全 文 :书毛细辛提取物体外抗氧化活性研究
何全磊,苗芳,李春玲
(西北农林科技大学生命学院,陕西 杨凌712100)
摘要:通过毛细辛不同溶剂提取物体外抗氧化活性研究,为进一步开发毛细辛的药用价值提供参考。用50%的乙
醇回流提取毛细辛的粉末,减压浓缩过滤得到乙醇浸膏,加蒸馏水制成悬浮液,依次用等体积的石油醚,乙酸乙酯,
正丁醇萃取,得到石油醚,乙酸乙酯,正丁醇和水提物。以2,6二叔丁基对甲酚(BHT)为对照,分别采用DPPH
法、Fenton法、NBT还原法和Fe2+螯合法测定4种提取物的抗氧化活性。结果表明,毛细辛4种溶剂提取物均有
不同程度的抗氧化活性,且活性与浓度成正相关。毛细辛乙酸乙酯提取物的1,2二苯基2苦苯肼自由基
(DPPH·)的清除活性(IC50值0.376mg/mL),超氧阴离子自由基(O2·)的清除活性(IC50值0.297mg/mL)均最
强。正丁醇提取物的羟基自由基(·OH)清除活性(IC50值0.776mg/mL)为最强,水提物的金属离子螯合活性
(IC50值0.026mg/mL)为最强,远超过对照BHT(0.373mg/mL)。实验表明,毛细辛乙酸乙酯提取物,正丁醇提取
物和水提物均有较强的自由基清除活性,可作为新的自由基清除剂;水提物可以作为新的金属离子螯合剂。
关键词:毛细辛;提取物;抗氧化活性;自由基清除
中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号:10045759(2012)05028506
生物体内的自由基主要包括O2·,·OH,以及H2O2 等[1],它们参与细胞调节和信号转导等活动[2],但也
会破坏体内的大分子如DNA,蛋白质和脂类[3],同时还与衰老,癌症等疾病有关[4],生物体内也有一系列的酶和
小分子防御系统[57],但在病理情况下,自由基的清除无效仍决定细胞尤其是细胞膜的损伤程度[8,9]。抗氧化物质
可以通过一系列途径清除自由基[10],因而显得尤其重要。人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(butylhy
droxyanisd,BHA)、2,6二叔丁基4甲基苯酚(2,6ditertbutyl4methylphenol,BHT)等有一定的副作用,因
此寻找天然抗氧化物质成为研究的热点。
毛细辛(犃狊犪狉狌犿犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿)是马兜铃科(Aristolochiaceae)细辛属(犃狊犪狉狌犿)植物[11],为传统中药,有发表
散寒,镇咳,止痛,祛痰功效,还可以提取芳香油。
以往对于毛细辛的研究主要集中在挥发油部分,据罗文蓉和牛永红[12]报道,毛细辛中挥发油含量仅为
0.5%,且挥发油成分中甲基丁香酚(methyleugenol)、榄香脂素(elemicin)、黄樟醚(safrole)为各种细辛所共有,
其中以榄香脂素为最多。毛细辛挥发油成分的药理作用以镇静、镇痛、解热及局麻作用为主[13],目前为止,未见
关于毛细辛挥发油成分抗氧化功能的报道。对于非挥发油部分的成分及抗氧化能力研究报道也很少。谢百波
等[14]利用溶剂提取、色谱技术等手段从毛细辛全草中提取鉴定了15个化合物,所有化合物均首次从毛细辛中分
离得到,其中几个化合物有很强的抗氧化活性。
通过50%乙醇粗提和不同极性溶剂萃取的方法对毛细辛全草进行提取分离,采用多种抗氧化活性检测方法
综合评价不同溶剂提取物的抗氧化能力,为毛细辛作为天然抗氧化剂的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品的采集与制备 毛细辛全草于2010年6月采自秦岭南坡宁陕县境内的平和梁,自然阴干后粉碎成
细末,装瓶备用。
第21卷 第5期
Vol.21,No.5
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA
285-290
2012年10月
收稿日期:20111031;改回日期:20111221
基金项目:国家自然科学基金项目(30771454,31172365,31170366)资助。
作者简介:何全磊(1985),男,河南固始人,在读硕士。
通讯作者。Email:miaofangmf@163.com
实验的主要提取分离和抗氧化活性测定工作在2011年5-7月间完成,不同浓度提取物的处理均重复3次。
1.1.2 主要试剂 2,6二叔丁基4甲基苯酚(2,6ditertbutyl4methylphenol,BHT)、吩嗪硫酸甲酯
(phenazlnemethosulfate)、邻二氮菲(1,10phenanthrolne)从上海阿拉丁试剂有限公司购买;还原型辅酶I二钠
(NADHINa2)购自北京索莱宝科技有限公司;1,1二苯基2苦苯肼自由基(1,1diphenyl2plcrylhydrazylradi
