全 文 ：书３种生态型野生扁蓿豆种质资源犐犛犛犚与
犛犛犚遗传多样性分析
李鸿雁１，李志勇１，师文贵１，蔡丽艳１，张静萍２
（１．中国农业科学院草原研究所 农业部沙尔沁牧草资源重点野外科学观测试验站，内蒙古 呼和浩特０１００１０；
２．内蒙古大学交通学院，内蒙古 呼和浩特０１００２１）
摘要：遗传多样性的量化与分类是收集和利用种质资源的重要前提。运用ＳＳＲ和ＩＳＳＲ技术分析扁蓿豆种质资源
的遗传多样性。从供试材料中筛选到具有多态性的ＳＳＲ引物１８对，ＩＳＳＲ引物１８条。ＳＳＲ引物共扩增到１０９条
清晰的多态性条带，多态性比率为８０．０９％，相似系数变化范围为０．６６９～０．８８５。ＩＳＳＲ引物共扩增到１２５条清晰
的多态性条带，多态性比率为８７．０８％，相似系数变化范围为０．４４８～０．８１１。对２种标记结果进行 ＵＰＧＭＡ聚类
分析，结果表明，扁蓿豆材料部分聚为１类，黄花扁蓿豆材料大部分聚为１类。Ｍａｎｔｅｌ检测显示，２种标记的遗传相
似性呈显著相关（狉＝０．０１９６，狋＝０．１２１２），扁蓿豆比黄花扁蓿豆的遗传多样性水平稍高，细叶扁蓿豆之间的遗传差
异较大。
关键词：扁蓿豆；ＩＳＳＲ；ＳＳＲ；遗传多样性
中图分类号：Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０５０１０７０７
苜蓿属扁蓿豆植物在内蒙古境内有１个正种、３个变种，即扁蓿豆（犕犲犱犻犮犪犵狅狉狌狋犺犲狀犻犮犪）、细叶扁蓿豆（犕．
狉狌狋犺犲狀犻犮犪ｖａｒ．狅犫犾狅狀犵犻犳狅犾犻犪）、辽西扁蓿豆（犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪ｖａｒ．犾犻犪狅狊犻犲狀狊犻狊）和阴山扁蓿豆（犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪ｖａｒ．犻狀狊
犮犺犪狀犻犮犪）［１］。从形态分类上目前有学者在内蒙古发现扁蓿豆新类型，即野生黄花型扁蓿豆［１］。扁蓿豆是苜蓿遗
传改良的重要优异基因来源，具有重要的利用价值。近年来国家牧草种质中期库收集、保存、鉴定评价了２１０份
野生扁蓿豆种质资源，对筛选出的优良材料从形态学水平、细胞水平和ＤＮＡ水平进行遗传多样性的系统研究。
ＳＳＲ和ＩＳＳＲ等技术已先后应用于该植物的遗传多样性研究［２６］，基于ＤＮＡＰＣＲ的分子标记技术已成为形
态学之外的主要分析手段之一。不同分子标记在遗传多样性研究中表现出各自的特性。选择合适的分子标记对
能否客观反映研究对象的状况具有重要影响。ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）是一种利用重复序列加选择
性碱基为引物，对基因组ＤＮＡ进行扩增的标记［６］，ＩＳＳＲ引物序列长，退火温度高，特异性和稳定性增强，可检测
到更丰富的遗传变异。ＩＳＳＲ技术在一些重要的牧草，如无芒雀麦（犅狉狅犿狌狊犻狀犲狉犿犻狊）、昆仑锦鸡儿（犆犪狉犪犵犪狀犪狆狅
犾狅狌狉犲狀狊犻）、小花棘豆（犗狓狔狋狉狅狆犻狊犵犾犪犫狉犪）和新麦草（犘狊犪狋犺狔狉狅狊狋犪犮犺狔狊犼狌狀犮犲犪）的遗传多样性分析方面取得了很大
进展［７１０］。Ｍａｒｔｉｎ和ＳａｎｃｈｅｚＹｅｌａｍｏ［１１］研究表明ＩＳＳＲ标记与形态学、生化及其他分子标记存在较高一致性。
ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）是目前应用最为广泛的分子标记技术之一，具有理想分子标记绝大多数的优良特
点，且苜蓿属ＳＳＲ引物在种属间具有一定通用性［１２］，近年来，微卫星技术广泛应用于披碱草（犈犾狔犿狌狊犱犪犺狌狉犻
犮狌狊）、鸭茅（犇犪犮狋狔犾犻狊犵犾狅犿犲狉犪狋犪）、苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）、锦鸡儿属（犆犪狉犪犵犪狀犪）等牧草的遗传多样性分析
中［１３１６］。本研究选取二倍体的黄花型扁蓿豆、细叶扁蓿豆和扁蓿豆为实验材料，对ＩＳＳＲ和ＳＳＲ标记在扁蓿豆种
质资源研究的可应用性进行探讨，并结合种间关系分析比较两者的标记效率和多样性检测能力。
１ 材料与方法
１．１ 材料
供试材料为６份黄花型扁蓿豆、２份细叶扁蓿豆和６份扁蓿豆，均为国家牧草中期库课题组野外考察收集的
第２１卷 第５期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１０７－１１３
２０１２年１０月
收稿日期：２０１１０９１５；改回日期：２０１１１０２１
基金项目：农业部农作物种质资源保护与利用项目“多年生牧草更新复壮与利用”（ＮＢ２０１１２１３０１３５３３）和农业部牧草种质资源保护项目“牧草
温带备份库的维护与备份繁殖入库”（２０１０４３）资助。
作者简介：李鸿雁（１９６４），女，辽宁锦州人，副研究员，博士。
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｉｙｏｎｇｌｉ１２１６＠１２６．ｃｏｍ
材料，原产内蒙古（表１）。于２００６年种植在农业部沙尔沁牧草资源重点野外科学观测试验站。经田间形态鉴定
评价后，分别于２００８年和２００９年在中国农业科学院国家农作物种质资源保存中心实验室及国家牧草种质中期
库分子生物学实验室进行ＳＳＲ和ＩＳＳＲ标记分析。
表１ １４份扁蓿豆种质来源及编号
