全 文 ：书结缕草属植物耐盐性犛犚犃犘分子标记研究
陈宣１，郭海林１，薛丹丹２，郑轶琦２，刘建秀１
（１．江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京２１００１４；２．南京农业大学，江苏 南京２１００９５）
摘要：本研究应用混合集群分析法，通过建立结缕草属植物耐盐性两极端类型材料ＤＮＡ池对４００对ＳＲＡＰ引物组
合进行筛选，得到１１１对多态性引物组合，再以日本结缕草耐盐两极端材料ＤＮＡ对１１１对具有特异带的引物组合
进行进一步筛选，从中获得２２对多态性引物组合，最后用群体各单株对具有耐盐特异带的引物组合进行验证，获
得了７个与结缕草属植物耐盐性紧密相关的ＳＲＡＰ分子标记，依据扩增条带的大小分别命名为：Ｍｅ９Ｅｍ４２６０、Ｍｅ９
Ｅｍ１８７２０、Ｍｅ１３Ｅｍ１８５００、Ｍｅ５Ｅｍ２０１８０、Ｍｅ１４Ｅｍ７２２０、Ｍｅ６Ｅｍ１７６００、Ｍｅ２Ｅｍ１８２６０，以上筛选得到的ＳＲＡＰ分子标记
将为深入开展结缕草属植物分子标记辅助育种及耐盐基因克隆奠定基础。
关键词：结缕草；耐盐性；ＳＲＡＰ分子标记
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３．４；Ｑ９４５．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０２００６６１０
土壤盐碱化是一个世界性的问题，而且有逐年增加的趋势，目前仅有部分盐碱地被利用，还有很大面积亟待
开发，而通过利用耐盐植物改良盐碱地土壤是长期而有效的方法［１］。目前，羊茅属（犉犲狊狋狌犮犪）植物［２］、偃麦草属
（犈犾狔狋狉犻犵犻犪）植物［３］、盐芥（犜犺犲犾犾狌狀犵犻犲犾犾犪）［４］、结缕草属（犣狅狔狊犻犪）植物［５］等针对盐碱胁迫下的抗盐机制都进行了研
究，结缕草属植物由于其叶片厚硬，比较耐磨，具有发达的地下茎和匍匐茎以及非常强的耐盐碱、抗旱［６］等特性和
再生能力，是非常值得重视开发的耐盐植物，通过开发、改良结缕草属植物，挖掘其自身的忍耐力，强化其耐盐性，
从而培育耐盐新品种，并在土壤盐碱化地区推广应用，对促进我国巨大人口压力下的耕地、资源与环境的和谐发
展具有深远的意义。
经研究发现，结缕草属植物种间耐盐性存在差异，结缕草属各品种按耐盐系数值可依次排列为：长花中华结
缕草（犣．狊犻狀犻犮犪ｖａｒ．ｎｉｐｐｏｎｉｃａ）＞细叶结缕草（犣．狋犲狀狌犻犳狅犾犻犪）＞大穗结缕草（犣．犿犪犮狉狅狊狋犪犮犺狔犪）＞沟叶结缕草
（犣．犿犪狋狉犲犾犾犪）＞中华结缕草（犣．狊犻狀犻犮犪）＞日本结缕草（犣．犼犪狆狅狀犻犮犪），种内不同种源之间的耐盐性也存在差异，
而且结缕草抗盐性强弱与叶片长度和质地有关，叶片短质地粗的耐盐性高，而叶片长质地细腻的对盐分很敏感，
并且同种子发芽率负相关；此外还与生存环境有关，生长于降水量低的地区结缕草植株耐盐性比较高［７，８］。在耐
盐机理研究方面，发现结缕草受ＮａＣｌ胁迫时，Ｎａ＋大量积累，Ｋ＋浓度则下降，但是耐盐性强的品种吸收Ｎａ＋少
而吸收Ｋ＋多，由于区域化作用，Ｋ＋主要分布于叶片中，有利于水分向叶子供应，Ｎａ＋于液泡中积累，维持了细胞
质中较低的Ｎａ＋／Ｋ＋ ［９，１０］，从而起到抗盐的作用。观察发现结缕草叶肉组织具有双细胞盐腺，盐离子在体内积
累，细胞内离子分层、通过根皮层排出、木质部薄壁细胞重新吸收、转移至枯萎叶片或通过盐腺排出体外［１１，１２］。
结缕草属植物的耐盐性存在非常丰富的遗传变异，要选择优质耐盐的新品系，其耐盐性鉴定非常重要，而目
前耐盐性鉴定多通过水培法和土培法进行，但是这２种方法非常费时费力，对于大批量材料筛选鉴定比较困难。
因此，应用分子生物技术，寻求一种快速有效的耐盐性分子标记鉴定方法显得非常必要［１３，１４］，Ｈｉｄｅｋｉ和 Ｍａｓｕ
ｍｉ［１５］通过ＰＣＲ技术从耐盐细叶结缕草中成功分离到了ｃＤＮＡ编码的与耐盐性有关的ＢＡＤＨ（ｂｅｔａｉｎｅａｌｄｅｈｙｄｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，甜菜碱醛脱氢酶）基因犣犅犇１，该基因全长１８９２ｂｐ，编码５０７个氨基酸，其中８０％的氨基酸次序
与水稻ＢＡＤＨ相似，因此寻找结缕草属植物中与耐盐基因紧密联系的分子标记是可能的。
目前在禾本科农作物小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）及其他植物中，已经找到与耐盐性相关
的分子标记，翁跃进和陈道明［１６］与单雷等［１７］分别获得了１个与小麦耐盐基因连锁的ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄ
６６－７５
２００９年４月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第２期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
收稿日期：２００８０６０３；改回日期：２００８０６３０
基金项目：江苏省高技术研究项目（ＢＧ２００６３２０）和国家青年科学基金项目（３０８００７５９）资助。
作者简介：陈宣（１９８３），男，海南定安人，硕士研究生。Ｅｍａｉｌ：ｂｅｉｄｏｕｌｉｎｇ１２３＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｔｕｒｆｕｎｉｔ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，随机扩增多态性ＤＮＡ）标记ＯＰＺ０９５９０和ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，微卫星）标记Ｘｇｗｍ
