全 文 ：书发生马铃薯立枯病土壤中立枯丝核菌的
荧光定量犘犆犚快速检测
李瑞琴１，２，刘星１，３，４，邱慧珍１，３，４，张文明１，３，４，张春红１，３，４，
王蒂３，４，５，张俊莲３，４，５，沈其荣６
（１．甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，甘肃 兰州７３００７０；３．甘肃省
干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；４．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；
５．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０；６．南京农业大学资源与环境学院，江苏 南京２１００９５）
摘要：连作马铃薯根际土壤中立枯丝核菌的大量累积可能是导致马铃薯连作障碍发生的主要原因之一。为了解根
际土壤中土传病害病原菌的积累与连作障碍之间的关系，进一步寻求缓解和克服马铃薯连作障碍土传病害的有效
途径，本研究建立优化了荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）方法，对引起马铃薯立枯病的病原菌立枯丝核菌进行了快
速监测和绝对定量，对马铃薯连作１～５年根际土壤立枯丝核菌的动态变化趋势进行了检测分析。结果显示，研究
建立优化的荧光定量ＰＣＲ检测方法，可直接应用土壤ＤＮＡ进行病原菌的定量检测，能检测到土壤中浓度为１×
１０２ 个拷贝／ｇ土的马铃薯立枯丝核菌，扩增效率为１．０４，具有检出限低、扩增效率高的特点，实现了不通过病土分
离培养方法，就可掌握病原菌在根际土壤中的累积状况；在马铃薯立枯病发病严重的连作根际土壤中，立枯丝核菌
的累积数量随连作年限的递增呈上升趋势；病原菌的累积随生育进程的推进呈下降趋势；病原菌累积量最大的是
连作５年的播前土壤，每ｇ土壤达３．７５×１０７ 个拷贝数，由此可见，连作导致了土壤微生物种群结构发生改变，土壤
致病真菌数量增加，相应地也增加了马铃薯立枯病的初侵染机率。
关键词：连作马铃薯根际土壤；立枯丝核菌；实时荧光定量ＰＣＲ；动态变化趋势
中图分类号：Ｓ１５４．３８；Ｓ４３５．３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０５０１３６０９
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０５１６
马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）是重要的粮菜兼用型作物，也是优良的饲料作物［１］。甘肃省是中国马铃薯种植
面积最大的地区，但病害的发生制约着本省马铃薯产业的深入发展［２］。特别是近几年，随着加工业的发展和产业
结构调整，马铃薯已成为西部贫困地区稳产、增收的优势农作物，栽培面积不断扩大，导致马铃薯的连作种植越来
越广泛，主产区连作土传病害日趋严重［３５］。马铃薯立枯病（ｐｏｔａｔｏｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）又称黑痣病（ｐｏｔａｔｏｂｌａｃｋｓｃｕｒｆ）、
茎溃疡病、黑色粗皮病，是一种土传病害，在植株的整个生育期均可发生，已经发病的土壤，如果继续连作，就会年
年发病，轻则减产，重则失收，给农民带来重大的经济损失［６］。据报道，２００９年内蒙古乌兰察布市马铃薯种植区，
发病严重地块的马铃薯立枯病发病率高达９０％［７］；甘肃省马铃薯连作现象十分普遍，连作障碍日益凸显，立枯病
等土传病害发病率日趋严重［８］。目前，有关连作障碍与土传病害间关系的研究多集中在大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）、西
瓜（犆犻狋狉狌犾犾狌狊犾犪狀犪狋狌狊）、黄瓜（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）、地黄（犚犲犺犿犪狀狀犻犪）、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）等作物上［９２１］，且
多以枯萎病的镰刀菌为主［２２，２３］。针对马铃薯立枯病的研究大多集中在病害症状识别、防治措施、病原菌融合群
鉴定分类及生物学特性上［３５，２４２８］。马铃薯立枯病病原菌（犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻）积累与连作之间关系的研究尚未
见报道，生产上急需探明连作与主要土传病害之间的关系，特别是立枯丝核菌等土传病害病原菌在土壤中的积累
是否是导致马铃薯连作障碍的主要原因之一，以采取措施减轻连作对产量和品质的影响。
对于由真菌引起的土传植物病害通常是通过田间观察发病植株、平板分离病原菌、免疫学检测和鉴定的传统
１３６－１４４
２０１３年１０月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２２卷 第５期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
收稿日期：２０１３０２１９；改回日期：２０１３０３２７
