全 文 ：书２０个黑麦草品系的犛犚犃犘遗传多样性分析
李杰勤１，王丽华１，詹秋文１，朱奎１，刘井良２，李万祥２
（１．安徽科技学院植物科学学院，安徽 凤阳２３３１００；２．安徽金沱湖蟹业有限责任公司，安徽 五河２３３３００）
摘要：利用ＳＲＡＰ分子标记技术对２０个黑麦草品系的遗传多样性进行了分析。结果发现，５３个引物组合共扩增出
７６５条带，其中多态性带共５９７条，多态性比率为７８．９５％。平均每对引物扩增出的带数和多态性条带数分别为
１４．４和１１．２条。各黑麦草品系间的遗传相似系数在０．４８５～０．７２７，平均为０．６２７。从 ＵＰＧＭＡ聚类分析的结果
来看，以阈值０．６３可将这２０个品系分为４类。２个多花黑麦草品系并不聚在一类，而是分散在１８个多年生黑麦
草品系中。另外，ＵＰＧＭＡ聚类结果与这些品系的来源基本一致，这说明ＳＲＡＰ标记适用于黑麦草品系间的遗传
多样性研究。
关键词：黑麦草；ＳＲＡＰ；遗传多样性；ＵＰＧＭＡ
中图分类号：Ｓ５４３＋．６０３．４；Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０２０１５８０７
黑麦草是禾本科黑麦草属（犔狅犾犻狌犿）植物，只有８个二倍体种 （２ｎ＝１４），其中最具有商业价值的２个种为多
年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）和多花黑麦草（犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）［１，２］。黑麦草原产地为地中海沿岸，分布于欧
洲南部、非洲北部及亚洲西南部。自２０世纪３０年代引入我国后，在我国的江苏、浙江、江西、湖北、湖南、四川、贵
州、安徽等省均有较大面积的栽培［３，４］。目前，黑麦草在我国的栽种面积较大，但自主培育的品种还较少［５］。种
质资源是品种选育的基础，而对种质资源遗传背景的研究则是品种选育的关键。
ＳＲＡＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）即序列相关扩增多态性，又称基于序列扩增的多态性，是
美国加州大学蔬菜作物系Ｌｉ和Ｑｕｉｒｏｓ［６］提出的一种新型的基于ＰＣＲ的标记系统。ＳＲＡＰ标记检测的对象是基
因的阅读框区域（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦｓ），具有简便、中等产量、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等
优点。ＳＲＡＰ引物设计是基于外显子富含ＧＣ，而启动子和内含子富含ＡＴ的特点，上游引物长１７ｂｐ，对外显子
进行特异扩增，下游引物长１８ｂｐ，特异扩增的是内含子及启动子区域，由于个体不同以及物种之间的内含子、启
动子、启动子之间间隔长度不同而产生多态性［７］。近年来，ＳＲＡＰ标记在植物遗传多样性分析、遗传连锁图的构
建与基因定位中都得到了广泛应用［８１０］。
本研究利用ＳＲＡＰ标记对从美国国家种质中心引进的１８个黑麦草品系与２个国内广泛种植的黑麦草品种
进行了遗传多样性分析，在分子水平上确定这些引进种质间的亲缘关系，为黑麦草育种中的亲本选配和利用提供
理论基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
本实验材料为黑麦草，其中１８个黑麦草种质来源于美国国家种质资源中心，它们的名称和原产国见表１。
这１８个黑麦草品系是由４９个黑麦草品系经过２年种植后筛选获得。另外２个品种是在我国推广较多的蓝天堂
黑麦草与长江２号。试验材料２０１０年种植在安徽科技学院种植科技园，株距１０ｃｍ，行距２０ｃｍ，常规田间管理。
１．２ ＤＮＡ的提取、电泳和扩增检测
２０１１年４月选取黑麦草新鲜幼嫩的叶片进行总ＤＮＡ提取（每个品系选取１０株混合）。提取方法为ＳＤＳ
１５８－１６４
２０１３年４月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２２卷 第２期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
收稿日期：２０１２１１０２；改回日期：２０１２１２０３
基金项目：安徽高等学校省级自然科学研究项目（Ｎｏ：ＫＪ２０１１Ｚ０７５），安徽科技学院青年基金（ＺＲＣ２０１１２８０），国家自然科学基金（Ｎｏ：
３１０７１４７０），安徽省“１１５”产业创新团队（皖人才办［２００９］２号）和科技部“十二五”农村领域国家科技计划课题（Ｎｏ：２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０３）
资助。
作者简介：李杰勤（１９８０），男，四川宜宾人，讲师，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｗｌｈｌｊｑ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。