３０４，丁海媛等［１８］通过水稻耐盐突变系的研究，获得与水稻耐盐突变连锁的１ｋｂ的ＲＡＰＤ标记，杨青川和韩建
国［１９］利用改良的ＢＳＡ（ｂｕｌｋｅｄｓｅｇｒｅｇａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ）法和ＲＡＰＤ技术，成功筛选出１个与紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻
狏犪）耐盐基因紧密连锁的ＲＡＰＤ标记，该标记核酸序列与植物干旱、盐诱导半胱氨酸蛋白酶基因ＣｙｓＰｒｌ序列有
９３％的同源性，然而，到目前为止尚未见到与结缕草耐盐性有关的分子标记的研究报道。
相关序列扩增多态性（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｅｒｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）是一种新型的基于ＰＣＲ的标记技
术。该标记技术由Ｌｉ和Ｑｉｏｓ［２０］于２００１年在芸薹属（犅狉犪狊狊犻犮犪）作物中开发出来，通过设计独特的引物，主要对开
放阅读框进行扩增，因不同个体、物种的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有操作简便、
结果稳定、便于克隆测序目标片段、成本低廉等特点，目前已广泛应用于野牛草（犅狌犮犺犾狅犲犱犪犮狋狏犾狅犻犱犲狊）［２１］、棉花
（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿）［２２］、黄瓜（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）［２３］、葫芦（犔犪犵犲狀犪狉犻犪狊犻犮犲狉犪狉犻犪）［２４］等植物的遗传图谱构建、比
较基因组学和遗传多样性分析等方面的研究。在草坪草研究方面，Ｂｕｄａｋ等［２５］应用ＳＲＡＰ技术对几种草坪草进
行了遗传多样性和种间关系的鉴定研究，但是将ＳＲＡＰ标记技术应用于结缕草属植物及其抗逆性的分析研究还
未见报道。因此，本研究通过混合集群分析（ＢＳＡ）法和ＳＲＡＰ标记技术，对影响其耐盐性的基因类型进行分析，
筛选出与结缕草属植物耐盐基因紧密连锁的ＳＲＡＰ分子标记，为结缕草属植物的耐盐性鉴定和分子标记辅助育
种提供指导，以加速耐盐结缕草的育种进程。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
２００７年５月选取３０份不同品系的结缕草属植物材料，参照陈静波等［２６］的方法在４５Ｌ的周转箱中用 Ｈｏａｇ
ｌａｎｄ营养液进行液体培养，正常培养３个月后，进行３．４％的ＮａＣｌ盐浓度处理１个月，为了防止ＮａＣｌ的急性伤
害，每日以０．３％的浓度逐渐增加进行盐胁迫，最后通过目测各材料的黄叶面积占总叶面积的的百分比即为叶片
枯黄率（ｌｅａｖｅｆｉｒｉｎｇ，ＬＦ３４），以此指标为依据，分别选取５份极端敏盐结缕草和７份极端耐盐结缕草为试验材料
（所有材料均取自江苏省中国科学院植物研究所草业研究中心的试验苗圃地）。
表１ 供试的１２份结缕草属材料
犜犪犫犾犲１ 犔犻狊狋犲狉狅犳１２犣狅狔狊犻犪犿犪狋犲狉犻犪犾狊
材料类型
Ｔｙｐｅｏｆｔｏｌｅｒａｎｃｅ
编号
Ｎｏ．
种源
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
采样点
Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎｓｉｔｅ
种名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
叶片枯黄率
ＬＦ３４（％）
敏盐材料
Ｓａｌｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ
１ Ｚ３１３ 江苏省南京市Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪×
沟叶结缕草犣．犿犪狋狉犲犾犾犪
４１．８
２ Ｚ０４９ 安徽省滁州市Ｃｈｕｚｈｏｕ，Ａｎｈｕｉ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 ５０．０
３ Ｚ１３５ 美国引进Ｚｅｎｉｔｈ品种Ａｍｅｒｉｃａ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 ４３．８
４ Ｚ１２９ 山东省青岛市Ｑｉｎｇｄａｏ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 ５１．３
５ Ｚ００８ 浙江杭州水稻所 Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ 中华结缕草犣．狊犻狀犻犮犪 ５１．０
耐盐材料
Ｓａｌｔｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｍａｔｅｒｉａｌ
６ Ｚ１６０ 重庆渝北区Ｙｕｂｅｉ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ 细叶结缕草犣．狋犲狀狌犻犳狅犾犻犪 ６．３
７ Ｚ１２３ 美国引进Ｄｉａｍｍｏｎｄ品种Ａｍｅｒｉｃａ 沟叶结缕草犣．犿犪狋狉犲犾犾犪 ６．５
８ Ｚ０９５ 中国台湾Ｔａｉｗａｎ，Ｃｈｉｎａ 沟叶结缕草犣．犿犪狋狉犲犾犾犪 ２．８
９ Ｚ０７５ 中国台湾Ｔａｉｗａｎ，Ｃｈｉｎａ 沟叶结缕草犣．犿犪狋狉犲犾犾犪 １３．０
１０ Ｚ０７７ 美国引进兰引３号品种Ａｍｅｒｉｃａ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 １８．３
