全 文 ：书结缕草肌动蛋白基因全长犮犇犖犃的
克隆及序列分析
王舟１，２，宗俊勤２，宣继萍２，郭爱桂２，刘建秀２
（１．南京农业大学生命科学学院，江苏 南京２１００９５；２．江苏省中国科学院植物研究所 南京中山植物园，江苏 南京２１００１４）
摘要：根据植物肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）基因编码区的保守序列设计引物，提取结缕草叶片的总ＲＮＡ，进行ＲＴ－ＰＣＲ。并
采用ＲＡＣＥ技术扩增出１５６０ｂｐ的Ａｃｔｉｎ基因全长ｃＤＮＡ序列。序列分析表明，该基因的开放阅读框（ＯＲＦ）为
１１３４ｂｐ，编码３７７个氨基酸，５′非编码区１１７ｂｐ，３′非编码区３０９ｂｐ。所得序列与ＧｅｎＢａｎｋ中收录的其他植物肌
动蛋白核苷酸序列的一致性均在８５％以上，氨基酸序列的一致性高达９７％以上。将其命名为犣犼犃犆犜，ＧｅｎＢａｎｋ登
录号为ＧＵ２９０５４５。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统进化树显示，结缕草肌动蛋白与大麦和圆锥小麦肌
动蛋白之间的亲缘关系最为密切，在进化中分化时间最为接近。进一步分离克隆了结缕草 Ａｃｔｉｎ基因的基因组
ＤＮＡ序列（登录号ＧＵ２９０５４６），它由４个外显子和３个内含子组成。本研究有助于揭示植物 Ａｃｔｉｎ基因家族的进
化历史，为研究植物Ａｃｔｉｎ基因家族功能和进化上的多样性奠定理论基础，同时也为开展草坪草和牧草Ａｃｔｉｎ基因
的功能分析和利用研究提供参考。
关键词：结缕草；肌动蛋白基因；克隆；序列分析
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５４３＋．９０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１０）０６０１５４１０
肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）是真核生物细胞骨架中的基本结构组分。它在微丝结合蛋白的协同作用下，形成独特的微
丝性骨架结构，与细胞中许多重要的功能活动有关［１］。在植物中，以肌动蛋白和微管蛋白为基础的细胞骨架与质
膜相关或者横贯细胞质，不同程度地影响了细胞分裂、细胞分化、细胞器定向运动、细胞极性的建立、细胞形状和
分裂板的决定、细胞内囊泡运输、细胞壁生物合成、共生现象、胞吞胞吐作用以及膜的循环利用等细胞学过程［２４］。
由于极性、细胞分裂的方向和细胞壁的沉积被认为是植物模式形成和器官形态的主要支配因素，所以肌动蛋白是
植物发育中的一个中心元件［５］。肌动蛋白在分子水平上还参与其他重要的生理过程，包括基因转录控制、ｍＲＮＡ
加工和运输等，因此，其具有重要的研究价值［６］。以植物肌动蛋白为主形成的动态微丝骨架系统已成为植物细胞
生物学研究领域的热点之一［７］。
迄今为止，已在许多高等植物，包括水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪，ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＡＹ２１２３２４和ＣＴ８３１２１５）、大麦
（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲，ＡＫ２５１０２３）、毒麦（犔狅犾犻狌犿狋犲犿狌犾犲狀狋狌犿，ＥＵ３２８５２９）、玉米（犣犲犪犿犪狔狊，ＥＵ９６７０７３）、粟（犛犲狋犪狉
犻犪犻狋犪犾犻犮犪，ＡＦ２８２６２５）、刚竹（犘犺狔犾犾狅狊狋犪犮犺狔狊犫犪犿犫狌狊狅犻犱犲狊，ＥＵ００９４５２）、拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪，ＡＹ０９６３９７）、白
杨（犘狅狆狌犾狌狊狋狅犿犲狀狋狅狊犪，ＥＦ４１８７９２）、玉 兰 （犕犪犵狀狅犾犻犪犱犲狀狌犱犪狋犪，ＡＦ２８１３２３）、花 生 （犃狉犪犮犺犻狊犺狔狆狅犵犪犲犪，
ＤＱ８７３５２５）、霸王（犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿，ＥＵ０１９５５０）、地黄（犚犲犺犿犪狀狀犻犪犵犾狌狋犻狀狅狊犪，ＥＵ５２６３９６）、碱蓬
（犛狌犪犲犱犪犵犾犪狌犮犪，ＥＵ４２９４５７）和白沙蒿（犃狉狋犲犿犻狊犻犪狊狆犺犪犲狉狅犮犲狆犺犪犾犪，ＦＪ５８７５１２和ＦＪ５１５９０５）等中克隆到了Ａｃｔｉｎ
基因［８１２］。而有关草坪草Ａｃｔｉｎ基因克隆的研究还鲜有报道。
结缕草（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪）为禾本科画眉草亚科的多年生草本植物，是一种优良的暖季型草坪草。其发达的
地下茎和匍匐茎可适应不同类型的土壤环境，具有抗寒、耐旱、耐盐碱、耐践踏、弹性好、养护要求低、适应性广、寿