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犮狅犱犲犪狀犱狅狉犻犵犻狀狅犳狋犺犲１４犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊狅犳犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪
序号Ｃｏｄｅ 种质名称Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｎａｍｅ 原产地Ｏｒｉｇｉｎ
１ 细叶扁蓿豆犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪ｖａｒ．狅犫犾狅狀犵犻犳狅犾犻犪 内蒙古锡林郭勒盟白音锡勒ＢａｉｙｉｎｘｉｌｅＣｏｕｎｔｙ，ＸｉｌｉｎｇｏｌｅｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
２ 细叶扁蓿豆犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪ｖａｒ．狅犫犾狅狀犵犻犳狅犾犻犪 内蒙古海拉尔市 ＨａｉｌａｅｒＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
３ 黄花扁蓿豆 犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪（ｙｅｌｏｗｔｙｐｅ） 内蒙古通辽市ＴｏｎｇｌｉａｏＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
４ 黄花扁蓿豆 犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪（ｙｅｌｏｗｔｙｐｅ） 内蒙古包头土右旗 ＴｕｙｕｏＣｏｕｎｔｙｏｆＢａｏｔｏｕＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
５ 黄花扁蓿豆 犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪（ｙｅｌｏｗｔｙｐｅ） 内蒙古通辽市ＴｏｎｇｌｉａｏＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
６ 黄花扁蓿豆 犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪（ｙｅｌｏｗｔｙｐｅ） 内蒙古呼和浩特市 ＨｕｈｈｏｔＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
７ 黄花扁蓿豆 犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪（ｙｅｌｏｗｔｙｐｅ） 内蒙古通辽市ＴｏｎｇｌｉａｏＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
８ 黄花扁蓿豆 犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪（ｙｅｌｏｗｔｙｐｅ） 内蒙古赤峰市ＣｈｉｆｅｎｇＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
９ 扁蓿豆犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪 内蒙古锡林郭勒盟锡林浩特市 ＸｉｌｉｎｈａｏｔｅＣｉｔｙ，ＸｉｌｉｎｇｏｌｅｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
１０ 扁蓿豆犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪 内蒙古锡林郭勒盟西苏旗 ＸｉｓｕＣｏｕｎｔｙ，ＸｉｌｉｎｇｏｌｅｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
１１ 扁蓿豆犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪 内蒙古通辽市ＴｏｎｇｌｉａｏＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
１２ 扁蓿豆犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪 内蒙古呼和浩特市 ＨｕｈｈｏｔＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
１３ 扁蓿豆犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪 内蒙古呼和浩特市武川县 ＷｕｃｈｕａｎＣｏｕｎｔｙ，ＨｕｈｈｏｔＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
１４ 扁蓿豆犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪 内蒙古包头市达茂旗 ＤａｍａｏＣｏｕｎｔｙｏｆＢａｏｔｏｕＣｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
１．２ ＰＣＲ扩增
１．２．１ ＤＮＡ提取 每份材料随机选取３０个单株的新鲜叶片，用ＳＤＳ法略加改进提取每个单株叶片基因组