cal,DPPH·)购自美国Sigma公司;氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazoliumbluechloride,NBT)购于国药集团化学
试剂有限公司;其余试剂均为国产分析纯。
1.2 提取物制备
准确称取毛细辛粉末80g,置于索氏提取器中,以50%的乙醇、料液比为1∶12(g/mL)进行回流提取2h,提
取3次,合并提取液,过滤,减压浓缩得到乙醇浸膏[15]。称量浸膏干重,然后将浸膏转入分液漏斗中,加200mL
蒸馏水制成悬浮液。依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,每级重复3次。最后得到石油醚、乙酸乙
酯、正丁醇和水提取物。
1.3 提取物抗氧化活性的测定
分别将毛细辛4种溶剂提取物(石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提物)溶于体积分数为
50%的乙醇中,配制成质量浓度为0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0mg/mL的溶液(具体浓度根据试验预试调
整),同样也将BHT配制成以上对应浓度梯度的溶液。
DPPH· 清除能力测定参考Sarikurkcu等[16]的方法;·OH清除能力的测定参照 Wei等[17]的方法并稍作
改动,将试验中用到的H2O2 体积分数改为0.1%,邻二氮菲和FeSO4 的浓度改为7.5mmol/L;O2·清除能力
的测定采用Ozsoy等[18]的方法,提取物对金属离子的螯合能力测定参照Gülin和Berashvili[19]的方法。
提取物对自由基的清除能力用清除率和IC50值表示。其中提取物对DPPH·、O2·的清除和对金属离子的
螯合均适用如下公式:清除率(或螯合率)=[(A0-A1)/A0]×100%;其中,A0 为阴性对照(用溶剂代替待测样
品)在特定波长下的吸光度,A1 为待测样品在特定波长下的吸光度;·OH 的清除率公式为:清除率=[(As-
Ap)/(Ab-Ap)]×100%;其中,As为待测样品在536nm波长下的吸光度,Ap为用溶剂代替待测样品在536nm
波长下的吸光度,Ab为用溶剂代替待测样品和H2O2 时在536nm波长下的吸光度。
IC50值是清除率(或螯合率)为50%时的样品质量浓度。IC50值越大,表明该提取物清除自由基能力(或螯合
金属离子能力)越弱,IC50值越小,表明该提取物清除自由基能力(或螯合金属离子能力)越强。
1.4 数据处理
所有测试重复3次,数据以“平均值±标准偏差(珚狓±s)”表示,采用Origin8.5及Excel对数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 毛细辛不同溶剂提取物清除DPPH·活性
DPPH·是一种非常稳定的合成自由基,可以从黄酮类化合物中吸收质子变成黄色,进而通过吸光值的变化
反映样品对自由基的清除能力。黄酮类化合物的抗氧化活性与其清除DPPH·的能力呈正相关[20]。
毛细辛乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物均具有清除DPPH·的能力(图1),4种提取物相比,乙酸乙酯
和正丁醇提取物清除DPPH·的能力较强,而石油醚提取物清除DPPH·的能力最弱。乙酸乙酯、正丁醇、水和
石油醚提取物清除DPPH·的IC50值分别为0.376,0.422,1.294和2334.231mg/mL,均小于阳性对照BHT
的IC50值(0.312mg/mL)。根据IC50值的大小,毛细辛4种溶剂提取物和对照BHT清除DPPH·的能力大小顺
序为:BHT>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提取物>石油醚提取物。
2.2 毛细辛不同溶剂提取物清除·OH活性
·OH是已知最强的氧化剂,几乎可以与所有细胞成分发生反应,对生物体危害极大[21]。通过Fenton反应
体系产生·OH,进而可以测定各提取液对它的清除能力。
毛细辛4种溶剂提取物均具有清除·OH的能力(图2),且随着提取物浓度的升高,清除·OH的能力增强。
毛细辛正丁醇、乙酸乙酯、石油醚和水提取物以及对照BHT的IC50值分别为0.776,0.781,2.082,4.325和0.266
mg/mL,依据IC50值的大小,毛细辛4种溶剂提取物和对照BHT清除·OH的能力大小顺序依次为:BHT>正
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丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>水提取物。正丁醇和乙酸乙酯提取物清除·OH的能力比较接
近,而水提取物对·OH的清除能力最弱。
2.3 毛细辛不同溶剂提取物清除O2·的活性