基金项目：农业部公益性行业（农业）科研专项（２０１１０３００４），甘肃省科技重大专项（１１０２ＮＫＤＭ０２５）和国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＤ０６Ｂ０３）资助。
作者简介：李瑞琴（１９６９），女，甘肃庆阳人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｒｕｉｑｉｎ＿５２４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｈｚｑｉｕ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
方法对病原真菌进行鉴定的，这些方法不仅耗时长，效率和灵敏度较低，而且经验性强。近年来，分子生物学技术
的发展为土壤微生物的准确检测提供了方便，而不再单纯依赖于平板培养等传统技术［２９］。２０世纪９０年代中期
发展起来的实时荧光定量聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术可以对靶标核酸进行定量检测，是一种方便、快速、准确的
非培养的检测方法［３０］。荧光定量ＰＣＲ所使用的荧光化学试剂分为２种：ＴａｑＭａｎ荧光探针和ＳＹＢＲ荧光染料，
Ｆｉｌｉｏｎ等［３１］开发出的实时荧光探针定量ＰＣＲ可同时对土壤中茄镰孢菜豆变种（犉狌狊犪狉犻狌犿狊狅犾犪狀犻ｆ．ｓｐ．狆犺犪狊犲狅犾犻）
和丛枝菌根真菌（犌犾狅犿狌狊犻狀狋狉犪狉犪犱犻犮犲狊）进行定量检测。本研究采用ＳＹＢＲ荧光定量法，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料
是一种ＤＮＡ结合染料，能非特异地掺入到双链ＤＮＡ中去，在游离状态下，它不发出荧光，若一旦结合到双链
ＤＮＡ中后，便可以发出荧光，它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中，且具有通用
性好、成本低等优点。但与荧光探针法相比，需要筛选特异性引物并优化反应条件。Ｌｅｅｓ等［３２］针对马铃薯立枯
丝核菌ＡＧ３融合群的引物筛选及定量ＰＣＲ检测做了研究。但是这一方法是否适用于未做融合群鉴定的马铃
薯黑痣病土壤病原菌的检测，以及对于马铃薯连作根际土壤立枯丝核菌的定量检测是否适用尚未见报道，但是这
一方法是否适合于马铃薯种植土壤中立枯丝核菌的定量研究也尚未见报道，为此我们以马铃薯连作根际土壤为
研究对象，建立优化马铃薯根际土壤立枯丝核菌的实时荧光定量ＰＣＲ检测体系，并对马铃薯连作根际土壤进行
检测和定量，以探明马铃薯根际土壤中立枯丝核菌随生育时期和种植年限的动态变化趋势，为揭示马铃薯连作障
碍的机理，以及根际土壤立枯丝核菌动态变化趋势与马铃薯连作障碍间的关系提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 研究区概况
选择位于甘肃省中部沿黄灌区的白银市景泰条山农场常年种植马铃薯的连作马铃薯田为试验田。供试地点
属温带干旱大陆性气候，年均气温９．１℃，年均降水量１８６ｍｍ，无霜日１４１ｄ，年均日照时数２７１３ｈ，日照百分率
６２％，海拔１２７４ｍ。供试土壤为灰钙土，有机质１０．１ｇ／ｋｇ，全氮０．７１ｇ／ｋｇ，全磷１．３４ｇ／ｋｇ，全钾３５．３１ｇ／ｋｇ，
碱解氮６６ｍｇ／ｋｇ，速效磷１４ｍｇ／ｋｇ，速效钾１９３ｍｇ／ｋｇ，ｐＨ８．０８（水土比５∶１）。当地水源充足，农业灌溉条件
良好。
１．２ 试验设计
在条山农场马铃薯种植区域内选择不同连作年限的相邻地块进行田间试验，以前茬为玉米的轮作地块为对
照（即连作０年，用ＲＰ表示），其余依次为连作１年（ＣＰ１）、２年（ＣＰ２）、３年（ＣＰ３）、４年（ＣＰ４）和５年（ＣＰ５）。所
选地块地势平坦、肥力均匀，具有代表性。每处理３个重复，小区面积９．０ｍ×６．１ｍ，采用宽垄双行覆膜种植，播
种前１ｄ切种薯，用高锰酸钾浸泡消毒，垄宽１．３５ｍ，行距７０ｃｍ，株距１７ｃｍ，种植密度８４０７５株／ｈｍ２。播种和
施肥过程均采用机械化一次进行，而后由人工覆膜。不施用有机肥，化肥用“奔马牌”Ｎ、Ｐ、Ｋ分别为１５１５１５的
复合肥、尿素和硫酸钾，Ｎ∶Ｐ２Ｏ５∶Ｋ２Ｏ＝１．４∶１．０∶２．０，氮肥用量为２１０ｋｇＮ／ｈｍ２。所有化肥均在播种时一
次性基施，田间管理措施同当地大田。４月２５日播种，８月２５日收获。供试品种为当地主栽的加工型马铃薯品
种“大西洋”，由条山农场提供。
１．３ 供试样品
１．３．１ 根际土壤样品 起垄前采集土壤基础土样，用于测定土壤的基本理化性状。分别在块茎膨大期（２０１１年
７月３０日）、收获期（８月２５日）采集试验小区根际土壤样品，每小区５株，重复３次，自土壤中慢慢拔出根系，在
无菌水中浸泡２０ｍｉｎ，洗去粘附在根上的土壤，再用无菌水仔细刷洗根部，将残留的土壤洗下来，无菌水中的部
分为根际土壤［３３］，将土样充分混合后装入无菌的聚乙烯袋中，保存在 －７０℃冰箱中用于土壤总ＤＮＡ的提取。
１．３．２ 标准菌株培养及基因组ＤＮＡ提取 供试标准菌株马铃薯接骨木镰孢菌、茄病镰孢菌由甘肃农业大学李
金花教授提供，晚疫病菌由甘肃省农业科学院植物保护研究所李继平研究员提供，其余菌株由甘肃农业大学陈秀
蓉教授提供。供试菌株在液体完全培养基中２５℃摇培３～５ｄ后，收集菌丝团，用于提取基因组ＤＮＡ，采用植物