命长、病虫害较少等优点，被世界公认为典型的环保型草坪草，在中国、日本、韩国以及美国等地区得到广泛应用。
特别适用于各类运动场草坪、休憩草坪、观赏草坪及社区庭院草坪等［１３１８］。随着对结缕草研究的不断深入，其分
子水平上的表达调控机制是今后研究的重要方向之一。本试验以结缕草叶片为材料，根据在其他模式植物中已
１５４－１６３
２０１０年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１９卷 第６期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１００１１１；改回日期：２０１００３２４
作者简介：王舟（１９８１），男，广西南宁人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｋｅｉｆｆｅｒ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｔｕｒｆｕｎｉｔ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
克隆的植物肌动蛋白基因序列设计引物，采用反转录扩增（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ
ＰＣＲ）和ｃＤＮＡ末端快速扩增（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ）技术从结缕草中分离肌动蛋白基因全
长ｃＤＮＡ，并进行了序列分析和内含子检测，对于研究结缕草肌动蛋白基因家族具有重要意义，为进一步开展其
他重要抗逆功能基因在结缕草中的表达和调控机制奠定基础，同时还为分析草坪草各种间的进化关系提供资料。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料 结缕草品种 Ｍｅｙｅｒ（犣．犼犪狆狅狀犻犮犪ｃｖ．Ｍｅｙｅｒ），种植于江苏省中国科学院植物研究所草业中心
的草坪草种质资源圃。
１．１．２ 菌株、质粒及试剂 大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α菌株由本实验室保存。ＲＮＡ提取试剂ＲＮＡｉｓｏＴＭ
Ｐｌｕｓ、高保真ＤＮＡ聚合酶ＴａＫａＲａＬＡＴａｑＴＭ ＨｏｔＳｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎ、克隆载体ｐＭＤＴＭ１９ＴＶｅｃｔｏｒ、ＤＮＡ分子量标
记均购自ＴａＫａＲａ公司。反转录试剂盒ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ－ＰＣＲ、ＲＡＣＥ试
剂盒ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ Ｋｉｔ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品。引物合成及测序均由上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司完成。其他试剂为国
产分析纯。
１．２ 方法
１．２．１ 结缕草叶片总ＲＮＡ的提取 取结缕草 Ｍｅｙｅｒ的幼嫩叶片１ｇ左右在液氮中研磨至粉状，按照ＲＮＡｉ
ｓｏＴＭＰｌｕｓ的操作说明提取总ＲＮＡ。
１．２．２ 结缕草Ａｃｔｉｎ基因保守片段的克隆 根据ＧｅｎＢａｎｋ中已收录的植物Ａｃｔｉｎ基因同源核苷酸保守序列设
计特异性引物Ａｃｔ１：５′ＣＴＴＡＡＣＣＣＴＡＡＧＧＣＴＡＡＣＡＧ３′和Ａｃｔ２：５′ＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＣＴ３′。
按ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）试剂盒所提供的试剂及使用说
明书的要求进行如下操作：取新提取的总ＲＮＡ１１μＬ，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８１μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，６５℃保
温５ｍｉｎ。急冷２ｍｉｎ后，加入反转录试剂盒提供的５×ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ４μＬ，０．１ｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇（ＤＴＴ）
１μＬ，ＲＮａｓｅＯｕｔ
ＴＭ１μＬ，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ
ＴＭＩＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ１μＬ，５０℃反应６０ｍｉｎ，７０℃１５ｍｉｎ，冰浴２