ＤＮＡ。
１．２．２ ＩＳＳＲ扩增和检测 参考加拿大哥伦比亚大学提供的二核苷酸重复ＩＳＳＲ引物中筛选出多态性丰富的１８
个引物（表２），对１４份材料４２０个样品进行ＰＣＲ扩增。２５μＬＰＣＲ反应体系：模板ＤＮＡ０．５ｎｇ／μＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ
（含 Ｍｇ２＋）２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．５Ｕ，ｄＮＴＰｓ０．６ｍｍｏｌ／Ｌ，引物０．９μｍｏｌ／Ｌ。ＰＣＲ扩增：扩增程序
为９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５０℃复性４５ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，循环３５次；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。
用１．５％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，电极缓冲液为１×ＴＡＥ，电泳时间４０ｍｉｎ，用ＤＬ２０００作对照。电泳结束
后观察照相。ＩＳＳＲ引物、ｄＮＴＰｓ及ＴａｑＤＮＡ聚合酶均购自上海生物工程技术服务有限公司。
１．２．３ ＳＳＲ扩增和检测 根据Ｂｅｒｎａｄｅｔｔｅ等［１７］的报道，从８９对紫花苜蓿和截形苜蓿ＳＳＲ引物中筛选多态性
丰富、重复性好的１８对引物进行扁蓿豆ＰＣＲ扩增（表２）。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ：模板ＤＮＡ３μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ
（含 Ｍｇ２＋）５．５μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶（由北京天根生物公司合成）０．５μＬ，ｄＮＴＰ０．７５μＬ，引物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
０．７５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１４．５μＬ。ＰＣＲ反应程序为：９５℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性２５ｓ，５５～６６℃（根据不同引物而定）
退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，最后４℃保存。取扩增产物，经６％变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳检测（恒功率８０Ｗ，３０ｍｉｎ）后，进行银染、固定、染色和显影。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
１．３ 数据分析
以清晰可辨的扩增条带在相对迁移位置的有无记数，有扩增带时，赋值为“１”，无扩增带时赋值为“０”，生成分
子数据矩阵。利用Ｐｏｐｇｅｎ３．２统计ＳＳＲ数据和ＩＳＳＲ数据的遗传相似系数（ＧＳ），Ｓｈａｎｎｏｎ指数、Ｎｅｉ’ｓ指数，利
用ＮＴＳＹＳｐｃ２．１软件［１８］采用ＵＰＧＭＡ（ＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄＰａｉｒＧｒｏｕｐＭｅｔｈｏｄｗｉｔｈＡｒｉｔｈｍｅｔｉｃｍｅａｎ）法进行聚类分
析，绘制亲缘关系树状聚类图，用 Ｍａｎｔｅｌ检验进行相关性检测。
８０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
表２ 犐犛犛犚和犛犛犚的引物序列
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲狆狉犻犿犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犐犛犛犚犪狀犱犛犛犚
ＩＳＳＲ引物
ＩＳＳＲｐｒｉｍｅ
序列（５′→３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５′→３′）
ＳＳＲ引物
ＳＳＲｐｒｉｍｅ
序列（５′→３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５′→３′）
ＵＢＣ８５６ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＡ ＭＴＩＣ２３３ ＧＣＧＴＡＡＣＧＴＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡ ＡＡＧＧＡＡＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＴ
ＵＢＣ８１７ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡ ＡＷ５８４５３９ ＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＧ ＧＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ
ＵＢＣ８２５ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴ ＭＴＩＣ３４７ ＴＣＧＧＴＧＴＡＴ ＴＴＣＣＧＴＧＴＴＴＧ ＧＧＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＧ
ＵＢＣ８４８ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＲＧ ＭＴＩＣ２５８ ＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＡＧＡＡＡ ＴＧＡＡＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＡ
ＵＢＣ８５４ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＲＧ ＭＴＩＣ７７ ＧＣＣＧＴＡＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧ ＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＡ
ＵＢＣ８１２ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡ ＭＳＡ１３２９３ ＡＧＡＣＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＣＣＣＡＣＴ ＴＣＣＡＴＣＧＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣ
ＵＢＣ８６２ ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ ＢＩ４ＢＯ３ ＧＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＣ ＣＴＧＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＴＧＣ
ＵＢＣ８３６ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＡ ＭＴＩＣ１８３ ＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＧＴＡ ＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＣＡＣＧ
ＵＢＣ８３４ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＴ ＭＴＩＣ２４９ ＴＡＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣ ＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＴＧＴＡＴ
ＵＢＣ８０９ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧ ＭＴＩＣ２７ ＣＣＣＣＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴ ＣＧＡＴＣＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＴＡ
ＵＢＣ８４７ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＲＣ ＭＴＩＣ２７２ ＴＣＴＴＧＴＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＧＡＡＣ ＴＣＣＴＧＡＧＴＴＧＴＡＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡ
ＵＢＣ８１３ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴ ＭＴＩＣ１８９ ＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＣ ＣＡＡＡＣＣＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＣ
ＵＢＣ８２１ ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＴ ＭＴＩＣ２３７ ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＧ ＣＣＣＡＴＡ ＴＧＣＡＡＣＡＧＡＣＣＴＴＡ
ＵＢＣ８４３ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＲＡ ＭＴＩＣ９３ ＡＣＣＧＴＡＧＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＣＡ ＡＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＧＴ
ＵＢＣ８２３ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣ ＭＡＬ３６９４７１ ＡＡＡＣＣＣＴＴＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡ ＡＴＴＣＡＣＡＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＣ
ＵＢＣ８４５ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＲＧ ＭＴＩＣ４５１ ＧＧＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡ ＡＡＴＴＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＣ
ＵＢＣ８６６ ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣ ＭＴＩＣ４３２ ＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＡＴ ＡＧＧＡＡＧ ＧＣＣＡＴＡ ＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＣＴＴ
ＵＢＣ８２２ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡ ＭＴＩＣ１８８ ＡＡＴＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＣＧＡＧＣＡＣ ＧＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＣＧＡ
２ 结果与分析
２．１ 扩增结果的多态性分析
１８个ＩＳＳＲ引物可扩增出清晰而重复性好的条带，且具多态性，１８对紫花苜蓿和截形苜蓿ＳＳＲ引物可扩增
出清晰谱带，对１４份扁蓿豆材料进行ＰＣＲ扩增。
１４份扁蓿豆的ＩＳＳＲ扩增结果见图１和表３，ＩＳＳＲ扩增出的条带共１４３条，条带的分子量范围为２５０～２０００
ｂｐ，其中多态性条带１２５个，多态性比率平均为８７．０８％，不同引物扩增出的清晰条带数为５～１１，平均为６．９４
条。多态性比率变幅为６６．６７％～１００％，差异较大。
１４份扁蓿豆的ＳＳＲ扩增结果见图１和表３，１８对ＳＳＲ引物共扩增到１３６个条带，ＳＳＲ扩增带的分子量为７０
～３００ｂｐ，其中多态性条带１０９个，多态性比率平均为８０．０９％。不同引物扩增出的清晰条带数为３～１３，平均每
个引物扩增出的片段条带数为６．０６条。不同引物扩增的多态性也存在较大的差异，每个引物扩增的多态性片段
的百分率介于６０．０％～１００％。
Ｓｈａｎｎｏｎ指数和Ｎｅｉ’ｓ指数既可以反映条带的丰富程度，又可以反映均匀程度，而丰富度与均匀度是衡量多
样性的２个重要指标。Ｎｅｉ’ｓ指数估算的１８个ＩＳＳＲ引物和１８对ＳＳＲ引物扩增所得位点的种群内和种群间的
基因多样性，不同位点对遗传多样性的贡献不同，ＳＳＲ的Ｎｅｉ’ｓ指数为０．２８４，平均Ｓｈａｎｎｏｎ指数０．４３８，种群内
基因多样性为０．２８４，遗传分化系数为０．６７４，ＩＳＳＲ的Ｎｅｉ’ｓ指数为０．３５２，平均Ｓｈａｎｎｏｎ指数为０．５２２，种群内
基因多样性为０．３５２，遗传分化系数为１．０００（表３）。
２．２ 遗传相似性分析
ＳＳＲ分析结果表明，利用１８对ＳＳＲ引物产生的１０９条ＤＮＡ片段计算了供试材料间的遗传相似系数（ＧＳ）。
ＳＳＲ标记揭示的材料间ＧＳ值变化范围为０．６６９７～０．８８５３，ＳＳＲ数据结果：遗传相似系数（ＧＳ）最小的是来自内
蒙古呼和浩特市的６号黄花扁蓿豆材料和内蒙古通辽市３号黄花扁蓿豆材料（０．６６９７），遗传距离最远，遗传相
９０１第２１卷第５期 草业学报２０１２年
似程度最低；最大的是来自内蒙古包头市达茂旗的１４号扁蓿豆材料和来自内蒙古赤峰市的１２号扁蓿豆材料
（０．８８５３），遗传距离最近，遗传相似程度最高。
ＩＳＳＲ分析结果表明，利用１８个ＩＳＳＲ引物产生的１２５条 ＤＮＡ片段计算了供试材料间的遗传相似系数
（ＧＳ）。ＩＳＳＲ标记揭示的材料间ＧＳ值变化范围为０．４４７６～０．８１１２，ＩＳＳＲ数据结果：遗传相似系数（ＧＳ）最小的
是来自内蒙古呼和浩特市武川县１３号的扁蓿豆材料与内蒙古锡林郭勒盟锡林浩特市的９号扁蓿豆材料
（０．４４７６），遗传距离最远，遗传相似程度最低；最大的是来自内蒙古包头市达茂旗的１４号扁蓿豆材料与内蒙古
呼和浩特市的６号黄花扁蓿豆材料（０．８１１２）；遗传距离最近，遗传相似程度最高。２种标记所得结果基本相似。
图１ 犝犅犆８５４（犃）及 犕犜犐犆２７２（犅）扩增产物电泳图谱
犉犻犵．１ 犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犝犅犆８５４（犃）犪狀犱犕犜犐犆２７２（犅）
材料编号同表１，Ｍ代表ｍａｒｋｅｒ。Ｎｏｔｅｓｏｆ１－１４ｓａｍｅａｓＴａｂｌｅ１，Ｍｓｔａｎｄｓｍａｒｋｅｒ．
２．３ 聚类分析
２．３．１ ＩＳＳＲ分析 根据以上对遗传相似性的计算结
果，获得供试材料间的遗传距离ＧＤ（ＧＤ＝１－ＧＳ），利
用ＵＰＧＭＡ 法进行聚类分析，结果见图２，阈值在
０．６４６将１４份材料分为４大类。第一大类来自内蒙古
呼和浩特市武川县１３号的扁蓿豆材料；第二大类包括
来自内蒙古赤峰市的１２号扁蓿豆材料及来自内蒙古
通辽市的１１号扁蓿豆材料；第三大类包括来自内蒙古
海拉尔市的２号细叶扁蓿豆材料、内蒙古包头市的４
号黄花扁蓿豆材料、内蒙古呼和浩特市的８号黄花扁
蓿豆材料、内蒙古呼和浩特市的６号黄花扁蓿豆材料、
内蒙古包头市达茂旗的１４号扁蓿豆材料、内蒙古通辽