真菌ＤＮＡ提取试剂盒提取真菌ＤＮＡ（Ｏｍｅｇａ）［３４］。
１．４ 测定项目与方法
１．４．１ 土壤基本理化性状的测定 土壤ｐＨ、有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷、速效钾等基本理化性状
７３１第２２卷第５期 草业学报２０１３年
采用以下方法测定。土壤ｐＨ采用电位法，有机质采用重铬酸钾法，全氮采用重铬酸钾－硫酸消化法，碱解氮采
用碱解扩散法，全磷采用硫酸－高氯酸消煮法，速效磷采用碳酸氢钠法，速效钾采用醋酸铵－火焰光度计法，全钾
采用氢氧化钠熔融－火焰光度计法［３５］。
１．４．２ 土壤总ＤＮＡ提取和真菌转录间隔区（ＩＴＳ）序列的扩增 采用ＰｏｗｅｒＳｏｉｌＴＭＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（ＭＯＢＩＯ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，美国）提取土壤总ＤＮＡ，用１％ 琼脂糖凝胶电泳后经ＥＢ（溴化乙锭）染色检查提取的ＤＮＡ 质
量。采用ＢＩＯ－ＲＡＤ公司的Ｓ１０００ＴＭＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅ型ＰＣＲ仪，选用可扩增真菌１８ＳｒＲＮＡ部分片段通用引物
ＮＳ１（５′ＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣ３′）和ＧＣＦｕｎｇｉ（５′ＧＣｃｌａｍｐＡＴＴＣＣＣＣＧＴＴＡＣＣＣＧＴＴＧ３′）。
１．４．３ 立枯丝核菌ＰＣＲ引物筛选和特异性验证 依据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的立枯丝核菌及其近缘菌株ｒＤＮＡ的
ＩＴＳ区的序列差异，参照文献，经多重比对试验后筛选的４对立枯丝核菌ＰＣＲ引物（表１），对参试的６个标准病
原菌ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳产物进行ＰＣＲ扩增，观察是否有特异性条带，判断得到的是否是预期长度的ＤＮＡ片
段，进行引物的特异性验证。
表１ 立枯丝核菌常规犘犆犚引物筛选
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犘犆犚狆狉犻犿犲狉狊犲犾犲犮狋犻狅狀狅犳犚．狊狅犾犪狀犻
Ｎｏ． 类别Ｔａｒｇｅｔ 引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′ｔｏ３′）
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
ＤＮＡ片段长度
Ａｍｐｌｉｃｏｎ（ｂｐ）
１ 犚．狊狅犾犪狀犻ＡＧ２１ａｎｄＡＧ８ Ｒｓ２．１／８Ｆ
Ｒｓ２．１／８Ｒ
５′ＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＧ３′
５′ＧＡＧＣＡＧＧＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧ３′
６３ ４４１
２ 犚．狊狅犾犪狀犻ＡＧ１０ Ｒｓ１０Ｆ
Ｒｓ１０Ｒ
５′ＧＴＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＡＡＴＴＴＧ３′
５′ＣＡＡＧＴＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣ３′
６０ ４２３
３ 犚．狊狅犾犪狀犻ＡＧ８ Ｒｓ８Ｆ
Ｒｓ８Ｒ
５′ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＧＡＣ３′
５′ＧＧＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧ３′
５８ ３２７
４ 犚．狊狅犾犪狀犻ＡＧ３ Ｒｓ３Ｆ
Ｒｓ３Ｒ
５′ＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴ３′
５′ＴＡＴＣＡＣＧＣＴＧＡＧＴＧＧＡＡＣＣＡ３′
６０ ５００
１．４．４ 荧光定量ＰＣＲ检测体系的优化 荧光定量ＰＣＲ仪器为ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００实时定量ＰＣＲ仪（美
国应用生物系统公司）。反应体系配制须在超净工作台及冰上且避光。
引物浓度：荧光定量ＰＣＲ预实验得知在反应体系中引物浓度过高会有引物二聚体产生，过低影响扩增效率，
因此，设置引物浓度为０．２，０．３，０．４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），根据溶解曲线和扩增效率确定适宜的引物浓度。
模板浓度：模板浓度过高或过低也会影响溶解曲线的峰值，即扩增效率的大小，因此，设置ＤＮＡ模板浓度范
围为２，３，４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），观察不同浓度的模板ＤＮＡ对扩增效率及荧光吸收强度的影响，确定最合适的
ＤＮＡ模板浓度。