ｍｉｎ。再加入１μＬＲＮａｓｅＨ，３７℃保温２０ｍｉｎ。
取１μＬ上述反转录反应产物，用高保真酶ＴａＫａＲａＬＡＴａｑ
ＴＭ ＨｏｔＳｔａｒｔＶｅｒｓｉｏｎ进行ＰＣＲ扩增。反应条件
为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经
过１％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带，用ＡｘｙＰｒｅｐＴＭ ＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ａｘｙｇｅｎ）回收产物，连接
至ｐＭＤＴＭ１９ＴＶｅｃｔｏｒ，转化ＤＨ５α感受态细胞，挑选阳性克隆送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序。
１．２．３ ５′和３′ＲＡＣＥ扩增获得结缕草Ａｃｔｉｎ基因的５′和３′末端 根据保守片段的测序结果和ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ Ｋｉｔ
的要求设计５′ＲＡＣＥ 基因特异性引物（５′ＧＳＰ）：５′ＣＴＣＡＴＡＣＧＧＴＣＡＧＣＡＡ３′，巢式基因特异性引物
（５′Ｎｅｓｔ）：５′ＧＣＡＣＡＧＴＡＴＧＧＣＴＣＡＣＡ３′；３′ＲＡＣＥ基因特异性引物（３′ＧＳＰ）：５′ＴＡＡＣＣＣＴＡＡＧＧＣＴＡ
ＡＣＡ３′，巢式基因特异性引物（３′Ｎｅｓｔ）：５′ＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡ３′。按ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ Ｋｉｔ所提供的试剂
和说明书要求进行操作。１％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物，ＡｘｙＰｒｅｐＴＭ ＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ对目的条带
进行回收，与ｐＭＤＴＭ１９ＴＶｅｃｔｏｒ连接，转化ＤＨ５α感受态细胞并送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序。
１．２．４ 结缕草Ａｃｔｉｎ基因全长ｃＤＮＡ的获得与序列分析 通过ＤＮＡＳＴＡＲ软件对所得片段的核苷酸序列进行
拼接，获得全长ｃＤＮＡ序列。据此设计全长基因两端的特异性引物Ｆ１：５′ＴＣＧＣＣＧＴＣＣＧＴＴＴＣ３′，Ｆ２：５′
ＧＡＣＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＴＣＣ３′，扩增全长并测序。应用美国生物技术信息中心（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）的开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）查找工具ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ对所得全长序列进行
分析，得出该基因的ＯＲＦ及其５′非编码区和３′非编码区，并推测出其氨基酸序列。分别用专家蛋白分析系统
（ＥｘｐｅｒｔＰｒｏｔｅｉｎＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ，ＥｘＰＡＳｙ）的ｐＩ／Ｍｗ和ＳｉｇｎａｌＰ工具计算蛋白质的分子量、等电点和信号肽预
测。使用ＮＣＢＩ中的Ｂｌａｓｔ工具对所得基因的核苷酸序列与氨基酸序列进行比对，根据结果选取其他植物的
Ａｃｔｉｎ氨基酸序列，进行ＣｌｕｓｔａｌＷ２多重比对，并将比对结果用 Ｍｅｇａ４．０软件采用邻位相连（ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ）算
法绘制成无根进化树。
５５１第１９卷第６期 草业学报２０１０年
１．２．５ 结缕草Ａｃｔｉｎ基因的基因组序列的克隆 采用新型广谱植物基因组ＤＮＡ快速提取试剂盒（北京盖宁金
诺生物技术有限责任公司产品）提取基因组ＤＮＡ，以全长引物Ｆ１：５′ＴＣＧＣＣＧＴＣＣＧＴＴＴＣ３′和Ｆ２：５′ＧＡＣ
ＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＴＣＣ３′进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ产物经纯化、连接、转化后，送测序。测序结果与ｃＤＮＡ序列比
对，寻找内含子。
２ 结果与分析
２．１ 结缕草Ａｃｔｉｎ基因保守片段的克隆
用ＲＮＡｉｓｏＴＭＰｌｕｓ提取的总ＲＮＡ在１％的琼脂糖凝胶上电泳检测，结果表明，２８ＳｒＲＮＡ与１８ＳｒＲＮＡ的亮