（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，十二烷基硫酸钠）法［１１］，稍做更改。具体方法如下：取嫩叶２ｇ加石英砂磨成粉末，转入
２ｍＬＥＰ管中，再加入５００μＬ提取液（６５℃）摇匀，６５℃温浴３０ｍｉｎ（中间出现蛋白质带）；加入２００μＬ５ｍｏｌ／Ｌ
ＫＡｃ，冰浴３０ｍｉｎ（禁止摇动）；加入４００μＬ氯仿／异戊醇（２４∶１）摇匀６ｍｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；取上清
液于另一１．５ｍＬＥＰ管中，加入预冷的２倍体积的无水乙醇沉淀ＤＮＡ；用７０％乙醇冲洗３次，加入无水乙醇脱
水，吹干；加入２００μＬｄｄＨ２Ｏ溶解。
ＰＣＲ反应体系为２５μＬ：１０×ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，２．５μＬＭｇＣｌ２，２５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．５Ｕ，
引物２μＬ，总ＤＮＡ１００ｎｇ和ｄｄＨ２Ｏ１３．６μＬ。扩增反应程序：９４℃ 预变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，３６℃退火１
ｍｉｎ，７２℃ 延伸１ｍｉｎ，５个循环；９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３４个循环；最后再延伸７ｍｉｎ，
４℃保存。扩增产物在０．５×ＴＢＥ（氨基丁三醇硼酸）缓冲液系统中，用６％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，同时以
１０００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ作为分子量标记，稳压２００Ｖ，时间５０～６０ｍｉｎ，采用银染法染色，再用ＢＩＯＲＡＤ
公司成像系统观察并拍照。
表１ ２０份黑麦草的名称和来源
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲狀犪犿犲犪狀犱狉犲狊狅狌狉犮犲狊狅犳２０狉狔犲犵狉犪狊狊犾犻狀犲狊
编号Ｎｏ． 材料名称Ｎａｍｅ 原产地Ｏｒｉｇｉｎ 种 类Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ
１ ＢＨ（蓝天堂ＢｌｕｅＨｅａｖｅｎ） 美国 ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ 多花黑麦草犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿
２ Ａ３ 丹麦 Ｄｅｎｍａｒｋ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
３ Ａ６ 荷兰 Ｄｕｔｃｈ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
４ Ａ９ 伊朗Ｉｒａｎ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
５ Ａ１２ 利比亚Ｌｉｂｙａ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
６ Ａ１４ 阿尔及利亚 Ａｌｇｅｒｉａ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
７ Ａ１６ 阿尔及利亚 Ａｌｇｅｒｉａ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
８ Ａ２０ 前南斯拉夫ＦｏｒｍｅｒＳｅｒｂｉａａｎｄＭｏｎｔｅｎｅｇｒｏ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
９ Ａ２１ 伊拉克Ｉｒａｑ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１０ Ａ２２ 智利Ｃｈｉｌｅ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１１ Ａ２４ 波兰Ｐｏｌａｎｄ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１２ Ａ２５ 塞普路斯Ｃｙｐｒｕｓ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１３ Ａ２６ 土耳其 Ｔｕｒｋｅｙ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１４ Ａ２９ 匈牙利 Ｈｕｎｇａｒｙ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１５ Ａ３１ 罗马尼亚 Ｒｏｍａｎｉａ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１６ Ａ３６ 意大利Ｉｔａｌｙ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１７ Ａ３８ 法国Ｆｒａｎｃｅ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１８ Ａ４３ 摩洛哥 Ｍｏｒｏｃｃｏ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