退火温度：退火温度的高低也会影响定量ＰＣＲ反应的特异性和准确性，设置退火温度为５７，５８，６０，６２℃。
反应体系：ＳＹＢＲ＠ＰｒｅｍｉｘＴａｑＭａｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡＢＩ公司）混合液１０μＬ，ＢｏｘⅡ（荧光染料）０．４μＬ，上
下游引物０．２～０．４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＤＮＡ模板２～４μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足２０μＬ。
反应程序：９５℃ 预变性３０ｓ，９５℃变性５ｓ，５７～６０℃退火３４ｓ，４０个循环，９５℃延伸１５ｓ，６０℃６０ｓ，９５℃
１５ｓ，６０℃１５ｓ。在每一循环的退火阶段收集荧光，实时检测反应并且记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔
解曲线。
１．４．５ 重组质粒荧光定量ＰＣＲ标准曲线建立 将立枯丝核菌特异引物扩增后的ＰＣＲ产物纯化后，连接至
ＰＵＣ１８Ｔ载体上，转化至大肠杆菌中，挑取转化后平板上的白色单克隆提取质粒ＤＮＡ，测序确定插入的片段是否
正确。测定质粒ＤＮＡ浓度，绘制标准曲线。
１．４．６ 方法精密度 以稀释样品作为模板进行荧光定量ＰＣＲ反应。以稀释样品作为模板进行荧光定量ＰＣＲ
８３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
反应，重复之间的标准偏差（Ｓ．Ｄ）、变异系数（ＣＶ，％）是否在规定范围内，以验证标准曲线是否具有较好的精确
度和良好的重复性。
１．４．７ 方法有效性检验 根据荧光定量ＰＣＲ标准曲线的相关系数、斜率、ＰＣＲ扩增效率等，验证方法的有效
性。其中标准曲线相关系数犚２＞０．９８；标准曲线斜率介于－３．０～－３．５之间；ＰＣＲ扩增效率（Ｅ）介于０．９～１．２
之间；标准偏差＜０．２。荧光定量ＰＣＲ扩增效率（Ｅ）的计算公式：Ｅ＝１０（－１／斜率）－１［３６］。
１．５ 连作马铃薯根际土壤立枯丝核菌随连作年限和生育进程的动态变化趋势
用优化了的荧光定量ＰＣＲ扩增条件对连作马铃薯根际土壤在不同连作年限、不同生育进程的立枯丝核菌进
行定量检测，分析检测数据，绘制动态变化趋势图。
１．６ 数据分析
数据分析采用Ｅｘｃｅｌ和ＤＰＳ１０．０数据分析软件进行数据统计分析和作图。
２ 结果与分析
２．１ 立枯丝核菌常规ＰＣＲ引物筛选及特异性验证
经多重比对试验后筛选确定立枯丝核菌常规ＰＣＲ特异性引物为表１中的针对犚．狊狅犾犪狀犻ＡＧ３的引物，采用
该引物对，以扩增条件优化试验筛选出的退火温度６０℃，对土壤总ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳产物进行ＰＣＲ扩增后，
得到扩增产物长度为５００ｂｐ的ＤＮＡ片段，扩增产物长度为５００ｂｐ（表２）。用筛选出的引物对供试菌株（表１）的
基因组ＤＮＡ进行常规ＰＣＲ扩增，除马铃薯立枯丝核菌能扩增出约５００ｂｐ大小的特异性条带外，其他供试菌株
均无扩增产物，说明所筛选的引物是马铃薯立枯丝核菌的专用引物。
表２ 供试菌株的常规犘犆犚特异性引物扩增结果
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲狉犲狊狌犾狋狊狅犳狊狆犲犮犻犳犻犮犻狋狔犪狊狊犪狔犫狔犮狅狀狏犲狀狋犻狅狀犪犾犘犆犚
供试菌株Ｔｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓ 寄主 Ｈｏｓｔ 常规ＰＣＲＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＰＣＲ 荧光定量ＰＣＲＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ
马铃薯立枯丝核菌犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻 马铃薯Ｐｏｔａｔｏ ＋ ＋
马铃薯干腐病菌茄病镰孢菌犉狌狊犪狉犻狌犿狊狅犾犪狀犻 马铃薯Ｐｏｔａｔｏ － －
马铃薯干腐病菌接骨木镰孢菌犉狌狊犪狉犻狌犿狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿 马铃薯Ｐｏｔａｔｏ － －
马铃薯晚疫病菌犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犻狀犳犲狊狋犪狀狊 马铃薯Ｐｏｔａｔｏ － －
甜瓜枯萎病菌犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿 甜瓜 Ｍｅｌｏｎ － －
棉花枯萎病菌犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿 棉花Ｃｏｔｔｏｎ － －
注：用“＋”表示可进行荧光定量ＰＣＲ扩增（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）；“－”表示未能进行荧光定量ＰＣＲ扩增（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）。