度比例达到２∶１（图１），说明ＲＮＡ的完整性较好，可用于反转录及后续试验。
用保守片段引物Ａｃｔ１，Ａｃｔ２进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，获得约７００ｂｐ的条带（图２）。经测序及ＮＣＢＩＢｌａｓｔ比
对，确定为结缕草肌动蛋白Ａｃｔｉｎ基因ｃＤＮＡ片段。
２．２ 结缕草Ａｃｔｉｎ基因ｃＤＮＡ的５′，３′端扩增（ＲＡＣＥ）和全长ｃＤＮＡ的获得
根据上述获得的７０２ｂｐ保守片段序列，设计基因特异性引物５′ＧＳＰ和巢式基因特异性引物５′Ｎｅｓｔ，采用
５′ＲＡＣＥ方法扩增Ａｃｔｉｎ的５′端，得到１条约为６４０ｂｐ的片段（图３）。设计３′ＧＳＰ和３′Ｎｅｓｔ，采用３′ＲＡＣＥ的
方法扩增Ａｃｔｉｎ的３′端，得到１条约为８００ｂｐ的片段（图４）。测序后经ＮＣＢＩＢｌａｓｔ比对证实为Ａｃｔｉｎ的５′端和
３′端序列。使用ＤＮＡＳＴＡＲ软件对所获得的基因片段进行拼接，得到１５６０ｂｐ的全长ｃＤＮＡ序列，将其命名为
犣犼犃犆犜。以全长引物Ｆ１，Ｆ２扩增，得到约１３００ｂｐ的条带（图５），测序后与拼接全长比对，两者完全吻合。
图１ 结缕草叶片总犚犖犃
犉犻犵．１ 犜狅狋犪犾犚犖犃犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犾犲犪狏犲狊狅犳犣．犼犪狆狅狀犻犮犪
图２ 犣犼犃犆犜基因保守片段的扩增
犉犻犵．２ 犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮狅狀狊犲狉狏犲犱犱狅犿犪犻狀狅犳狋犺犲犣犼犃犆犜犵犲狀犲
图３ 犣犼犃犆犜基因５′犚犃犆犈扩增
犉犻犵．３ ５′犚犃犆犈犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犣犼犃犆犜犵犲狀犲
图４ 犣犼犃犆犜基因３′犚犃犆犈扩增
犉犻犵．４ ３′犚犃犆犈犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犣犼犃犆犜犵犲狀犲
６５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
２．３ 结缕草Ａｃｔｉｎ基因的序列分析
图５ 犣犼犃犆犜基因全长犮犇犖犃的扩增
犉犻犵．５ 犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犳狌犾犾犲狀犵狋犺犮犇犖犃狅犳狋犺犲犣犼犃犆犜犵犲狀犲
结缕草 Ａｃｔｉｎ基因的全长ｃＤＮＡ 序列为１５６０
ｂｐ，应用 ＮＣＢＩ的 ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ分析，５′非翻译区为
１１７ｂｐ，３′非翻译区为３０９ｂｐ，开放阅读框为１１３４
ｂｐ，编码３７７个氨基酸（图６）。将序列提交至 Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ数据库中，登录号为 ＧＵ２９０５４５。经 ＥｘＰＡＳｙ
ｐＩ／Ｍｗ工具计算得到理论等电点为５．２３，平均蛋白质
分子量为４１．７ｋＤ。ＳｉｇｎａｌＰ预测无信号肽序列，为非
分泌蛋白。
将此基因的核苷酸序列在ＮＣＢＩ上进行Ｂｌａｓｔｎ比
对，结果表明获得的基因全长与甘蔗（犛犪犮犮犺犪狉狌犿狅犳
犳犻犮犻狀犪狉狌犿，登录号 ＡＹ７４２２１９）的同源性最高，达
８８％；其次为大麦（ＡＹ１４５４５１），８７％；水稻（ＡＹ２１２３２４），
８６％；粟（ＡＦ２８８２２６），８５％。对由该基因推测的氨基
酸序列作Ｂｌａｓｔｐ比对分析，结果显示序列中含有多个
Ａｃｔｉｎ基因家族的特异性结合位点（图７），并将部分比
对结果列于表１。可以看出，结缕草Ａｃｔｉｎ基因的氨基
酸序列与其他植物的一致性很高，最高达到了９９％，
如禾本科的大麦、圆锥小麦（表１）。由此可见，植物肌
动蛋白基因高度保守，这与它参与细胞的重要生命活
动是密切相关的。
将结缕草 Ａｃｔｉｎ基因的氨基酸序列与 ＧｅｎＢａｎｋ
中一致性较高的１６种植物的２２条Ａｃｔｉｎ蛋白进行了
多重比较分析（图８）。可以看出，不同植物的Ａｃｔｉｎ氨
基酸序列只在个别位置发生了突变。
根据多重比对结果，将其绘制成系统进化树（图
９）。可以看出，结缕草肌动蛋白（ＺｊＡＣＴ）与大麦
（Ｈｖａｃｔｉｎ：ＡＡＮ５９９５６）和 圆 锥 小 麦 （ＴｔＡＣＴ１：
ＡＡＷ７８９１１）肌动蛋白的亲缘关系最为密切，其次与甘
蔗 （Ｓｓａｃｔｉｎ：ＡＡＵ９３３４６）和 玉 米 （Ｚｍａｃｔｉｎ９７：
ＡＣＧ３３１５２）的肌动蛋白具有相对较近的亲缘关系。
同种植物肌动蛋白的基因家族各成员之间如拟南芥
（Ａｔａｃｔｉｎ２：ＡＡＡ８０３５６，ＡｔＡＣＴ７：ＡＡＢ５２５０６）、向日
葵（ＨａＡＣＴ１：ＡＣＬ２７８８５，ＨａＡＣＴ２：ＡＣＬ２７８８６）等都