市３号黄花扁蓿豆材料、内蒙古通辽市５号黄花扁蓿
豆材料、内蒙古呼和浩特市的７号黄花扁蓿豆材料；第
表３ 犐犛犛犚和犛犛犚标记的结果比较
犜犪犫犾犲３ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狌狊犲犳狌犾狀犲狊狊犫犲狋狑犲犲狀
犐犛犛犚犪狀犱犛犛犚犿犪狉犽犲狉狊
项目Ｉｔｅｍｓ ＩＳＳＲ ＳＳＲ
引物数 Ｎｏ．ｏｆｐｒｉｍｅｒｓ １８ １８
总位点数 Ｎｏ．ｏｆｔｏｔａｌｌｏｃｉ １２５ １０９
多态位点比率 Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ（ＰＰＢ）
０．８７１ ０．８０１
Ｎｅｉ基因多样性 Ｎｅｉ’ｓｉｎｄｅｘ ０．３５２ ０．２８４
Ｓｈａｎｎｏｎ指数Ｓｈａｎｎｏｎｉｎｄｅｘ ０．５２２ ０．４３８
种群间基因多样性 Ｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
０．３５２ ０．２８４
种群间遗传分化 Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎ
ｔｉａｔｉｏｎａｍｏｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
１．０００ ０．６７４
四大类包括内蒙古锡林郭勒盟白音锡勒的１号细叶扁蓿豆、内蒙古锡林郭勒盟锡林浩特市的９号扁蓿豆材料、内
蒙古锡林郭勒盟西苏旗的１０号扁蓿豆材料。
２．３．２ ＳＳＲ分析 阈值在０．７将１４份材料分为４大类（图３）。第一大类来自内蒙古锡林郭勒盟白音锡勒的１
号细叶扁蓿豆；第二大类包括来自内蒙古海拉尔市的２号细叶扁蓿豆材料、内蒙古呼和浩特市的６号黄花扁蓿豆
材料、内蒙古呼和浩特市的８号黄花扁蓿豆材料、内蒙古通辽市５号黄花扁蓿豆材料、通辽市的１１号扁蓿豆材
料、内蒙古通辽市７号黄花扁蓿豆材料、内蒙古呼和浩特市武川县１３号扁蓿豆材料、内蒙古锡林郭勒盟锡林浩特
市的９号扁蓿豆材料、内蒙古赤峰市的１２号扁蓿豆材料、内蒙古包头市达茂旗的１４号扁蓿豆材料、内蒙古锡林
郭勒盟西苏旗的１０号扁蓿豆材料；第三大类是来自内蒙古通辽市的３号黄花扁蓿豆；第四大类是来自内蒙古包
头市土右旗的黄花扁蓿豆。
０１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
图２ １４份扁蓿豆材料的犐犛犛犚聚类图
犉犻犵．２ 犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳１４犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪犵犲狉犿狆犾犪狊犿犫狔犐犛犛犚
图３ １４份扁蓿豆材料的犛犛犚聚类图
犉犻犵．３ 犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳１４犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪犵犲狉犿狆犾犪狊犿犫狔犛犛犚
２．４ ２种标记的 Ｍａｎｔｅｌ检验
通过 Ｍａｎｔａｌ测验进行表型性状欧式遗传距离矩阵、ＳＳＲ和ＩＳＳＲ标记的遗传距离矩阵之间的相关性分析
（图４）。结果表明，二者距离矩阵之间存在显著相关，相关系数狉＝０．０１９６，狋＝０．１２１２证明重要的表型性状能够
较准确的反映出亲缘相近的材料的遗传变异。
１１１第２１卷第５期 草业学报２０１２年
图４ 扁蓿豆材料犐犛犛犚分析和犛犛犚分析的关系
犉犻犵．４ 犜犺犲犱犪狋犪狉犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀犐犛犛犚犪狀犱犛犛犚狅犳犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪
３ 讨论与结果
分子标记的应用性评价是开展遗传多样性分析的基础工作之一［１９］。由于所用标记技术和材料的不同，得出
的结论不尽一致。扁蓿豆因其优异的特性具有很大的利用潜力。本研究对收集到的不同生态型的扁蓿豆资源进
行了ＳＳＲ和ＩＳＳＲ遗传多样性的分析，２种标记均表现出较高的多态性，表明２种标记在扁蓿豆植物种间分析是
有效的。基于ＳＳＲ和ＩＳＳＲ标记的遗传相似性系数及ＵＰＧＭＡ聚类显示分析的综合结果来看，黄花扁蓿豆种质
资源遗传基础较广，主要集中在同一个大的类群中，具有一定的同源性，亲缘关系较近；ＩＳＳＲ标记具有比ＳＳＲ标
记更高的ＰＰＢ值，说明前者比后者具有更高的标记效率和有更多的多态性位点，说明ＳＳＲ标记在亲缘物种间具
有高度多态性，适于亲缘关系较近种群的分析［２０］。因此认为ＩＳＳＲ标记在１４份扁蓿豆材料间的扩增位点多态性
主要由类群间的差异引起，ＳＳＲ标记可高效的检测扁蓿豆种质资源中具有较近亲缘关系的种群的遗传多样
性［２１］。２种标记的结果相对一致，Ｍｅｎｔａｌ测验二者距离矩阵相关系数为狉＝０．０１９６，狋＝０．１２１２。ＳＳＲ标记和
ＩＳＳＲ标记的综合聚类分析表明，２种标记可以针对不同的类群和不同育种目标对野生扁蓿豆资源进行有目的的
改良和利用，从而扩大扁蓿豆遗传基础，为扁蓿豆育种积累材料。本研究方法也可为今后扁蓿豆种质资源的创新
利用和遗传多样性研究提供更为合理准确的参考。
扁蓿豆分布环境的多样性，导致扁蓿豆不同居群之间以及同一居群不同个体之间形态性状变异的多样性。