Ｎｏｔｅ：Ｕｓｉｎｇ“＋”ｓａｉｄｆｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）；“－”ｓａｉｄｆａｉｌｅｄｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ（ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）．
２．２ 荧光定量ＰＣＲ检测体系的优化
图１ 荧光定量犘犆犚不同起始模板犾犵（拷贝数）和犆犜值的标准曲线
犉犻犵．１ 犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚狊狋犪狀犱犪狉犱犮狌狉犲狅犳狋犺犲犚．狊狅犾犪狀犻犻狀狆狌狋
犇犖犃犮狅狆狔狀狌犿犫犲狉狏犲狉狊狌狊狋犺犲犮狅狉狉犲狊狆狅狀犱犻狀犵犆犜狏犪犾狌犲狊
２．２．１ 重组质粒荧光定量ＰＣＲ标准曲线的建立
将立枯丝核菌ＰＣＲ产物纯化、连接并转化至大肠杆
菌中，提取质粒 ＤＮＡ。选择范围在１．０×１０－８～
１．０×１０－３拷贝／ｇ的模板浓度梯度进行反应，确定
阈值和基线，绘制出标准曲线。调整阈值和基线的
配比，确定ＣＴ值（荧光信号到达设定的阈值时所经
历的循环数），经转换得出标准曲线（图１），最终得
出的标准曲线方程为犢＝－３．２３狓＋３２．９８，横坐标
为立枯丝核菌浓度（拷贝数）的ｌｇ值，纵坐标为荧光
定量ＰＣＲ测得的ＣＴ值，即每个反应管内的荧光信
号到达设定的域值时所经历的循环数（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈ
９３１第２２卷第５期 草业学报２０１３年
ｏｌｄ）。通过测得的ＣＴ值代入，计算出待测样品中病原菌的拷贝数。犚２达到０．９９８，可以作为此方法试验的检测
标准曲线。
２．２．２ 引物特异性验证及反应条件优化 实验最终确定的引物浓度为上下游引物各０．４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），
ＤＮＡ模板浓度２μＬ，退火温度为６０℃。筛选的引物为 ＲｓＦ：ＡＡＧＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴ，
ＲｓＲ：ＡＡＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＡＧＴＴ。荧光定量ＰＣＲ扩增结果显示，质粒模板的Ｓ形扩增曲线光滑平
稳，且指数增长期、线性增长期及平台期明显，扩增效率较高（图２右），溶解曲线单峰，没有出现非特异性扩增的
杂峰及引物二聚体的低矮小峰出现（图３右），符合定量检测要求，表明该引物的特异性较强且反应条件得到优化。
２．３ 方法精密度
以稀释样品作为模板进行荧光定量ＰＣＲ反应，重复之间ＣＴ值的标准偏差（Ｓ．Ｄ．）、变异系数（ＣＶ％）均在规
定范围内（表３），说明标准曲线具有较好的精确度和良好的重复性。
图２ 马铃薯立枯丝核菌荧光定量犘犆犚扩增曲线
犉犻犵．２ 犇犲犾狋犪犚狀狏狊犆狔犮犾犲狅犳犚．狊狅犾犪狀犻犪狊狊犪狔犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
左图为非特异性扩增的扩增曲线，曲线不平稳，线性增长期和平台期不明显。右图为特异性扩增的扩增曲线（ＤｅｌｔａＲｎｖｓＣｙｃｌｅ），指数增长期、线
性增长期和平台期明显，扩增曲线光滑平稳。ＴｈｅｌｅｆｔｐｉｃｔｕｒｅｉｓＤｅｌｔａＲｎｖｓＣｙｃｌｅｏｆｔｈｅｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅｃｕｒｖｅｉｓｎｏｔｓｍｏｏｔｈ，ｔｈｅｌｉｎ
ｅａｒｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅａｎｄｐｌａｔｅａｕｐｈａｓｅｉｓｎｏｔｏｂｖｉｏｕｓ．ＴｈｅｒｉｇｈｔｉｓＤｅｌｔａＲｎｖｓＣｙｃｌｅｏｆｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｇｒｏｗｔｈｓｔａｇｅ，ｔｈｅｌｉｎ
ｅａｒｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅａｎｄｐｌａｔｅａｕｐｈａｓｅｉｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙ，ｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｉｓｓｍｏｏｔｈ．
图３ 马铃薯立枯丝核菌荧光定量犘犆犚溶解曲线
犉犻犵．３ 犇犻狊狊狅犮犻犪狋犻狅狀犮狌狉狏犲狅犳犚．狊狅犾犪狀犻犪狊狊犪狔犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
左图为非特异性扩增，溶解曲线有杂峰及引物二聚体的低矮小峰出现。右图为特异性扩增，溶解曲线（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｕｒｖｅ）单峰。Ｔｈｅｌｅｆｔｐｉｃｔｕｒｅ
ｉｓｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｏｎｅ，ｌｏｗｎｏｉｓｅｐｅａｋｓａｎｄｔｗｏｐｅａｋｓｐｒｉｍｅｒｄｉｍｅｒａｐｐｅａｒｓ．Ｔｈｅｒｉｇｈｔｉｓｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｏｎｅ，
ｔｈｅｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｉｓｕｎｉｍｏｄａｌｃｕｒｖｅ．
０４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
２．４ 方法有效性
建立优化的立枯丝核菌荧光定量ＰＣＲ的扩增效
率（Ｅ）为１．０４，在限定的范围内，说明荧光定量ＰＣＲ
方法的扩增效率较高；标准曲线相关系数 犚２ 为
０．９９８，说明标准曲线的相关性很好；曲线斜率为
－３．２３，也在规定的－３．０～－３．５之间；方法ＣＴ值
的标准偏差在０．０３～０．１３之间，小于０．２。从建立优
化的立枯丝核菌荧光定量ＰＣＲ检测方法的相关系数、
斜率、ＰＣＲ扩增效率、标准偏差等综合评价，方法具有
较高的精密度、准确度和重复性。同时表明研究建立
的荧光定量ＰＣＲ检测方法可以作为马铃薯立枯丝核
菌的定量检测方法。
表３ 不同质粒浓度荧光定量犘犆犚检测的精密度
犜犪犫犾犲３ 犘狉犲犮犻狊犻狅狀狅犳狊狋犪狀犱犪狉犱狆犾犪狊犿犻犱狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋
犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
质粒浓度
Ｐｌａｓｍｉｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（拷贝Ｃｏｐｉｅｓ／ｇ）
ＣＴ值
ＣＴｖａｌｕｅ
（平均值 Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）
变异系数
ＣＶ
（％）
１．０×１０－２ ２９．５２±０．０８ ０．５６
１．０×１０－３ ２６．８５±０．０４ ０．２４
１．０×１０－４ ２３．３８±０．１０ ０．５１
１．０×１０－５ １９．８６±０．０３ ０．１２
１．０×１０－６ １６．７６±０．０８ ０．２９
１．０×１０－７ １３．６４±０．１３ ０．４３
２．５ 连作马铃薯根际土壤立枯丝核菌动态变化趋势
图４ 马铃薯连作根际土壤立枯丝核菌随连作年限变化趋势
犉犻犵．４ 犜犺犲犱狔狀犪犿犻犮犮犺犪狀犵犻狀犵狋狉犲狀犱狅犳犚．狊狅犾犪狀犻犫狔
犮狅狀狋犻狀狌狅狌狊犮狉狅狆狆犻狀犵狔犲犪狉狊
荧光定量检测结果显示，马铃薯立枯丝核菌在根
际土壤中的累积量随连作年限的变化趋势为：随连作
年限的递增而呈现上升趋势，变化趋势从大到小依次
为：ＣＰ５＞ＣＰ３＞ＣＰ４＞ＣＰ２＞ＣＰ１＞ＲＰ（图４）。轮作
地土壤中立枯丝核菌的绝对累积量较低，均在１×１０２
个拷贝／ｇ土壤范围内，从连作第１年至第３年，立枯
丝核菌的绝对累积量呈现上升趋势，到第４年的增长
率略有下降，连作第５年增长率又呈现上升趋势。连
作５年与对照相比，立枯丝核菌数量增长了２００多倍，
连作３年的比对照增长了４０多倍。
马铃薯根际土壤立枯丝核菌随生育进程的变化趋
势在各连作年限是一致的，即随生育进程的推进呈下
降趋势，总体趋势是播前最高，在１０４～１０７ 个拷贝／ｇ
土壤范围之间，块茎膨大期为１０４～１０６ 个拷贝／ｇ土壤，到收获期降到最低，也在１０４～１０５ 个拷贝／ｇ土壤之间浮
动。
３ 结论与讨论
实时荧光定量ＰＣＲ最初主要用于医学领域，后来不断被其他领域所应用［３７，３８］。在马铃薯根腐病菌（犎犲犺
狀犻狀狋犺狅狊狆狅狉犻狌犿狊狅犾犪狀犻）［３９］、马铃薯炭疽病菌（犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犮狅犮犮狅犱犲狊）［４０］、马铃薯粉痂病菌（犛狆狅狀犵狅狊狆狅狉犪狊狌犫狋犲狉
狉犪狀犲犪）［４１］和马铃薯皮斑病菌（犘狅犾狔狊犮狔狋犪犾狌犿狆狌狊狋狌犾犪狀狊）［４２］等植物病原菌的定量研究中也得到了应用，实时荧光
定量ＰＣＲ这种快速准确的定量方法，可解决流行学定量研究中用传统方法比较难解决的问题，从而为病害管理
决策提供科学依据［３２］。本研究建立优化的连作马铃薯根际黑痣病病原菌立枯丝核菌检测方法，可以直接应用土
壤ＤＮＡ进行定量检测，避免了普通ＰＣＲ反应后的样本处理以及可能的残留物污染和容易产生交叉污染的缺
陷，建立优化的荧光定量ＰＣＲ检测体系及反应程序与Ｌｅｅｓ等［３２］的检测方法相比，具有扩增效率高、检出限低的
优点，扩增效率为１．０４，可检测到土壤中浓度为１０２ 个拷贝／ｇ的马铃薯立枯丝核菌，实现了不通过常规病土分离
培养方法，仅检测马铃薯根际土壤，就可掌握病原菌在根际土壤中的累积状况，探寻了一种便捷可靠的连作障碍
土传病害检测方法。
近年有关研究指出若土壤中病原菌的丰度高，且与主导性微生物发生密切联系，则抑病土壤就可转变成感病
土壤［４３４５］。Ｉｐｐｏｌｉｔｏ等［４６］对土壤中的烟草疫霉（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狀犻犮狅狋犻犪狀犪犲）进行定量分析时发现，通过检测土壤
菌量阈水平范围，就可以预测病原菌在土壤中的潜在发展趋势。本研究结果表明，连作马铃薯根际土壤立枯丝核