１１ Ｚ１２５ 美国引进Ａｍｅｒｉｃａ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 ２０．５
１２ Ｚ１２８ 美国引进Ｃｒｏｗｎｅ诱变品种Ａｍｅｒｉｃａ 日本结缕草犣．犼犪狆狅狀犻犮犪 １９．８
注：ＬＦ３４指盐浓度为３．４％时的叶片枯黄率；带为犣．犼犪狆狅狀犻犮犪种内建ＤＮＡ池材料。
Ｎｏｔｅ：ＬＦ３４ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｒａｔｅｏｆｓｃｏｒｃｈｉｎｌｅａｖｅｓｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｄｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅａｔ３．４％；犣．犼犪狆狅狀犻犮犪ｗｉｔｈｓｈｏｗｅｄｂｕｉｌｔｉｎＤＮＡｐｏｏｌ
ｍａｔｅｒｉａｌｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｓｐｅｃｉｅｓ．
７６第１８卷第２期 草业学报２００９年
１．２ 试验方法
１．２．１ 基因组总ＤＮＡ的提取检测及ＤＮＡ池的建立 分别选取以上５份极端敏盐材料（Ｎｏ．１～５）和７份极端
耐盐材料（Ｎｏ．６～１２）共１２份结缕草种源，参考郭海林等［２７］的ＳＤＳ提取ＤＮＡ的方法，分别取５ｇ材料的新鲜叶
片提取其基因组总ＤＮＡ。
ＤＮＡ质量和浓度采用０．８％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并以λＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）为标准，将其稀释至５０
ｎｇ／μＬ，置于冰箱－２０℃储存备用。１２份材料各取等量ＤＮＡ样品混合，材料 Ｎｏ．１～５建立敏盐ＤＮＡ池（Ｓ
ｐｏｏｌ），材料Ｎｏ．６～１２建立耐盐ＤＮＡ池（Ｒｐｏｏｌ）。
由于结缕草属植物的种或品种间基因型存在丰富的变异，为了排除其对试验的影响，选择结缕草属中的日本
结缕草这种材料进行种内两极端耐盐性分析，分别选取其中３份极端敏盐材料（Ｎｏ．２～４）和３份极端耐盐材料
（Ｎｏ．１０～１２），各取等量ＤＮＡ样品混合，材料Ｎｏ．２～４建立种内敏盐ＤＮＡ池（Ｓ１ｐｏｏｌ），材料Ｎｏ．１０～１２建立
种内耐盐ＤＮＡ池（Ｒ１ｐｏｏｌ）。
１．２．２ ＳＲＡＰ分析 ＳＲＡＰ引物设计参考Ｌｉ和Ｑｉｏｓ［２０］的方法，合成２０个正向引物和２０个反向引物，如表２所
示（由上海博彩生物科技有限公司合成），共组合成４００对引物（表３）。
（１）应用Ｓｐｏｏｌ和Ｒｐｏｏｌ对４００对引物进行筛选。
ＰＣＲ扩增体系为：总体积１０μＬ，Ｔａｑ酶０．５Ｕ，ＤＮＡ２５ｎｇ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋０．６μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ１．０μＬ，
２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．８μＬ，２ｍｍｏｌ／Ｌ引物１．０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ６μＬ（Ｔａｑ酶、Ｍｇ
２＋、１０×Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、均购自上海
博彩生物科技有限公司）。
ＰＣＲ扩增反应在ＴＣ４１２型扩增仪（ＴＥＣＨＮＥ公司，英国）中进行，扩增程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性
１ｍｉｎ，３７℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１０ｓ，５个循环；９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１０ｓ，３５个循环；循环
结束后７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。
表２ 犛犚犃犘标记的正反向引物序列
犜犪犫犾犲２ 犛犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犛犚犃犘犳狅狉狑犪狉犱（犕犲）犪狀犱狉犲狏犲狉狊犲（犈犿）狆狉犻犿犲狉狊
编号Ｃｏｄｅ 正向引物Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓ 编号Ｃｏｄｅ 反向引物Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓ
Ｍｅ１ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ３′ Ｅｍ１ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ３′
Ｍｅ２ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ３′ Ｅｍ２ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ３′
Ｍｅ３ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ３′ Ｅｍ３ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ３′
