狅狊１狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２，之后再将两端带有犛狆犺Ⅰ和犛犪犾Ⅰ酶切位点
的犘犲犇犚犈犅２犪整合入这一载体狉犱２９犃１和狀狅狊１中间，从而获得双价载体（图１）。
图１　含犘犲犇犚犈犅２犪、犎犺犈犚犉２基因的植物表达载体的结构示意图
犉犻犵．１　犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犘犲犇犚犈犅２犪，犎犺犈犚犉２狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狊
　Ａ：植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪的载体结构示意图ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪ｐｌａｎｔｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；Ｂ：植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２的载体结构示意图ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２
ｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；Ｃ：双价植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２的载体结构示意图ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ
犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２ｂｉｎａｒｙｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．
１．２．２　转基因百脉根的获得与鉴定　将携带目的基因载体的农杆菌ＬＢＡ４４０４通过涂板，挑取单菌落，摇菌活化
至ＯＤ６００为０．４～０．６［１５］。１００００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，用 ＭＳ液体培养基重悬。
取播种后约８ｄ的百脉根幼苗，以百脉根子叶作为外植体将混匀的菌液倒入放子叶的培养皿中，浸泡２０
ｍｉｎ。用滤纸吸干外植体上的菌液后，放入不加抗生素的 ＭＳ培养基中，２５℃暗培养３～４ｄ。然后进行分化、选
择、生根培养，直至成苗。
ＰＣＲ分子鉴定，根据犘犲犇犚犈犅２犪和犎犺犈犚犉２基因全长序列设计特异引物（１．１．６引物与测序），以百脉根基
因组为模板，按以下体系进行ＰＣＲ反应：在２０μＬＰＣＲ反应体系中加入１２．８μＬｄｄＨ２Ｏ，２μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ，２μＬ
ｄＮＴＰ，基因上下游引物各１μＬ，ＥｘＴａｑ酶０．２μＬ，１μＬ模板；反应程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ后，９４℃变性４５ｓ，
Ｔｍ（ＤＮＡ溶解温度）退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，设置３０个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。
百脉根植株的Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计特异性探针引物，由北京奥科生物公司合成。
引物序列为：犎犺犈犚犉２（Ｕ）：５′ＡＧＣＡＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＧＧＡ３′；（Ｌ）：５′ＴＧＣＴＴＣＡＧＧＴＣＧＡＴＣＴＣＣ３；犘犲
犇犚犈犅２犪（Ｕ）：５′ＣＡＡＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＴＧＴ３′（Ｌ）：５′ＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＣ３′；根据罗氏地高辛标
记试剂盒说明书和分子生物学操作技术［１６］，进行探针制备、转膜及固定、分子杂交、免疫检测。
１．２．３　转基因百脉根胁迫处理　２０１１年３月，在北京市中国农业科学院生物技术研究所进行干旱胁迫处理，选
取不同载体转基因百脉根和对照植株各５株移栽于直径３０ｃｍ、高３０ｃｍ的塑料花盆内，每盆栽种５株。进行连
续控水胁迫处理３周，每个处理设３次重复。苗期：以转土１周的百脉根幼苗作为试验对象，进行干旱处理，研究
干旱对苗期的影响。生长期：用盆栽４周左右的百脉根植株作为研究对象进行干旱胁迫抗性鉴定，分别干旱处理
２５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３
０，７，１４ｄ时取样检测；待处理４周之后，复水观察其生长状况［１７］。
２　结果与分析
２．１　安全型高效植物表达载体的构建
采用犡犫犪Ⅰ和犈犮狅犚Ⅰ对构建好的植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２进行双酶切
鉴定，结果显示，切出大小约为１．５ｋｂ片段，这与插入片段后载体大小一致。而利用犡犫犪Ⅰ和犈犮狅犚Ⅰ双酶切验
证已构建好的ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２的植物表达载体，结果显示切出大小与合成后大小