１９ Ａ４９ 保加利亚Ｂｕｌｇａｒｉａ 多年生黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲
２０ ＣＪ２（长江２号ＣｈａｎｇｊｉａｎｇＮｏ．２） 中国Ｃｈｉｎａ 多花黑麦草犔．犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿
１．３ ＤＮＡ引物
引物采用Ｌｉ和Ｑｕｉｒｏｓ［６］发表的引物，引物序列如表２所示。正向引物９条，反向引物１７条，共有１５３对引
物，采用 ＭｅＥｍ的组合表示方式。
１．４ 数据处理
将带型编成二进制数据：０代表无带，１代表有带，９表示缺失。采用 ＮＴＳＹＰＣ软件［１２］对有关数据进行
处理。
９５１第２２卷第２期 草业学报２０１３年
表２ 犛犚犃犘引物序列表
犜犪犫犾犲２ 犛犚犃犘狆狉犻犿犲狉狊狊犲狇狌犲狀犮犲
正向引物Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ 反向引物Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ
Ｍｅ１：５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ３′ Ｅｍ１：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴ３′
Ｍｅ２：５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ３′ Ｅｍ２：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣ３′
Ｍｅ３：５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴ３′ Ｅｍ３：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ３′
Ｍｅ４：５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ３′ Ｅｍ４：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ３′
Ｍｅ５：５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧ３′ Ｅｍ５：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ３′
Ｍｅ６：５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡ３′ Ｅｍ６：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ３′
Ｍｅ７：５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＣＣ３′ Ｅｍ７：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ３′
Ｍｅ８：５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ３′ Ｅｍ８：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ３′
Ｍｅ９：５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＣＡ３′ Ｅｍ９：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡ３′
Ｅｍ１０：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＧ３′
Ｅｍ１１：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡ３′
Ｅｍ１２：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＴＴ３′
Ｅｍ１３：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＣＧ３′
Ｅｍ１４：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＴＧ３′