扁蓿豆为苜蓿属中的一个野生种，是改良和育成新品种的巨大基因库，利用分子标记开展多基因聚合育种是未来
育种的前途所在，借助截形苜蓿等模式牧草的分子标记研究成果，有助于尽快获得豆科牧草的大量标记和高密度
图谱。
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１９．
犜犺犲犵犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳狋犺狉犲犲犲犮狅犾狅犵犻犮犪犾犕犲犱犻犮犪犵狅狉狌狋犺犲狀犻犮犪犵犲狉犿狆犾犪狊犿狊狉犲狏犲犪犾犲犱犫狔犐犛犛犚犪狀犱犛犛犚
ＬＩＨｏｎｇｙａｎ１，ＬＩＺｈｉｙｏｎｇ１，ＳＨＩＷｅｎｇｕｉ１，ＣＡＩＬｉｙａｎ１，ＺＨＡＮＧＪｉｎｇｐｉｎｇ２
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｃｏｌｏｇｙＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＧｒａｓｓｌａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００１０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＴｒａｆｆｉｃＣｏｌｅｇｅｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓｂａｓｅｄｏｎｇｅｒｍｐｌａｓｍｃｏｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉ
ｔｙｏｆ１４ｗｉｌｄ犕犲犱犻犮犪犵狅狉狌狋犺犲狀犻犮犪ｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｗｉｔｈ１８ｐａｉｒｓｏｆＳＳＲａｎｄ１８ＩＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ．ＳＳＲ
ｐｒｉｍｅｒｓａｍｐｌｉｆｉｅｄ１０９ｃｌｅａｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ，ａｎｄｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｒａｔｅｗａｓ８０．０９％ｗｉｔｈａｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆ
ｆｉｃｉｅｎｔｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍ０．６６９ｔｏ０．８８５．ＩＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓａｍｐｌｉｆｉｅｄ１２５ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓａｎｄｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｒａ
ｔｉｏｗａｓ８７．０８％ ｗｉｔｈａｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍ０．４４８ｔｏ０．８１１．ＵＰＧＭＡ（ＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄＰａｉｒＧｒｏｕｐ
ＭｅｔｈｏｄｗｉｔｈＡｒｉｔｈｍｅｔｉｃｍｅａｎ）ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｔｗｏｍａｒｋｅｒｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐａｒｔｏｆｔｈｅ犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪
ｍａｔｅｒｉａｌｇｒｏｕｐｅｄｉｎｔｏｏｎｅｇｒｏｕｐ．Ｍａｎｔｅｌｔｅｓｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆｔｗｏｍａｒｋｅｒｓｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（狉＝０．０１９６，狋＝０．１２１２）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｙｅｌｏｗ犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｌｅｖｅｌｓ，ｔｈｏｓｅ
ｏｆ犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪ｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｈｉｇｈｅｓｔｉｎ犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪ｖａｒ．狅犫犾狅狀犵犻犳狅犾犻犪．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狉狌狋犺犲狀犻犮犪；ＩＳＳＲ；ＳＳＲ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
３１１第２１卷第５期 草业学报２０１２年