Ｍｅ４ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡ３′ Ｅｍ４ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ３′
Ｍｅ５ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ３′ Ｅｍ５ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ３′
Ｍｅ６ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡ３′ Ｅｍ６ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ３′
Ｍｅ７ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＧ３′ Ｅｍ７ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧ３′
Ｍｅ８ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＡ３′ Ｅｍ８ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣ３′
Ｍｅ９ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＣ３′ Ｅｍ９ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＡ３′
Ｍｅ１０ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴ３′ Ｅｍ１０ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴ３′
Ｍｅ１１ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧ３′ Ｅｍ１１ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴ３′
Ｍｅ１２ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＧ３′ Ｅｍ１２ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣ３′
Ｍｅ１３ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＴＧ３′ Ｅｍ１３ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡ３′
Ｍｅ１４ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＴ３′ Ｅｍ１４ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＴＧ３′
Ｍｅ１５ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＣＡ３′ Ｅｍ１５ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＧＣ３′
Ｍｅ１６ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＧＡＣ３′ Ｅｍ１６ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＣＧ３′
Ｍｅ１７ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡ３′ Ｅｍ１７ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＡＧ３′
Ｍｅ１８ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＧＧＴ３′ Ｅｍ１８ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧ３′
Ｍｅ１９ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧ３′ Ｅｍ１９ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＴＣ３′
Ｍｅ２０ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＡＴ３′ Ｅｍ２０ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＧＴ３′
８６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
表３ ２０个正向引物和２０个反向引物组合序列编号表
犜犪犫犾犲３ 犛犲狉犻犪犾狀狌犿犫犲狉狊狅犳犛犚犃犘犳狅狉狑犪狉犱（犕犲）犪狀犱狉犲狏犲狉狊犲（犈犿）狆狉犻犿犲狉狊
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｍｅ１ Ｍｅ２ Ｍｅ３ Ｍｅ４ Ｍｅ５ Ｍｅ６ Ｍｅ７ Ｍｅ８ Ｍｅ９ Ｍｅ１０ Ｍｅ１１ Ｍｅ１２ Ｍｅ１３ Ｍｅ１４ Ｍｅ１５ Ｍｅ１６ Ｍｅ１７ Ｍｅ１８ Ｍｅ１９ Ｍｅ２０
Ｅｍ１ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０
Ｅｍ２ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６ ２７ ２８ ２９ ３０ ３１ ３２ ３３ ３４ ３５ ３６ ３７ ３８ ３９ ４０