１４１第２２卷第５期 草业学报２０１３年
菌的数量随连作年限的递增呈现上升趋势，与对照轮作根际土壤相比，增长率为几十至几百倍，由此就增加了马
铃薯立枯病的初侵染源，相应地马铃薯立枯病的感病机率也就增大了。此结果与刘宝玉等［３］、谭宗九和郝淑
芝［５］、田晓燕等［７］、孟品品等［８］的研究结论基本一致，即在马铃薯很少轮作或不轮作的土地，马铃薯土传病害病原
菌的存活数量会加大，马铃薯土传病害的发病率会增加，发病程度也会加重。至于马铃薯根际土壤立枯丝核菌的
致病阈值范围，还有待进一步研究。
本研究还发现，在马铃薯立枯病发病较为严重的连作根际土壤中，马铃薯立枯丝核菌随生育进程的推进，数
量不断减少。这主要可能是由于病原菌的生物学特性与土壤、气候等生态环境条件相适应的结果［５］。早春较低
的土壤温度和较高的土壤湿度，有利于丝核菌的侵染，同时土温低、湿度大，种薯幼芽生长慢，在土中埋的时间长，
增加了土壤中病原菌的侵染机会［４，６］。随着季节的变化，气温不断上升，根际土壤中立枯丝核菌的数量也随之降
低。这也与研究区域连作土传病害发生严重的环境气候条件相吻合。综合分析可以认为连作马铃薯根际土壤中
立枯丝核菌的大量积累可能是导致马铃薯连作障碍发生的主要原因之一。至于根际土壤立枯丝核菌的累积量与
马铃薯立枯病发生流行之间的关系，有待下一步深入研究。
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ｒｏｕｎｄｉｎｇｍｙｃｏｒｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉ１ｕｓｉｎｇｒｅａｌｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｒｅｃｔｉｓｏｌａｔｉｏｎｓｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏ
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ｅｎｃｅ，２０１１，３３２：１０９７１１００．
［４６］ ＩｐｐｏｌｉｔｏＡ，ＳｃｈｅｎａＬ，ＮｉｇｒｏＦ，犲狋犪犾．ＰＣＲｂａｓｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ，ｎｉｃｏｔｉａｎａｅｆｒｏｍｒｏｏｔｓａｎｄｓｏｉｌｏｆｃｉｔｒｕｓｐｌａ
ｎｔｓｓｐｐａｎｄＰ［Ｃ］．Ｐｒｏｃｒｒｄｉｎｇ５ｔｈＣｏｎｇｒｅｓｓｏｆｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２０００：１５８１６０．
３４１第２２卷第５期 草业学报２０１３年
犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪犻狀狉犺犻狕狅狊狆犺犲狉犲狊狅犻犾狅犳狆狅狋犪狋狅狌狊犻狀犵狉犲犪犾狋犻犿犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犘犆犚
ＬＩＲｕｉｑｉｎ１，２，ＬＩＵＸｉｎｇ１，３，４，ＱＩＵＨｕｉｚｈｅｎ１，３，４，ＺＨＡＮＧＷｅｎｍｉｎｇ１，３，４，
ＺＨＡＮＧＣｈｕｎｈｏｎｇ１，３，４，ＷＡＮＧＤｉ３，４，５，ＺＨＡＮＧＪｕｎｌｉａｎ３，４，５，ＳＨＥＮＱｉｒｏｎｇ６
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，
Ｃｈｉｎａ；２．ＧａｎｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＱｕａｌｉｔｙＳｔａｎｄａｒｄａｎｄ
ＴｅｓｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｒｉｄｌａｎｄ
ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；４．ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃ＆
ＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；５．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，Ｇａｎｓｕ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；６．ＣｏｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓ
ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｌｅａｄｉｎｇｏｂｓｔａｃｌｅｔｏｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｏｆｐｏｔａｔｏｅｓｉｓ犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻ｉｎｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ．Ａｎ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｐｏｔａｔｏｓｏｉｌｂｏｒｎｅｐａｔｈｏｇｅｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇ
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ＧｒｅｅｎＩＤｙｅ（ＳＧＩ）ｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＲｔＰＣＲ）ｗａｓｏｐｔｉｍｉｓｅｄｔｏ
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ｄｅｔｅｃｔｅｄｔｏａｍｉｎｉｍｕｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆ１×１０２ｃｏｐｉｅｓ／ｇｉｎｐｏｔａｔｏｓｏｉｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ犚．狊狅犾犪狀犻．Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｓｈｉｇｈ（１．０４）ｗｉｔｈａｌｏｗｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔ．Ｔｈｅｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｓｔａｔｕｓｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎｔｈｅ
ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｃａｎｂｅｒｅａｄｉｌｙａｓｓｅｓｓｅｄｗｉｔｈｏｕｔｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｉｎｇ．Ｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｙｅａｒｓｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐｏ
ｔａｔｏｃｒｏｐｐｉｎｇ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆ犚．狊狅犾犪狀犻ｉｎｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｈａｄａｎｕｐｗａｒｄｔｒｅｎｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｙｅａｒｏｆｐｏ
ｔａｔｏ’ｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇ，ｂｙｔｈｅｇｒｏｗｔｈｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉｉｎｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｗｅｒｅ
ｄｏｗｎｗａｒｄｔｒｅｎｄ．Ｔｈｅｌａｒｇｅｓｔａｍｏｕｎｔｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｓａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｉｓｔｈｅｐｒｅｓｅｅｄｉｎｇｐｅｒｉｏｄｏｆｆｉｖｅｙｅａｒｓ，ｔｈａｔｉｓ
３．７５×１０７ｃｏｐｉｅｓ／ｇ．Ｔｈｉｓｓｈｏｗｓｔｈａｔｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｌｅｄｔｏａｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｔｈａｔｉｎ
ｃｒｅａｓｅｄｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｃｈａｎｇｅｏｆｓｏｉｌｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ．Ｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙｏｆ犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻ｉｎｅａｒｌｙ
ｐｏｔａｔｏｂｌｉｇｈｔｉｎｃｒｅａｓｅｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｓｏｉｌｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙｃｒｏｐｐｅｄｐｏｔａｔｏ；犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻；ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ；ｄｙｎａｍｉｃ
ｃｈａｎｇｉｎｇｔｒｅｎｄ
４４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５