集中的分布在各自的小进化群中，这说明植物 Ａｃｔｉｎ
基因之间的进化可能只是在少数核苷酸上发生了突
变。此外，还可以看出单子叶植物与双子叶植物的肌
动蛋白在进化中相互交叉，表明被子植物肌动蛋白基
因家族起源于一个远早于单、双子叶植物分化前的共
同祖先［１９，２０］。
表１ 犣犼犃犆犜基因氨基酸序列的犫犾犪狊狋狆比对结果
犜犪犫犾犲１ 犅犾犪狊狋狆犪犾犻犵狀犿犲狀狋狉犲狊狌犾狋狊狅犳狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱
犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犣犼犃犆犜
植物种名
Ｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ
基因名
Ｇｅｎｅ
ｎａｍｅ
ＧｅｎＢａｎｋ登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ
一致性
Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ
大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲 ａｃｔｉｎ ＡＡＮ５９９５６ ３７５／３７７（９９％）
圆锥小麦犜狉犻狋犻犮狌犿狋狌狉犵犻犱狌犿 ＡＣＴ１ ＡＡＷ７８９１１ ３７５／３７７（９９％）
圆锥小麦犜．狋狌狉犵犻犱狌犿 ＡＣＴ１ ＡＡＷ７８９１５ ３７５／３７７（９９％）
粟犛．犻狋犪犾犻犮犪 ａｃｔｉｎ ＡＡＧ１００４１ ３７３／３７７（９８％）
甘蔗犛．狅犳犳犻犮犻狀犪狉狌犿 ａｃｔｉｎ ＡＡＵ９３３４６ ３７２／３７７（９８％）
玉米犣．犿犪狔狊 ａｃｔｉｎ９７ ＡＣＧ３３１５２ ３７２／３７７（９８％）
玉米犣．犿犪狔狊 ａｃｔｉｎ９７ ＡＣＧ４１６３９ ３７２／３７７（９８％）
水稻犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪 Ａｃｔ ＡＡＯ６２５４６ ３７１／３７７（９８％）
水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ａｃｔｉｎ ＡＡＸ９５０９８ ３７１／３７７（９８％）
水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ａｃｔｉｎ ＡＡＸ９５０９９ ３７１／３７７（９８％）
水稻犗．狊犪狋犻狏犪 ａｃｔｉｎ ＡＡＸ９５１００ ３７１／３７７（９８％）
拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪 ａｃｔｉｎ２ ＡＡＡ８０３５６ ３６９／３７７（９７％）
拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪 ＡＣＴ７ ＡＡＢ５２５０６ ３６９／３７７（９７％）
玉米犣．犿犪狔狊 ａｃｔｉｎ２ ＡＣＧ２４４９４ ３６９／３７７（９７％）
玉米犣．犿犪狔狊 ａｃｔｉｎ７ ＡＣＧ３８３６２ ３６９／３７７（９７％）
玉米犣．犿犪狔狊 ａｃｔｉｎ７ ＡＣＧ４１３９７ ３６９／３７７（９７％）
甘草犌犾狔犮狔狉狉犺犻狕犪狌狉犪犾犲狀狊犻狊 ａｃｔｉｎ ＡＢＷ７１６８１ ３６７／３７７（９７％）
绿豆犞犻犵狀犪狉犪犫犻犪狋犪 ａｃｔｉｎ ＡＡＦ３１６４３ ３６６／３７７（９７％）
香蕉犕狌狊犪狀犪狀犪 ＡＣＴ１ ＡＡＫ８２９９１ ３６６／３７７（９７％）
油菜犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊 ａｃｔｉｎ ＡＡＤ０３７４１ ３６６／３７７（９７％）
棉花犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿 ＡＣＴ２ ＡＡＰ７３４４９ ３６６／３７７（９７％）
棉花犌．犺犻狉狊狌狋狌犿 ＡＣＴ１１ ＡＡＰ７３４５７ ３６６／３７７（９７％）
向日葵犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊犪狀狀狌狊 ＡＣＴ１ ＡＣＬ２７８８５ ３６６／３７７（９７％）
向日葵犎．犪狀狀狌狊 ＡＣＴ２ ＡＣＬ２７８８６ ３６６／３７７（９７％）
圆叶锦葵犕犪犾狏犪狆狌狊犻犾犾犪 Ａｃｔ１ ＡＡＤ４１０３９ ３６６／３７７（９７％）
甜叶菊犛狋犲狏犻犪狉犲犫犪狌犱犻犪狀犪 ａｃｔｉｎ ＡＡＮ４０６８５ ３６６／３７７（９７％）
板蓝根犐狊犪狋犻狊狋犻狀犮狋狅狉犻犪 ａｃｔｉｎ ＡＡＷ６３０３０ ３６６／３７７（９７％）
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图６ 犣犼犃犆犜的核苷酸序列和推测的氨基酸序列（犌犲狀犅犪狀犽登录号犌犝２９０５４５）