Ｅｍ３ ４１ ４２ ４３ ４４ ４５ ４６ ４７ ４８ ４９ ５０ ５１ ５２ ５３ ５４ ５５ ５６ ５７ ５８ ５９ ６０
Ｅｍ４ ６１ ６２ ６３ ６４ ６５ ６６ ６７ ６８ ６９ ７０ ７１ ７２ ７３ ７４ ７５ ７６ ７７ ７８ ７９ ８０
Ｅｍ５ ８１ ８２ ８３ ８４ ８５ ８６ ８７ ８８ ８９ ９０ ９１ ９２ ９３ ９４ ９５ ９６ ９７ ９８ ９９ １００
Ｅｍ６ １０１ １０２ １０３ １０４ １０５ １０６ １０７ １０８ １０９ １１０ １１１ １１２ １１３ １１４ １１５ １１６ １１７ １１８ １１９ １２０
Ｅｍ７ １２１ １２２ １２３ １２４ １２５ １２６ １２７ １２８ １２９ １３０ １３１ １３２ １３３ １３４ １３５ １３６ １３７ １３８ １３９ １４０
Ｅｍ８ １４１ １４２ １４３ １４４ １４５ １４６ １４７ １４８ １４９ １５０ １５１ １５２ １５３ １５４ １５５ １５６ １５７ １５８ １５９ １６０
Ｅｍ９ １６１ １６２ １６３ １６４ １６５ １６６ １６７ １６８ １６９ １７０ １７１ １７２ １７３ １７４ １７５ １７６ １７７ １７８ １７９ １８０
Ｅｍ１０１８１ １８２ １８３ １８４ １８５ １８６ １８７ １８８ １８９ １９０ １９１ １９２ １９３ １９４ １９５ １９６ １９７ １９８ １９９ ２００
Ｅｍ１１２０１ ２０２ ２０３ ２０４ ２０５ ２０６ ２０７ ２０８ ２０９ ２１０ ２１１ ２１２ ２１３ ２１４ ２１５ ２１６ ２１７ ２１８ ２１９ ２２０
Ｅｍ１２２２１ ２２２ ２２３ ２２４ ２２５ ２２６ ２２７ ２２８ ２２９ ２３０ ２３１ ２３２ ２３３ ２３４ ２３５ ２３６ ２３７ ２３８ ２３９ ２４０
Ｅｍ１３２４１ ２４２ ２４３ ２４４ ２４５ ２４６ ２４７ ２４８ ２４９ ２５０ ２５１ ２５２ ２５３ ２５４ ２５５ ２５６ ２５７ ２５８ ２５９ ２６０
Ｅｍ１４２６１ ２６２ ２６３ ２６４ ２６５ ２６６ ２６７ ２６８ ２６９ ２７０ ２７１ ２７２ ２７３ ２７４ ２７５ ２７６ ２７７ ２７８ ２７９ ２８０
Ｅｍ１５２８１ ２８２ ２８３ ２８４ ２８５ ２８６ ２８７ ２８８ ２８９ ２９０ ２９１ ２９２ ２９３ ２９４ ２９５ ２９６ ２９７ ２９８ ２９９ ３００
Ｅｍ１６３０１ ３０２ ３０３ ３０４ ３０５ ３０６ ３０７ ３０８ ３０９ ３１０ ３１１ ３１２ ３１３ ３１４ ３１５ ３１６ ３１７ ３１８ ３１９ ３２０
Ｅｍ１７３２１ ３２２ ３２３ ３２４ ３２５ ３２６ ３２７ ３２８ ３２９ ３３０ ３３１ ３３２ ３３３ ３３４ ３３５ ３３６ ３３７ ３３８ ３３９ ３４０
Ｅｍ１８３４１ ３４２ ３４３ ３４４ ３４５ ３４６ ３４７ ３４８ ３４９ ３５０ ３５１ ３５２ ３５３ ３５４ ３５５ ３５６ ３５７ ３５８ ３５９ ３６０
Ｅｍ１９３６１ ３６２ ３６３ ３６４ ３６５ ３６６ ３６７ ３６８ ３６９ ３７０ ３７１ ３７２ ３７３ ３７４ ３７５ ３７６ ３７７ ３７８ ３７９ ３８０
Ｅｍ２０３８１ ３８２ ３８３ ３８４ ３８５ ３８６ ３８７ ３８８ ３８９ ３９０ ３９１ ３９２ ３９３ ３９４ ３９５ ３９６ ３９７ ３９８ ３９９ ４００
扩增产物的检测：ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应结束后，在扩增产物中加入２μＬ６×Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ混匀，用１０％的聚
丙烯酰胺凝胶，１×ＴＢＥ电极缓冲液，２５０Ｖ电压进行电泳分析约２．０ｈ（ＤＹＹ８Ｂ型电泳仪，ＪＹＳＣＺ６型电泳槽，
北京六一）。然后银染：３６０ｍＬ水＋４０ｍＬ乙醇＋２ｍＬ冰乙酸的固定液固定１２ｍｉｎ，４００ｍＬ水＋０．８ｇＡｇＮＯ３
溶液染色，在摇床上放置１２ｍｉｎ；用蒸馏水冲洗１～２次，加入４００ｍＬ水与１０％硫代硫酸钠８０μＬ，稍加晃动约
３０ｓ，最后置于４ｍＬ甲醛＋６ｇＮａＯＨ＋４００ｍＬ水的染色液中，在摇床上放置约２０～３０ｍｉｎ至带清楚为止，最
后进行拍照记录，分析结果。应用Ｓｐｏｏｌ和Ｒｐｏｏｌ对４００对引物进行筛选，每对引物重复扩增２次。
（２）应用Ｓ１ｐｏｏｌ和Ｒ１ｐｏｏｌ对（１）中筛选出的引物进一步筛选。
依照以上的操作方法，以日本结缕草种内耐盐两极端材料的ＤＮＡ对（１）中筛选的具有特异带的引物进行进
一步筛选，每对引物重复扩增２次。
（３）应用建池群体各单株ＤＮＡ的ＳＲＡＰ分析验证。
通过建池的各单株ＤＮＡ，即５份极端敏盐材料（Ｎｏ．１～５）和７份极端耐盐材料（Ｎｏ．６～１２），分别对以上经
过筛选获得的具有耐盐特异带的引物进行验证，以获得与结缕草属植物耐盐性紧密相关的ＳＲＡＰ分子遗传标
记，每对引物重复验证２次。
２ 结果与分析
２．１ 基因组总ＤＮＡ质量的检测
基因组总ＤＮＡ电泳检测结果如图１所示（λＤＮＡ为５０ｎｇ／μＬ），基因组总ＤＮＡ条带明亮，谱带整齐，无其他
杂带，说明提取的ＤＮＡ量较多，ＤＮＡ完整无降解。然后加适量ＴＥ，将其稀释至５０ｎｇ／μＬ，再次检测结果如图２
所示（λＤＮＡ为５０ｎｇ／μＬ），１２份材料的基因组总ＤＮＡ谱带整齐均一，亮度一致，符合试验要求，最后置于冰箱
－２０℃储存备用。
９６第１８卷第２期 草业学报２００９年
２．２ ＳＲＡＰ标记分析
２．２．１ 应用Ｓｐｏｏｌ和Ｒｐｏｏｌ的ＤＮＡ对４００对引物进行筛选 以Ｓｐｏｏｌ、Ｒｐｏｏｌ两个基因池ＤＮＡ为模板，对