Ｅｍ１５：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧ３′
Ｅｍ１６：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＴ３′
Ｅｍ１７：５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＣＣＡＴ３′
２ 结果与分析
２．１ ＳＲＡＰ标记在２０个黑麦草品系间的多态性分析
为了提高试验效率，选用了Ａ３２、蓝天堂和长江２号对１５３对引物进行初步筛选，结果表明共有５３对ＳＲＡＰ
引物能较好地扩增出条带。在此基础上，利用筛选出的５３对ＳＲＡＰ引物对这２０个黑麦草品系进行了多态性分
析。这５３对引物在这２０个黑麦草品系间共扩增出７６５条带，片断大小在１００～１０００ｂｐ（图１）。其中多态性带
共５９７条，多态性比率为７８．０３％。这５３对引物扩增的条带数从６～１９条不等，平均每对引物扩增出１４．４条带，
平均多态性条带１１．２，综合看来，ＳＲＡＰ标记的多态性较好（表３）。
２．２ ２０个黑麦草品系间的遗传多样性分析
将５３对ＳＲＡＰ引物扩增出的７６５条电泳带建立了相似系数矩阵，这２０个黑麦草品系间的相似系数最大为
０．７２７，最小为０．４８５，平均大小为０．６２７（表４）。由此可见虽然这２０个黑麦草品系来源于不同的国家，但是相似
系数之间相差并不大。来自中国的长江２号与其他１９个材料间的相似系数都较小，其中最小的为０．５１３，最大
为０．６７８，平均大小为０．５８９。长江２号的平均相似系数小于这２０个材料之间的平均相似系数。由于长江２号
是我国自主选育品种，与其他国外品种之间有地域隔绝，因而与引进的种质资源的亲缘关系较远。
２．３ ＵＰＧＭＡ聚类分析
ＵＰＧＭＡ（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈａｒｉｔｈｍｅｔｉｃｍｅａｎｓ，非加权组平均法）聚类分析的结果表明
（图２），以阈值０．６３可将这２０个品种聚为４类。其中，蓝天堂、Ａ２４、Ａ３和Ａ９是第一类，这一类的品系主要来
源于北欧和北美；Ａ６、Ａ２１、Ａ４３、Ａ２５、Ａ３１、Ａ２０、Ａ２６、Ａ２９、Ａ３６和Ａ３８是第二类，这一类主要来源于地中海沿岸
国家；Ａ１２、Ａ１６、Ａ２２和Ａ１４是第三类，这一类主要来源于非洲和南美；Ａ４９和ＣＪ２是第四类，这类只有中国的
ＣＪ２（长江２号）和保加利亚的Ａ４９。２个多花黑麦草品系蓝天堂和长江２号并未聚在一类，而是分散在其他的１８
个多年生黑麦草品系中。因此，ＳＲＡＰ标记不能将多花黑麦草与多年生黑麦草区分开。从总体上来看，利用
ＳＲＡＰ标记获得的结果与利用地理分类的结果基本一致，这说明ＳＲＡＰ标记能比较准确地反映出各黑麦品系间
的亲缘关系。
０６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
表３ 犛犚犃犘引物组合和扩增结果
犜犪犫犾犲３ 犛犚犃犘狆狉犻犿犲狉犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊犪狀犱犪犿狆犾犻犳犻犲犱狉犲狊狌犾狋狊
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
总带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｔｏｔａｌｂａｎｄｓ
多态性带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态位点百分率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ（％）
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
总带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｔｏｔａｌｂａｎｄｓ
多态性带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态位点百分率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ（％）
ＥＭ１－ＭＥ１ １９ １８ ９４．７３ ＥＭ５－ＭＥ８ １７ １３ ７６．４７
ＥＭ１－ＭＥ２ １５ １０ ６６．６７ ＥＭ５－ＭＥ９ １７ １４ ８２．３５
ＥＭ１－ＭＥ５ １８ １４ ７７．７８ ＥＭ５－ＭＥ１０ １６ １４ ８７．５０
ＥＭ１－ＭＥ７ １６ １６ １００．００ ＥＭ５－ＭＥ１３ １４ １３ ９２．８５
ＥＭ１－ＭＥ１１ ９ ９ １００．００ ＥＭ５－ＭＥ１４ １３ ９ ６９．２３
ＥＭ１－ＭＥ１２ １１ １１ １００．００ ＥＭ６－ＭＥ１ １６ １１ ６８．７５
ＥＭ１－ＭＥ１７ ７ ７ １００．００ ＥＭ６－ＭＥ５ １９ １４ ７３．６８
ＥＭ２－ＭＥ１ １４ ６ ４２．８６ ＥＭ６－ＭＥ８ ２０ １５ ７５．００