一致，说明载体构建成功（图２）。
双价载体中犘犲犇犚犈犅２犪和犎犺犈犚犉２两个主基因的鉴定结果表明，插入基因片段大小正确，且测序结果与目
的基因序列也完全匹配，证明双价载体构建正确（图３）。
图２　植物表达载体双酶切鉴定
犉犻犵．２　犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犲狀犱犱狅狀狌犮犮犾犲犪狊犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅
　Ａ：ＰＵＣ１９狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２编码框犡犫犪Ⅰ和犈犮狅犚Ⅰ双酶切鉴定ＰＵＣ１９狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ犡犫犪Ⅰａｎｄ犈犮狅犚Ⅰ；Ｍ：条
带标志 Ｍａｒｋｅｒ；１：质粒 Ｐｌａｓｍｉｄ；２～４：酶切结果 Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔ；Ｂ：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２犡犫犪Ⅰ和犈犮狅犚Ⅰ双酶切鉴定
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２狉犱２９犃２：：犎犺犈犚犉２：：狀狅狊２ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ犡犫犪Ⅰａｎｄ犈犮狅犚Ⅰ；Ｍ：条带标志 Ｍａｒｋｅｒ；１～２：酶切结果 Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔ．
图３　双价植物表达载体中犘犲犇犚犈犅２犪和犎犺犈犚犉２基因的犘犆犚鉴定
犉犻犵．３　犆狅犾狅狀狔犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犲犇犚犈犅２犪犪狀犱犎犺犈犚犉２狅犳狋犺犲犫犻狀犪狉狔犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉
　Ａ：犘犲犇犚犈犅２犪基因ＰＣＲ扩增结果ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犘犲犇犚犈犅２犪ｇｅｎｅ；Ｍ：标记条带 Ｍａｒｋｅｒ；ＰＣ：阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ＮＣ：阴性对照
Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；１～４：４个菌落Ｆｏｕｒｌｉｎｅｓ；Ｂ：犎犺犈犚犉２基因ＰＣＲ扩增结果ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犎犺犈犚犉２ｇｅｎｅ．
２．２　农杆菌转化及ＰＣＲ鉴定
采用热激法［１８］，将植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：
犎犺犈犚犉２和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２分别转化根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，分别挑取培养后的单
菌落，并进行载体主基因的ＰＣＲ鉴定，对照相比，均扩出大小正确的目的基因条带，证明３种载体已成功转入根
癌农杆菌中。
２．３　优质牧草百脉根的遗传转化
外植体经过农杆菌侵染、共培养及分化培养１周后，移入添加１５．５ｇ／Ｌ甘露糖的选择培养基中（ＭＳ＋ＢＡ
３５２第２２卷第３期 草业学报２０１３年
０．１ｍｇ／Ｌ＋Ｃｅｆ５００ｍｇ／Ｌ），每２周换１次新的培养基，避免培养过程中组织产生的各种毒素物质影响外植体的
分化［１９］。经过甘露糖筛选，现已获得转ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪、ｐｍｉ狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２和ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：
犎犺犈犚犉２抗性丛生芽２７，３８和１５个（图４）。
图４　百脉根的遗传转化
犉犻犵．４　犇犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犪犾狊狋犪犵犲狊狅犳犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊（犔犲狅）狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱犫狔狆犆犃犕犅犐犃１３０２狆犿犻狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪，
狆犆犃犕犅犐犃１３０２狆犿犻狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２犪狀犱狆犆犃犕犅犐犃１３０２狆犿犻犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２，狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔
　Ａ：百脉根幼苗犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ；Ｂ：百脉根７日苗（图中箭头表示外植体的剪取位置）７ｄａｙｏｌｄｐｌａｎｔｌｅｔ（Ｔｈｅａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｓｉｔｅ
ｗｈｅｒｅｔｏｃｕｔ）；Ｃ：子叶外植体在甘露糖筛选下的分化Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｕｎｄｅｒｔｈｅｍａｎｎｏｓｅ；Ｄ，Ｅ：外植体分化出芽Ｓｈｏｏｔｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｔａｇｅｓ（５
ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）；Ｆ～Ｉ：分株和生根Ｓｅｐａｒａｔｅｐｌａｎｔａｎｄｒｏｏｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｊ～Ｋ：移栽至花盆 Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｉｎｆｌｏｗｅｒｐｏｔ．
２．４　转基因百脉根的检测及初步抗逆性分析
２．４．１　农杆菌转化及 ＰＣＲ 鉴定　经检测现已获得转ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪，ｐＣＡＭ
ＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２，ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２载体的转基因百脉根分别为７，
１２和５株，其他大批转化事件还在检测中。部分结果显示，选取经检测为阳性的，转化ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲
犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪的百脉根植株各５株，再次ＰＣＲ验证，结果均
扩增出目的条带，表明目的基因犘犲犇犚犈犅２犪已整合到百脉根基因组中（图５）。
图５　转基因百脉根植株犘犲犇犚犈犅２犪基因的犘犆犚检测
犉犻犵．５　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犳狅狉犘犲犇犚犈犅２犪犵犲狀犲
　Ｍ：条带标记 Ｍａｒｋｅｒ；ＰＣ：质粒Ｐｌａｓｍｉｄ；ＮＣ：非转基因植株Ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｌｅｔ；ＰＨ１～ＰＨ５：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２；Ｐ１
～Ｐ５：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪．
　　分别选取经甘露糖筛选后，经ＰＣＲ验证为阳性的，转有ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２和
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２的百脉根植株各５株，再次提取其ＤＮＡ进行ＰＣＲ验证。结果显示，除了
ＰＨ１样品未检测到犎犺犈犚犉２基因外，其他样品均扩增出目的条带，表明目的基因犎犺犈犚犉２已整合到百脉根基
因组中（图６）。此外，试验也对抽查的转基因百脉根进行了狆犿犻筛选基因的ＰＣＲ检测，结果显示，除了ＰＨ５材
４５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３
料未检测出狆犿犻基因外，其他材料均扩出目的基因狆犿犻条带（图７）。
２．４．２　ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ检测　为进一步验证转基因百脉根材料的正确性，在ＰＣＲ检测为阳性的３种转基因百脉
根材料分别选取ＰＨ３５、Ｐ１３和 Ｈ１３作为ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ检测的对象，以５８２ｂｐ的犘犲犇犚犈犅２犪和３９９ｂｐ的
犎犺犈犚犉２基因片段为探针分别与从转基因百脉根中扩出的犘犲犇犚犈犅２犪和犎犺犈犚犉２全长基因进行杂交，Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ检测结果与上一步ＰＣＲ结果相吻合，验证了ＰＣＲ的可靠性。表明选取的这几个材料均为转基因阳
性植株（图８，９）。
２．４．３　转基因百脉根抗旱性初步分析　对盆栽非转基因和分别转ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪，
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２，ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２百脉根植株各５株进行连
续控水胁迫处理３周。当胁迫处理结束时发现，转基因与非转基因（对照）百脉根都出现枝叶萎蔫的现象，其中转
基因百脉根较对照萎蔫程度小，且叶色较深；复水３ｄ后，转基因百脉根枝叶除小部分枝叶干枯死亡，其他部分则
重新舒展，成活率为１００％。而非转基因植株基本上因严重脱水，无法维持正常的新陈代谢而整株死亡。
图６　转基因百脉根植株犎犺犈犚犉２基因的犘犆犚检测
犉犻犵．６　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犳狅狉犎犺犈犚犉２犵犲狀犲