４００对引物进行ＰＣＲ扩增，结果显示（图３），有３６８对引物都扩增出清晰的条带，占引物组合的９２％，扩增产物大
小为１００～８００ｂｐ不等，另外的３２对引物未扩增出任何产物。通过分析耐盐多态性的引物，３６８对引物中总共有
１１１对表现出耐盐池Ｒｐｏｏｌ具有特异带，而敏盐池Ｓｐｏｏｌ无该特异带，而且带型清晰稳定，重复性比较好，说明
这１１１对引物中可能存在与结缕草属植物耐盐基因相关的遗传标记。
图１ 基因组总犇犖犃质量的检测
犉犻犵．１ 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃
图２ 稀释后基因组总犇犖犃质量的检测
犉犻犵．２ 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犱犻犾狌狋犻狅狀狅犳狋犺犲犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃
图３ ３６１～３８４号１８个引物组合在耐盐两极端材料犇犖犃间的多态性
犉犻犵．３ 犘狅犾狔犿狅狉狆犺犻犮犫犪狀犱狊狅犳狋犺犲狆狉犻犿犲狉狊犖狅．３６１－３８４犫犲狋狑犲犲狀犛狆狅狅犾犪狀犱犚狆狅狅犾
奇数为ＳｐｏｏｌＤＮＡ池ＴｈｅｏｄｄｎｕｍｂｅｒｓｗｅｒｅＳｐｏｏｌ，偶数为ＲｐｏｏｌＤＮＡ池ＴｈｅｅｖｅｎｎｕｍｂｅｒｓｗｅｒｅＲｐｏｏｌ，Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ
０７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
２．２．２ 进一步对以上筛选出的引物进行种内筛选 为了排除结缕草种或品种间基因型本身差异对试验研究的
影响，应用Ｓ１ｐｏｏｌ和Ｒ１ｐｏｏｌ的ＤＮＡ对以上（１）中筛选出的具有特异带引物再次进行ＢＳＡ－ＳＲＡＰ标记分析，
电泳结果显示（图４），在以上筛选获得的１１１对引物中，共有２２对引物扩增出与耐盐性相关的特异带，即Ｒｐｏｏｌ
具有特异带而Ｒｐｏｏｌ无该特异带，其多态性引物占１９．８２％。由此可见，结缕草属植物种或品种间具有非常大的
基因型差异，该结果排除了种或品种间基因型差异导致出现特异条带的影响，从而提高了标记筛选效率和获得目
的条带的准确性，可进一步分析获得与耐盐性紧密相关的特异带。
２．２．３ 两极端耐盐性群体各单株的ＳＲＡＰ验证分析 通过建池群体的各单株ＤＮＡ，即５份极端敏盐材料（Ｎｏ．
１～５）和７份极端耐盐材料（Ｎｏ．６～１２），以极端耐盐材料都具有同一特异带而极端敏盐材料都没有该特异带为
依据，分别对以上（２）中的获得的２２对引物进行ＳＲＡＰ标记分析。
结果显示，仅有７对引物最终符合筛选要求（图５～７），即在材料Ｎｏ．６～１２中具有该特异带而材料，Ｎｏ．１～
５则无该特异带，这７对引物分别是 Ｍｅ９Ｅｍ４、Ｍｅ９Ｅｍ１８、Ｍｅ１３Ｅｍ１８、Ｍｅ５Ｅｍ２０、Ｍｅ１４Ｅｍ７、Ｍｅ６Ｅｍ１７、
Ｍｅ２Ｅｍ１８，共扩增出３７个位点，平均每个引物扩增５．４个位点，其中共有１０个耐盐多态性位点，占总扩增位点
的２９．７％（表４），每一对引物都符合筛选要求，证明了这７对引物扩增位点是与结缕草属植物耐盐基因紧密相关
的ＳＲＡＰ分子遗传标记，依据扩增条带的大小分别命名为：Ｍｅ９Ｅｍ４２６０、Ｍｅ９Ｅｍ１８７２０、Ｍｅ１３Ｅｍ１８５００、Ｍｅ５
Ｅｍ２０１８０、Ｍｅ１４Ｅｍ７２２０、Ｍｅ６Ｅｍ１７６００、Ｍｅ２Ｅｍ１８２６０。
３ 讨论
植物的耐盐性是一个极其复杂的性状，既受到环境的影响，又受植物发育时间和空间的限制，研究发现许多
植物体存在抗盐主效基因，因此通过寻找与耐盐主效基因紧密联系的分子标记，对于改善植物的抗盐性是可行且
十分必要的。
目前，常用的分子标记有ＲＡＰＤ，ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，扩增片段长度多态性），
ＳＳＲ，ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）等，这些分子标记已经在许多植物体抗盐基因研究中得到了成功应用，
图４ １１个引物在种内耐盐两极端材料间的犇犖犃多态性
犉犻犵．４ 犜犺犲狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻犮犫犪狀犱狊狅犳狋犺犲狆狉犻犿犲狉狊犫犲狋狑犲犲狀犛狆狅狅犾犪狀犱犚狆狅狅犾
奇数为Ｓ１ｐｏｏｌ的扩增结果 ＴｈｅｏｄｄｎｕｍｂｅｒｓｗｅｒｅＳ１ｐｏｏｌ，偶数为Ｒ１ｐｏｏｌ的扩增结果 ＴｈｅｅｖｅｎｎｕｍｂｅｒｓｗｅｒｅＲ１ｐｏｏｌ，Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ，引物对
Ｐｒｉｍｅｒｓ：Ｍｅ８Ｅｍ１４、Ｍｅ１２Ｅｍ１４、Ｍｅ１８Ｅｍ１４、Ｍｅ２０Ｅｍ１４、Ｍｅ５Ｅｍ１５、Ｍｅ９Ｅｍ１５、Ｍｅ１２Ｅｍ１５、Ｍｅ２０Ｅｍ１５、Ｍｅ３Ｅｍ１６、Ｍｅ６Ｅｍ１６、Ｍｅ９Ｅｍ１６
１７第１８卷第２期 草业学报２００９年
图５ １～１２，１３～２４分别为材料犖狅．１～１２各单株犇犖犃对引物 犕犲９犈犿４，犕犲９犈犿１８的扩增结果
犉犻犵．５ 犖狅．１－１２，１３－２４犻狀犱犻犮犪狋犲犱狋犺犲犪犿狆犾犻犳狔犻狀犵狉犲狊狌犾狋狊狅犳狆狉犻犿犲狉狊犕犲９犈犿４，犕犲９犈犿１８狌狊犻狀犵狋犺犲犿犪狋犲狉犻犪犾狊犖狅．１－１２
箭头所指为扩增特异条带。下同 Ｔｈｅａｒｒｏｗｈｅａｄｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
图６ １～１２，１３～２４分别为材料犖狅．１～１２各单株犇犖犃对引物 犕犲１３犈犿１８，犕犲５犈犿２０的扩增结果