犉犻犵．６ 犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳
犣犼犃犆犜（犌犲狀犅犪狀犽犪犮犮犲狊狊犻狅狀犖狅．犌犝２９０５４５）
２．４ 结缕草Ａｃｔｉｎ基因的基因组序列的获得及分析
以基因组ＤＮＡ为模板，全长引物Ｆ１，Ｆ２扩增得到一个约１６００ｂｐ的条带（图１０），测序确定该片段长１５９２
ｂｐ。与全长ｃＤＮＡ序列比较，发现该基因的基因组序列由４个外显子（Ｅｘｏｎ）和３个内含子（Ｉｎｔｒｏｎ）组成（图
１１）。内含子分别长９２，８９和１０７ｂｐ，每个内含子都具有保守的５′ＧＴ供体位点和３′ＡＧ受体位点。序列登录
ＧｅｎＢａｎｋ，登录号ＧＵ２９０５４６。对于肌动蛋白基因的研究表明，绝大多数肌动蛋白基因含有４个外显子和３个内
含子，而且内含子的位置高度保守［２１］，本试验结果与之相符。并且各外显子连接区域的氨基酸序列高度保守［２２］
（图６中用下划线标出）。此外，该基因的编码区中同义密码子有偏态的使用情况，使外显子的ＡＴ含量（５０．０％
～５４．６％）低于内含子（５１．１％～６８．２％），据报道这是禾本科单子叶植物基因序列特有的现象［２３］。
８５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
图７ 推测的保守结合域
犉犻犵．７ 犘狌狋犪狋犻狏犲犮狅狀狊犲狉狏犲犱犱狅犿犪犻狀狊
图８ 犣犼犃犆犜与其他植物同源基因的氨基酸序列比较
犉犻犵．８ 犃犾犻犵狀犿犲狀狋狊狅犳狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犣犼犃犆犜犪狀犱犻狋狊犺狅犿狅犾狅犵狊犻狀狅狋犺犲狉犺犻犵犺犲狉狆犾犪狀狋狊
黑色表示相同的氨基酸，彩色表示部分保守的氨基酸Ｉｄｅｎｔｉｃａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｒｅｓｈａｄｅｄｉｎｂｌａｃｋ，ｐａｒｔｉａｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｓｉｄｕｅｓａｒｅｅｘｈｉｂｉｔｅｄｉｎｃｏｌｏｒ．
比对的氨基酸序列包括ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｃｌｕｄｅＺｊＡＣＴ：ＡＤＢ８００３１；Ｈｖａｃｔｉｎ：ＡＡＮ５９９５６；ＴｔＡＣＴ１：ＡＡＷ７８９１１；ＭＩＡｃ：ＡＡＧ１００４１；Ｓｓａｃ
ｔｉｎ：ＡＡＵ９３３４６；Ｚｍａｃｔｉｎ９７：ＡＣＧ３３１５２；ＯｓＡｃｔ８：ＡＡＯ６２５４６；Ａｔａｃｔｉｎ２：ＡＡＡ８０３５６；ＡｔＡＣＴ７：ＡＡＢ５２５０６；Ｚｍａｃｔｉｎ２：ＡＣＧ２４４９４；Ｚｍａｃｔｉｎ７：
ＡＣＧ３８３６２；Ｇｕａｃｔｉｎ：ＡＢＷ７１６８１；Ｖｒａｃｔｉｎ：ＡＡＦ３１６４３；ＭｕｓａＡＣＴ１：ＡＡＫ８２９９１；Ｂｎａｃｔｉｎ：ＡＡＤ０３７４１；ＧｈＡＣＴ２：ＡＡＰ７３４４９；ＧｈＡＣＴ１１：ＡＡＰ７３４５７；
ＨａＡＣＴ１：ＡＣＬ２７８８５；ＨａＡＣＴ２：ＡＣＬ２７８８６；ＭｐＡｃｔ１：ＡＡＤ４１０３９；Ｓｒａｃｔｉｎ：ＡＡＮ４０６８５；Ｉｔａｃｔｉｎ：ＡＡＷ６３０３０；下同Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
３ 讨论
肌动蛋白是真核生物细胞中普遍存在的最保守的古老蛋白之一，具有重要的生理功能。一般认为肌动蛋白
在各种生物中通过复制和变异而被保留下来，动植物肌动蛋白起源于一个共同的祖先［２４，２５］。Ｈｉｇｈｔｏｗｅｒ和 Ｍｅａ
９５１第１９卷第６期 草业学报２０１０年
ｇｈｅｒ［２６］的研究表明，植物与动物肌动蛋白之间的氨基酸序列差异在１１％～１５％，大豆与玉米肌动蛋白间存在
８％～１０％的氨基酸取代，而大豆肌动蛋白异型体之间仅存在６％～９％的氨基酸取代。本试验从结缕草中分离
得到的Ａｃｔｉｎ基因全长核苷酸序列与其他植物Ａｃｔｉｎ基因核苷酸序列的同源性均在８５％以上，而氨基酸序列的
同源性更高，最高达到了９９％。曹晓风等［２７］对几种高等植物肌动蛋白的氨基酸序列进行比较发现，在这些肌动
蛋白一级结构上存在一系列不连续的、高度保守的区域，这些结构被认为是肌动蛋白与肌动蛋白、肌动蛋白与肌
动蛋白结合蛋白相互作用的功能位点。对本研究克隆的犣犼犃犆犜编码的氨基酸序列分析，发现同样存在５个这
样的区域（图６中用方框标出）。以上结果进一步证明了各植物之间的肌动蛋白基因无论是其核苷酸序列（包括
内含子的数目与位置、与肌动蛋白结合蛋白作用的区域等）还是编码的氨基酸序列都具有高度的保守性和同源
性，这种高度保守性与肌动蛋白行使细胞骨架的重要功能是相适应的。
图９ 肌动蛋白犃犮狋犻狀家族的系统进化树分析
犉犻犵．９ 犃狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犃犮狋犻狀狆狉狅狋犲犻狀狊