　Ｍ：条带标记 Ｍａｒｋｅｒ；ＰＣ：质粒Ｐｌａｓｍｉｄ；ＮＣ：非转基因植株 Ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｌｅｔ；ＰＨ１～ＰＨ５：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２；
Ｐ１～Ｐ５：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２．
图７　转基因百脉根植株狆犿犻基因的犘犆犚检测
犉犻犵．７　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犳狅狉狆犿犻犵犲狀犲
　Ｍ：条带标记 Ｍａｒｋｅｒ；ＰＣ：质粒Ｐｌａｓｍｉｄ；ＮＣ：非转基因植株Ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｌｅｔ；ＰＨ１～ＰＨ５：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２；
Ｐ１～Ｐ５：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪；Ｈ１～Ｈ５：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２．
３　讨论
转基因与非转基因百脉根经干旱胁迫处理表现出了较强的抗旱性，尤其转双价基因犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２
的百脉根在干旱控水处理２周后，基本没有出现叶片干枯脱落现象，仍能保持较好的生长状况。其他胁迫相关试
验正在进行当中。
Ｗａｎｇ等［２０］转犜犪犔犈犃３基因的羊草（犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊）在干旱胁迫下，植株的相对含水量、叶片水势基本保
持不变，平均相对增长率高，复水后的再生率与非转基因植株相比，都有明显的提高。Ｗｕ等［２１］转水稻液泡膜
Ｎａ＋／Ｈ＋反向转运体基因犗狊犖犎犡１的黑麦草，在ＮａＣｌ胁迫下叶片中的Ｎａ＋、Ｋ＋和脯氨酸含量都有了增加，且
生长１０周不出现萎蔫。这表明转单个基因不同程度的改良植物的抗旱性。随着植物抗逆相关研究的深入，研究
人员发现抗逆性是受多基因控制的数量性状，利用基因工程技术导入单个功能基因只能在一定程度上提高植物
的抗逆性，且提高的效果不很理想。这也是传统杂交选育中存在的周期长、概率小、针对性差等缺陷的原因所在。
５５２第２２卷第３期 草业学报２０１３年
而转录因子是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合，从而能激活或抑制下游基因在
特定时间和空间的转录与表达的一类蛋白，是目前抗逆研究最多、应用最广的一类基因。近年，与植物抗逆性有
关的转录因子基因（犫犣犐犘类、犠犚犓犢 类、犖犃犆类、犕犢犅类和犃犘２／犈犚犈犅犘类）已从拟南芥、水稻、玉米等中被大
量分离克隆出，转这些转录因子基因的植株表现出良好的综合抗逆性，但在牧草方面鲜有报道［２２］。
图８　百脉根转基因植株的犘犲犇犚犈犅２犪基因的犘犆犚犛狅狌狋犺犲狉狀检测
犉犻犵．８　犘犆犚犛狅狌狋犺犲狉狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犳狅狉犘犲犇犚犈犅２犪犵犲狀犲
　ＰＣ：质粒 Ｐｌａｓｍｉｄ；ＮＣ：非转基因植株 Ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｌｅｔ；ＰＨ３～ＰＨ５：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２；Ｐ１～Ｐ３：ｐＣＡＭ
ＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犘犲犇犚犈犅２犪．
图９　百脉根转基因植株的犎犺犈犚犉２基因的犘犆犚犛狅狌狋犺犲狉狀检测
犉犻犵．９　犘犆犚犛狅狌狋犺犲狉狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犳狅狉犘犲犇犚犈犅２犪犵犲狀犲
　ＰＣ：质粒Ｐｌａｓｍｉｄ；ＮＣ：非转基因植株 Ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｌｅｔ；ＰＨ３～ＰＨ５：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ｐｍｉ犘犲犇犚犈犅２犪：：犎犺犈犚犉２；Ｈ１～Ｈ３：ｐＣＡＭ
ＢＩＡ１３０２ｐｍｉ狉犱２９犃：：犎犺犈犚犉２．
　　转录因子具有调控下游成百上千基因表达的能力，为减轻基因过量表达对植物本身生长造成的负面影响，试
验采用了诱导型启动子狉犱２９犃，使其在逆境胁迫下才得以表达。同时为消除常规筛选标记具有的潜在生态危害
性，试验采用被证明为安全型的植物选择标记基因犘犕犐［２３，２４］代替卡那霉素、潮霉素和除草剂等常规筛选标记，为
转基因植物的后期应用与推广排除了后顾之忧。
为得到具有多种优良性状的转基因植株，采取的多数方法是将多个性状控制基因组合在一起，构建多价载体
转化植物受体材料，这种方法较常规杂交育种周期短，效果明显，是创制植物新品种重要途径［２５］。但犇犚犈犅和
犈犚犉 转录因子基因亚族包括大量的基因成员，而这些基因识别的顺式作用元件不尽相同，与各类元件特异结合
的强度存在差别，同时受自身在植物体中表达量的限制，其与下游作用元件结合的机率也受到一定限制，因此每
类转录因子基因只能调控一类基因中部分数量的表达，在改良植物抗性方面也是有限的。基于此观点，本试验利