犉犻犵．６ 犖狅．１－１２，１３－２４犻狀犱犻犮犪狋犲犱狋犺犲犪犿狆犾犻犳狔犻狀犵狉犲狊狌犾狋狊狅犳狆狉犻犿犲狉狊犕犲１３犈犿１８，犕犲５犈犿２０狌狊犻狀犵狋犺犲犿犪狋犲狉犻犪犾狊犖狅．１－１２
然而，ＲＡＰＤ稳定性较差，ＳＳＲ引物的开发成本很高，ＡＦＬＰ技术虽然多态性高，但假阳性高且操作复杂，也使其
应用受到限制。而ＳＲＡＰ分子标记技术是新发展的技术方法，其引物设计简单，具有通用性，通过正向引物和反
向引物的自由组合，可以在较少的引物基数中进行多种组合，提高了引物的使用率，大大降低成本，而且较长的引
物序列（１７～１８ｂｐ）和较高的退火温度保证了扩增结果的稳定性，扩增过程中采用复性变温扩增法，较低的退火
温度（３５℃）有利于引物与ＤＮＡ靶位点结合，随后的循环中退火温度升到５０℃，保证前５个循环的扩增产物在余
下的循环中进行指数扩增，提高扩增条带的重复性，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，提高了检测效率。与使
用频率较高的ＡＦＬＰ标记和ＲＡＰＤ标记相比，ＳＲＡＰ标记不仅具有ＲＡＰＤ简单快捷之优点，同时还具有ＡＦＬＰ
的稳定性和多态性，是简单又经济、有效又可靠的分子标记系统。
２７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
图７ １～１２，１３～２４，２５～３６分别为材料犖狅．１～１２各单株犇犖犃对引物 犕犲１４犈犿７，犕犲６犈犿１７，犕犲２犈犿１８的扩增结果
犉犻犵．７ 犖狅．１－１２，１３－２４，２５－３６犻狀犱犻犮犪狋犲犱狋犺犲犪犿狆犾犻犳狔犻狀犵狉犲狊狌犾狋狊狅犳狆狉犻犿犲狉狊犕犲１４犈犿７，
犕犲６犈犿１７犪狀犱犕犲２犈犿１８狌狊犻狀犵狋犺犲犿犪狋犲狉犻犪犾狊犖狅．１－１２
表４ 耐盐多态性引物及其扩增带数
犜犪犫犾犲４ 犘狅犾狔犿狅狉狆犺犻犮狆狉犻犿犲狉狊狅犳狊犪犾狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲犪狀犱狋犺犲犻狉犪犿狆犾犻犮犪狋犻狅狀犫犪狀犱狊
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅｓ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
扩增总带数
Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｂａｎｄｓ
耐盐性多态性带数
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓｏｆｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ
Ｍｅ９Ｅｍ４ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＣ３′
５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ３′
７ ２
Ｍｅ９Ｅｍ１８ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＣ３′
５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧ３′
３ １
Ｍｅ１３Ｅｍ１８ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＴＧ３′
５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧ３′
５ １
Ｍｅ５Ｅｍ２０ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ３′
５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＧＴ３′
６ ２
Ｍｅ１４Ｅｍ７ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＴ３′
５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧ３′
６ ２
Ｍｅ６Ｅｍ１７ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡ３′
５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＡＧ３′
４ １
Ｍｅ２Ｅｍ１８ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ３′
５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧ３′
６ １
合计Ｔｏｔａｌ ３７ １０
据植物抗逆性研究方面的报道，应用ＳＲＡＰ技术已经在小麦抗叶锈病基因、抗白粉病基因等领域得到成功
标记［２８，２９］。为了寻找抗盐基因分子标记，本研究总共筛选了４００对引物，有３６８对引物都扩增出１００～８００ｂｐ不
等的清晰条带，占引物组合的９２％，其中共有１１１对表现出耐盐特异带，而且带型清晰稳定，重复性比较好，可见
ＳＲＡＰ标记技术应用于结缕草属植物研究可以获得非常好的结果。由于不同结缕草属植物的种或品种间基因型
存在一定差异，因此在筛选具有耐盐特异带的引物时还必须考虑这种差异对试验结果的影响，通过日本结缕草种
内耐盐多态性进一步对多态性引物进行筛选，在１１１对引物中总共有２２对表现出种内耐盐特异带，占耐盐多态
性引物组合的２０％，其余８０％是由于种间基因型差异所导致的，也证明了结缕草属植物种间基因变异非常大，因
３７第１８卷第２期 草业学报２００９年