ＥＭ２－ＭＥ３ １０ ９ ９０．００ ＥＭ６－ＭＥ１１ １２ ７ ５８．３３
ＥＭ２－ＭＥ４ ６ ６ １００．００ ＥＭ６－ＭＥ１２ １９ １４ ７３．６８
ＥＭ２－ＭＥ５ １１ １０ ９０．９１ ＥＭ７－ＭＥ２ １２ １０ ８３．３３
ＥＭ２－ＭＥ６ １６ １６ １００．００ ＥＭ７－ＭＥ４ １９ １５ ７８．９４
ＥＭ２－ＭＥ７ １１ ６ ５４．５５ ＥＭ７－ＭＥ８ １８ ８ ４４．４５
ＥＭ２－ＭＥ８ １５ １３ ８６．６７ ＥＭ７－ＭＥ１６ １９ ９ ４７．３７
ＥＭ３－ＭＥ５ １４ １３ ９２．８６ ＥＭ８－ＭＥ６ １４ １２ ８５．７１
ＥＭ３－ＭＥ６ ９ ８ ８８．８９ ＥＭ８－ＭＥ１０ １８ １６ ８８．８９
ＥＭ３－ＭＥ７ １０ ７ ７０．００ ＥＭ８－ＭＥ１２ １６ １３ ８１．２５
ＥＭ３－ＭＥ８ ２０ １６ ８０．００ ＥＭ８－ＭＥ１４ １６ １４ ８７．５０
ＥＭ３－ＭＥ１３ １５ １１ ７３．３３ ＥＭ８－ＭＥ１６ １５ １１ ７３．３３
ＥＭ３－ＭＥ１５ ９ ９ １００．００ ＥＭ９－ＭＥ２ １８ １３ ７２．２２
ＥＭ３－ＭＥ１６ １０ ８ ８０．００ ＥＭ９－ＭＥ６ １５ １４ ９３．３３
ＥＭ４－ＭＥ１ １３ ４ ３０．７７ ＥＭ９－ＭＥ７ ６ ５ ８３．３２
ＥＭ４－ＭＥ３ １７ １５ ８８．２３ ＥＭ９－ＭＥ９ １５ １２ ８０．００
ＥＭ４－ＭＥ３ １８ １３ ７２．２２ ＥＭ９－ＭＥ１０ １３ ９ ６９．２３
ＥＭ４－ＭＥ５
ＥＭ４－ＭＥ８
１８
１４
９
１１
５０．００
７８．５７
ＥＭ９－ＭＥ１６
总计Ｔｏｔａｌ
１８
７６５
１８
５９７
１００．００
ＥＭ５－ＭＥ４ １０ ７ ７０．００ 平均Ａｖｅｒａｇｅ １４．４ １１．２ ７８．０３
ＥＭ５－ＭＥ５ １５ １２ ８０．００
３ 讨论
３．１ ＳＲＡＰ在黑麦草种质资源研究中的应用价值
了解种质资源遗传背景信息，才能有目的地进行杂交组合的配制及对其杂交后代的选择。因此，对种质资源
遗传信息的研究一直是育种研究的一个重要组成部分。随着分子标记的快速发展，分子标记已经成为种质资源
遗传信息研究的重要手段。ＳＲＡＰ标记最大的特点是针对基因的阅读框区域（ＯＲＦＳ）进行扩增，因此有效地提高
了扩增结果与表型之间的相关性。Ｆｅｒｒｉｏｌ等［１３］对葫芦科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）种质资源的遗传多样性进行ＳＲＡＰ分
析，结果发现ＳＲＡＰ比ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，扩增片段长度多态性）更能表现表型的
多样性及进化历史。刘月光等［１４］利用ＳＲＡＰ对１７个莲藕（犖犲犾狌犿犫狅狀狌犮犻犳犲狉犪）品种进行了多态性分析，认为
１６１第２２卷第２期 草业学报２０１３年
图１ 引物组合犈犕９－犕犈１６扩增电泳图
犉犻犵．１ 犜犺犲犛犚犃犘犪犿狆犾犻犳犻犲犱狆狉狅犳犻犾犲狅犳狆狉犻犿犲狉犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀犈犕９－犕犈１６
Ｍ为ｍａｒｋｅｒ。样品编号与表１编号相同。Ｍｉｓｍａｒｋｅｒ．ＡｎｄｔｈｅｃｏｄｅｏｆｓａｍｐｌｅｓｉｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈＴａｂｌｅ１．
表４ 犑犪犮犮犪狉犱相似系数表
犜犪犫犾犲４ 犑犪犮犮犪狉犱狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔犮狅犲犳犳犻犮犲狀狋狊
项目
Ｉｔｅｍ
ＢＨ Ａ３ Ａ６ Ａ９ Ａ１２ Ａ１４ Ａ１６ Ａ２０ Ａ２１ Ａ２２ Ａ２４ Ａ２５ Ａ２６ Ａ２９ Ａ３１ Ａ３６ Ａ３８ Ａ４３ Ａ４９ ＣＪ２
ＢＨ １．０００
Ａ３ ０．６７７１．０００
Ａ６ ０．５８１０．５９７１．０００
Ａ９ ０．６０６０．７０００．６５８１．０００
Ａ１２ ０．５９４０．６１７０．５９６０．５００１．０００
Ａ１４ ０．６０１０．５６９０．５６９０．６４００．６１４１．０００
Ａ１６ ０．５５２０．６８６０．６３４０．６５７０．７２７０．７０１１．０００
Ａ２０ ０．６３５０．６５４０．６８７０．６６１０．６３３０．６４３０．６８１１．０００
Ａ２１ ０．５９９０．６８１０．７２５０．７０６０．６４７０．６３６０．７１６０．６６８１．０００
Ａ２２ ０．６１４０．６３９０．６４７０．６９３０．６７９０．６１６０．６７８０．６６００．６８２１．０００
Ａ２４ ０．６４５０．６２３０．６１７０．６６３０．５５８０．５６１０．６１７０．６２３０．６７９０．５７８１．０００
Ａ２５ ０．６２７０．６３４０．６４００．６３９０．５７５０．５１４０．６１８０．６８２０．６７７０．５９８０．６５５１．０００
Ａ２６ ０．５９６０．５８００．６３２０．６０１０．５７９０．５８００．５８００．６８６０．７０９０．５６７０．６３４０．６７７１．０００