用犇犚犈犅和犈犚犉 两类转录因子在结合下游作用元件方面的互补性，构建含有这两类转录因子的双价植物表达
载体转化植物，达到抗逆多基因表达的累积效应，使转基因植物的抗逆性得到大幅度的提高。但目前国内外还很
少有这方面的报道，有待进一步去探究。
６５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３
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狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖａｃｕｏｌａｒＮａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００５，１６９（１）：６５７３．
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７５２第２２卷第３期 草业学报２０１３年
犉狌狀犮狋犻狅狀犪犾犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犱狉狅狌犵犺狋狉犲狊犻狊狋犪狀狋狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀犳犪犮狋狅狉狊犘犲犇犚犈犅２犪
犪狀犱犎犺犈犚犉２犻狀犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊
ＴＡＯＦｅｉ１，２，ＭＡＪｉａｎｇｔａｏ２，ＴＡＮＧＹｉｘｉｏｎｇ２，ＬＩＪｉｎｇｓｈｅｎｇ３，
ＬＵＹｕｎｍｉｎｇ３，ＸＵＢｉｎｇｌｉａｎｇ１，ＷＵＹａｎｍｉｎ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍ，
ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＳｉｎｏＵ．Ｓ．
ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＧｒａｚｉｎｇｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍＳｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｈｅｎｚｈｅｎＮｏｎｇｋｅＧｒｏｕｐ，
Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０４０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｗｏｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓ（犘犲犇犚犈犅２犪ａｎｄ犎犺犈犚犉２）ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆｔｈｅｆｏｕｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍ犘狅狆狌犾狌狊犲狌狆犺狉犪狋犻犮犪ａｎｄ犎犪犾犻犿狅犱犲狀犱狉狅狀犺犪犾狅犱犲狀犱狉狅狀，ｒｅ
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．犘犲犇犚犈犅２犪ａｎｄ犎犺犈犚犉２ｗｅｒｅｔｗｏｆａｃｔｏｒｓｗｈｉｃｈｈａｄｐｏｓｉｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｉｎｐｌａｎｔｓａｇａｉｎｓｔｄｒｏｕｇｈｔ
ｓｔｒｅｓｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｉｓ，ａｓｅｒｉｅｓｏｆｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｅｉｔｈｅｒｈａｒｂｏｒｉｎｇ犘犲犇犚犈犅２犪ｏｒ犎犺犈犚犉２ｗｅｒｅｃｏｎ
ｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｍａｒｋｅｒｇｅｎｅａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏｔｈｅ犔狅狋狌狊ｇｅｎｏｍｅｕｓｉｎｇａｎ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉ
ａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犔狅狋狌狊ｈａｄｓｔｒｏｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｄｒｏｕｇｈｔ．Ｔｈｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆ犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊，ａｎｄｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊ｗａｓ
１００％ｉｎａｄｒｏｕｇｈｔｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｔｅｒｔｅｓｔ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ；ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
８５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３