基因后面的数字表示进化距离Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓａｆｔｅｒｇｅｎｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｄｉｓｔａｎｃｅｓ
许多研究结果表明，不同的生物中肌动蛋白的数
目变化很大［１９，２８］。除少数单细胞原生动物、藻类、酵母
图１０ 犣犼犃犆犜基因的犇犖犃序列扩增
犉犻犵．１０ 犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃狊犲狇狌犲狀犮犲
狅犳狋犺犲犣犼犃犆犜犵犲狀犲
类外，高等植物肌动蛋白基因同动物及真菌肌动蛋白
基因一样，属于多基因家族，如大豆中有６个编码肌动
蛋白的基因［２９］、玉米有６个［３０］、马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌
犫犲狉狅狊狌犿）有５个［３１］、番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）
有１０个［３２］、水稻有４个［３３］、拟南芥有１０个［３４］。且其
基因是多拷贝的［２８］，如大豆肌动蛋白基因拷贝数在６
以上，玉米肌动蛋白基因至少有２个拷贝，水稻肌动蛋
白基因拷贝数在１０以上［３５］。所有的多细胞真核生物
的肌动蛋白都由多基因家族编码，因而具有数量不等
的异型体。各异型体基因的编码区保守性很强，但非
编码区差异较大，其表达具有时间和空间上的差
异［３６］，以适应不同组织和细胞类型在不同发育时期的
０６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
图１１ 犣犼犃犆犜基因组犇犖犃序列的结构示意图
犉犻犵．１１ 犛犮犺犲犿犪狋犻犮狉犲狆狉犲狊犲狀狋犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犣犼犃犆犜
需要。本试验所获得的结缕草肌动蛋白基因全长由于包括了完整的开放阅读框，因此，可以从其编码氨基酸的保
守性上判断是常规肌动蛋白，而非异型体［３７］，可以作为研究其他功能基因的表达模式及调控机制的内参基因［３８］。
更重要的是，该全长ｃＤＮＡ在结缕草基因组中含有３个内含子，设计跨内含子的引物可有效避免基因组ＤＮＡ的
扩增，因此，可作为该类植物基因表达研究中的理想内参。
由于肌动蛋白基因在进化上的保守性，常被用于构建物种和基因系统进化树，来衡量不同物种之间的亲缘关
系和分化时间［３９４１］。由１６个物种的２２种肌动蛋白构建的系统进化树显示，单、双子叶植物的肌动蛋白在进化中
相互交叉，说明植物肌动蛋白基因的分化可能早于单子叶和双子叶植物的分化，是由同一个祖先进化而来。
Ｍｏｎｉｚ和Ｄｒｏｕｉｎ［３９］认为被子植物肌动蛋白基因存在２个独立的分化系，其中一个由双子叶植物组成，另一个由
单子叶和双子叶植物共同组成，但并非所有双子叶植物的肌动蛋白基因都落在这２个（群）系。不属于这２个系
的肌动蛋白基因则与由这２个（群）系的成员构成的整个群系呈姐妹平行关系［４０］。由于植物肌动蛋白基因成员
组成的广泛性和分化性，当前已知的肌动蛋白基因仅为植物肌动蛋白家族的一部分，根据肌动蛋白基因序列构建
的系统树还只是基因的分子进化树，虽然在区分亲缘关系较远的物种时具有一定的参考价值，但对具较近亲缘关
系的物种则无法做出精确衡量。完善的物种进化树有待于今后更多肌动蛋白基因的发现和系统进化分析方法的
改进和完善。
分子进化研究通常都是利用具有保守性且进化速率恒定的蛋白质或其ＤＮＡ序列，这就需要大量的分子资
料和信息。肌动蛋白及其基因研究的进一步深入和资料的进一步积累会有利于了解肌动蛋白的保守性和变异性
与生命起源和进化的关系。目前，基于植物肌动蛋白基因的分子进化树已经绘制。而有关草坪草和牧草肌动蛋
白研究的报道很少。本试验所克隆得到的结缕草肌动蛋白全长基因犣犼犃犆犜是首次在ＧｅｎＢａｎｋ中注册的结缕草
肌动蛋白基因。该基因是结缕草属中最具代表性的四倍体植物的肌动蛋白基因。本研究结果不仅填补了草坪草
肌动蛋白研究领域的空白，同时丰富了肌动蛋白研究的资料库。
随着越来越多的肌动蛋白基因的克隆和序列测定，对基因本身结构、功能和表达的分析越来越精确，从而促
进了肌动蛋白基因在作物改良上的应用研究。此外，Ａｃｔｉｎ作为一种广泛参与真核细胞生理过程的管家基因，在
基因表达调控研究时被广泛用作分子内参。
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犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犳狌犾犾犲狀犵狋犺犮犇犖犃狅犳犪狀犪犮狋犻狀犵犲狀犲犳狉狅犿狕狅狔狊犻犪犵狉犪狊狊（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪）