Ａ２９ ０．６８００．６４６０．６０８０．６６７０．６０４０．６９３０．６４８０．６７３０．７１６０．５６５０．６５００．６７４０．７０２１．０００
Ａ３１ ０．５５７０．６１４０．６８２０．６３６０．６７１０．４８５０．６０８０．６０３０．７０００．６９００．５９２０．７２７０．６４９０．６２５１．０００
Ａ３６ ０．６０８０．５９００．６３１０．６１５０．６９９０．５９９０．５８６０．６３３０．６１６０．６０００．５８９０．６４３０．６３７０．６９５０．６６０１．０００
Ａ３８ ０．５９５０．５８８０．６２２０．６２１０．５５３０．５６４０．５３６０．５８２０．６３７０．６３２０．５９１０．５８６０．６１２０．６５８０．６５５０．６８０１．０００
Ａ４３ ０．５８６０．６０８０．６９００．６８３０．５８５０．６４２０．６４６０．６６２０．７２００．６７１０．５６００．６５９０．６４００．６１４０．６８１０．６４９０．６７３１．０００
Ａ４９ ０．５５８０．５９３０．６２９０．６２６０．５４５０．６０２０．６３８０．６０６０．６７７０．５７５０．５８３０．６２３０．５９００．６２２０．６０１０．６２３０．６３１０．６８２１．０００
ＣＪ２ ０．５５８０．６３６０．５６３０．６２１０．５１７０．５１９０．５１３０．６１８０．６２１０．５５２０．６１５０．６４４０．５２１０．５８５０．５６８０．５５６０．６６４０．６７８０．６４７１．０００
２６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２
ＳＲＡＰ标记多态性丰富，相对于其他随机引物标记具有更高频率的共显性位点，是分子图谱构建的理想标记。本
试验首次利用ＳＲＡＰ标记对２０个黑麦草品系进行了ＳＲＡＰ分析，结果表明ＳＲＡＰ标记在这２０个黑麦草品系间
表现出了较高的多态性和稳定性。相比于本实验室前期利用ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，随机
扩增多态性ＤＮＡ标记）对黑麦草的分析来看，ＳＲＡＰ扩增结果的可重复性大大增加，不会随着实验条件的改变
产生较大改变。相比于ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，简单重复序列）标记来看，ＳＲＡＰ标记的多态性较高［１５，１６］，
而且ＳＲＡＰ标记具有同时扩增多个等位位点，一个标记所获得的遗传信息更多。因此，ＳＲＡＰ标记是黑麦草种质
资源研究的理想标记。
图２ ２０个黑麦草品系犛犚犃犘聚类图
犉犻犵．２ 犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳犝犘犌犕犃犮犾狌狊狋犲狉犪狀犪犾狔狊犻狊狅狀犛犚犃犘狅犳２０狉狔犲犵狉犪狊狊犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊
３．２ 供试黑麦草品系间的遗传多样性
黑麦草饲用中主要是多花黑麦草和多年生黑麦草２个种，有学者认为这两者起源不一致［２］。本研究的２０个
黑麦草品系中蓝天堂和长江２号都属于多花黑麦草，而引进的１８个品系则属于多年生黑麦草，但ＵＰＧＭＡ聚类
时并没有将２个多花黑麦草聚成一类，而是分散在不同的类群中。董晓宁等［１７］和宁婷婷等［１８］利用ＲＡＰＤ对多
年生黑麦草与多花黑麦草进行聚类，结果表明多花黑麦草也没有单独聚在一起，而是混杂在多年生黑麦草品种之
间。Ｒｏｌａｎｄｒｕｉｚ等［１９］用分子标记和形态学特征分别对１６个黑麦草品系进行聚类，发现分子标记与形态学聚类
结果差别较大。这可能是因为表型的一致与否不一定能完全反映遗传关系。
另一方面，本研究的聚类结果有较高的可信度。试验中所有来源于地中海沿岸国家的黑麦草品系都聚在第
二类，而来源于阿尔及利亚的２个黑麦草品系都聚在第三类里。尤其是长江２号品种是我国自主选育的品种，它
与其他品种间存在着地域差异，因此与其他品系间的相似系数较低。
综合以上结果可以看出，多年生黑麦草与多花黑麦草有可能是同一个起源。当然由于本研究所使用的多花
黑麦草和多年生黑麦草的品系较少，因而对于这一问题还需要进一步研究。
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ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｂｅｔｗｅｅｎｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲Ｌ．）ｖａｒｉｅｔｉｅｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３：
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犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳２０狉狔犲犵狉犪狊狊犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊犫狔犛犚犃犘犿犪狉犽犲狉狊