此在进行分子研究时必须考虑其影响，才能最终获得可靠的结果。
本研究首次应用ＳＲＡＰ分子标记技术对结缕草属植物耐盐性进行了遗传标记分析，通过混合集群分析法，
最终筛选获得７个与结缕草属植物耐盐基因紧密相关的ＳＲＡＰ分子标记，这说明了结缕草属植物的耐盐性存在
主效基因，同时耐盐标记的获得，为结缕草属植物的耐盐性鉴定提供一种快速有效的耐盐性鉴定方法，从而促进
结缕草属植物耐盐性分子标记辅助育种的进程，也为结缕草属植物耐盐基因的定位、克隆及其测序分析奠定了良
好的基础。
４ 结论
４．１ 获得结缕草ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增优化体系
ＰＣＲ扩增体系为总体积１０μＬ，Ｔａｑ酶０．５Ｕ，ＤＮＡ２５ｎｇ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋０．６μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ１．０μＬ，２．５
ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．８μＬ，２ｍｍｏｌ／Ｌ引物１．０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ６μＬ。
４．２ 获得７个与结缕草属植物耐盐基因紧密相关的ＳＲＡＰ分子遗传标记，分别为：Ｍｅ９Ｅｍ４２６０、Ｍｅ９Ｅｍ１８７２０、
Ｍｅ１３Ｅｍ１８５００、Ｍｅ５Ｅｍ２０１８０、Ｍｅ１４Ｅｍ７２２０、Ｍｅ６Ｅｍ１７６００和 Ｍｅ２Ｅｍ１８２６０。
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犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犛犚犃犘犿狅犾犲犮狌犾犪狉犿犪狉犽犲狉狊犾犻狀犽犲犱狋狅狊犪犾狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲犻狀犣狅狔狊犻犪犵狉犪狊狊犲狊
ＣＨＥＮＸｕａｎ１，ＧＵＯＨａｉｌｉｎ１，ＸＵＥＤａｎｄａｎ２，ＺＨＥＮＧＹｉｑｉ２，ＬＩＵＪｉａｎｘｉｕ１
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙ，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅａｎｄＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ；
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ｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎ犣狅狔狊犻犪ｇｒａｓｓｅｓｕｓｉｎｇｔｗｏｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｔ，ｅｘｔｒｅｍｅｔｙｐｅｓｏｆＤＮＡｐｏｏｌｓ．Ｆｒｏｍ４００ｐａｉｒｓｏｆＳＲＡＰ
ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，１１１ｗｅｒｅｆｏｕｎｄｗｉｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ．Ｔｈｅｓｅｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｓｃｒｅｅｎｅｄｕｓｉｎｇｔｗｏｅｘｔｒｅｍｅ
ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｔｓａｍｐｌｅｓｏｆ犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪ａｎｄ２２ｐａｉｒｓｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｆｉ
ｎａｌｙ，ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｂａｎｄｓｗｅｒｅｖｅｒｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｔｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓａｎｄ７ＳＲＡＰｍｏ
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ｗｅｒｅｎａｍｅｄ：Ｍｅ９Ｅｍ４２６０，Ｍｅ９Ｅｍ１８７２０，Ｍｅ１３Ｅｍ１８５００，Ｍｅ５Ｅｍ２０１８０，Ｍｅ１４Ｅｍ７２２０，Ｍｅ６Ｅｍ１７５５０，Ｍｅ２
Ｅｍ１８２６０．Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｗｉｌａｃｃｅｌｅｒａｔｅｚｏｙｓｉａｇｒａｓｓｍａｒｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒ
ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｔｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犣狅狔狊犻犪；ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ＳＲＡＰｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓ
５７第１８卷第２期 草业学报２００９年