ＷＡＮＧＺｈｏｕ１，２，ＺＯＮＧＪｕｎｑｉｎ２，ＸＵＡＮＪｉｐｉｎｇ２，ＧＵＯＡｉｇｕｉ２，ＬＩＵＪｉａｎｘｉｕ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＢｏｔａｎｙ，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ＆ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｏｎｅ１５６０ｂｐｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＡｃｔｉｎｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｌｅａｖｅｓｏｆｚｏｙｓｉａｇｒａｓｓｕｓｉｎｇＲＴ－ＰＣＲａｎｄ
ＲＡＣＥｍｅｔｈｏｄｓ．ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｉｔｃｏｎｔａｉｎｅｄａｎＯＲＦｏｆ１１３４ｂｐｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍ
ｐｏｓｅｄｏｆ３７７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ａ５′ＵＴＲｏｆ１５７ｂｐａｎｄａ３′ＵＴＲｏｆ４９５ｂｐ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｔ
ｓｈａｒｅｄｏｖｅｒ８５％ｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓａｎｄ９７％ｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓｗｉｔｈａｃｔｉｎｓｆｒｏｍｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓｉｎＧｅｎ
Ｂａｎｋ．ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｗａｓｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ犣犼犃犆犜ｗｉｔｈｉｔｓａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＧＵ２９０５４５．Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆａｃｔｉｎｓｆｒｏｍｚｏｙｓｉａｇｒａｓｓ
ｗａｓｍｏｓｔｉｎｔｉｍａｔｅｗｉｔｈｔｈａｔｆｒｏｍｂａｒｌｅｙａｎｄｐｏｕｌａｒｄｗｈｅａｔ，ａｎｄｔｈｅｙｍｉｇｈｔｓｈａｒｅｔｈｅｓａｍｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｉｍｅｉｎ
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ＡｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｃＤＮＡａｎｄｉｔｓｇｅｎｏｍｉｃｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ（ＧＵ２９０５４６）ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｅ
ｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆ４ｅｘｏｎｓａｎｄ３ｉｎｔｒｏｎｓ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅｄｃｌｕｅｓｆｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅａｃｔｉｎｇｅｎｅｆａｍｉ
ｌｙ，ａｎｄｏｎｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａｓｗｅｌａｓｓｅｒｖｅｄａｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓａｎｄ
ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｃｔｉｎｇｅｎｅｆｒｏｍｔｕｒｆａｎｄｆｏｒａｇｅｇｒａｓｓｅｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪；Ａｃｔｉｎ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ
３６１第１９卷第６期 草业学报２０１０年