ＬＩＪｉｅｑｉｎ１，ＷＡＮＧＬｉｈｕａ１，ＺＨＡＮＱｉｕｗｅｎ１，ＺＨＵＫｕｉ１，ＬＩＵＪｉｎｇｌｉａｎｇ２，ＬＩＷａｎｘｉａｎｇ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡｎｈｕｉＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｆｅｎｇｙａｎｇ２３３１００，Ｃｈｉｎａ；２．ＡｎｈｕｉＧｏｌｄｅｎＴｕｏＬａｋｅＣｒａｂＬｉｍｉｔｅｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｕｈｅ２３３３００，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ）ｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ａｍｏｎｇ２０ｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿）ｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ７６５ｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙ５３ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓｗｅｒｅ５９７ｗｈｉｃｈａｃｃｏｕｎｔｅｄｆｏｒ７８．９５％ｉｎｔｈｅｔｏｔａｌａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｍｐｌｉ
ｆｉｅｄａｎｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｆｒａｇｍｅｎｔｓｗａｓ１４．４３ａｎｄ１１．２６ｐｅｒｐｒｉｍｅｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．４８５ｔｏ０．７２７ａｍｏｎｇｔｈｅｓｅｒｙｅｇｒａｓｓｌｉｎｅｓａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｗａｓ０．６２７．Ｕｓｉｎｇｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ
ｐａｉｒｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈａｒｉｔｈｍｅｔｉｃｍｅａｎｓ（ＵＰＧＭＡ）ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｎｔｈｅＳＲＡＰｍａｒｋｅｒｓ，ｔｈｅｓｅｒｙｅｇｒａｓｓ
ｌｉｎｅｓｃｏｕｌｄｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓｂｙｔｈｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄｏｆ０．６３．Ｔｗｏ犔狅犾犻狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿ｌｉｎｅｓｃｏｕｌｄｎｏｔｂｅ
ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏａｇｒｏｕｐｂｕｔｓｐｒｅａｄｉｎ１８犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲ｌｉｎｅｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｃｌｕｓｔｅｒｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈ
ｔｈｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆｔｈｅｓｅｒｙｅｇｒａｓｓｌｉｎｅｓ．ＡｌｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔＳＲＡＰｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆ
ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｎｒｙｅｇｒａｓｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｒｙｅｇｒａｓｓｌｉｎｅｓ；ＳＲＡＰ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＵＰＧＭＡ
４６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２