超氧阴离子自由基(O2·)是分子氧的单电子还原产物,极不稳定,具有高的反应活性,在食品、化工、医药
等领域都受到广泛关注。本实验采用硝基四氮唑蓝还原法,通过检测吸光度的变化确定提取物清除O2·的能
力大小。
毛细辛乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物均具有清除O2·的能力(图3),并且清除能力与提取物浓度呈
量效关系。毛细辛乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚提取物的IC50分别为0.297,0.365,0.988和3.965mg/mL,依
据IC50值大小,毛细辛4种溶剂提取物清除O2·的能力大小顺序为乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提取
物>石油醚提取物。毛细辛乙酸乙酯提取物清除 O2·的能力与对照BHT比较接近,它们的IC50值分别为
0.297和0.296mg/mL。
图1 毛细辛不同溶剂提取物清除犇犘犘犎·的活性
犉犻犵.1 犜犺犲犇犘犘犎·狊犮犪狏犲狀犵犻狀犵犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狅犾狏犲狀狋
犲狓狋狉犪犮狋狊狅犳犃.犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿
图2 毛细辛不同溶剂提取物对·犗犎清除活性
犉犻犵.2 犜犺犲犺狔犱狉狅狓狔犾犳狉犲犲狉犪犱犻犮犪犾狊犮犪狏犲狀犵犻狀犵犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狅犾狏犲狀狋犲狓狋狉犪犮狋狊狅犳犃.犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿
2.4 毛细辛不同溶剂提取物对金属离子的螯合活性
很多金属离子在生物体内作为脂质过氧化反应催化酶的活性部位,对这些离子的螯合作用在一定程度上可
以降低体内的脂质过氧化反应。因而提取物对金属离子的螯合能力从另一方面反映了它的抗氧化能力。
毛细辛4种溶剂提取物均对金属离子有螯合作用,而且水提取物具有较高的金属离子螯合能力,远远超过对
照BHT对金属离子的螯合能力(图4)。毛细辛水、乙酸乙酯、正丁醇和石油醚提取物对金属离子螯合能力的
IC50值分别为0.026,0.528,0.805和26.050mg/mL,BHT的IC50值为0.373mg/mL。依据IC50值的大小,毛
细辛4种溶剂提取物和对照BHT对金属离子的螯合能力大小顺序依次为:水提取物>BHT>乙酸乙酯提取物
>正丁醇提取物>石油醚提取物。
3 结论与讨论
黄酮类化合物是目前研究最多的一类抗氧化物,它们多具有酚羟基,易溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂,
且多与糖类形成黄酮苷类物质。按照刘璐等[22]的方法,测得毛细辛提取物的总黄酮含量为6.43%。冯涛和庄海
宁[23]研究表明:有游离3OH 、5,7间二羟基,3’,4’儿茶素(二羟基)、23双键、4氧代基团的黄酮类化合物要
比其相应没有这些结构特征的化合物的抗氧化活性强,糖苷类取代基会降低黄酮类化合物的抗氧化活性。谢百
波等[14]从毛细辛中分离鉴定的15种化合物,其中(2S)柚皮素5,7二犗β犇吡喃葡萄糖苷 (2Snaringenin5,
7di犗β犇pyranosylglucoside)属于黄酮类化合物,该化合物有4’OH 且5和7位被吡喃葡萄糖基取代,因而
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具有一定的抗氧化活性。据该文献报道,毛细辛乙酸乙酯部分含有6个马兜铃酸衍生物,4羟基苯甲酸(4
hydroxybenzoicacid)、3,4二羟基苯甲酸(3,4dihydroxybenzoicacid)和4羟基肉桂酸(4hydroxycinnamic
acid)。谭榀新等[24]研究表明:酚酸类物质中的羟基苯甲酸及其衍生物、羟基肉桂酸(羟基苯丙烯酸)及其衍生物
均具有较强的抗氧化活性,其活性与酚羟基有关。毛细辛正丁醇部分所含的化合物是(2S)柚皮素5,7二犗β
犇吡喃葡萄糖苷,属于黄酮类物质,具有较强的抗氧化活性。本研究表明,毛细辛全草的乙酸乙酯提取物和正丁
醇提取物均对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有较强的清除能力,根据以上文献资料可以推
断,毛细辛全草乙酸乙酯提取物的抗氧化活性与4羟基苯甲酸、3,4二羟基苯甲酸和4羟基肉桂酸有关,而毛细
辛全草正丁醇提取物的抗氧化活性与(2S)柚皮素5,7二犗β犇吡喃葡萄糖苷有关。
图3 毛细辛不同溶剂提取物对犗2·的清除活性
犉犻犵.3 犜犺犲狊狌狆犲狉狅狓犻犱犲犪狀犻狅狀犳狉犲犲狉犪犱犻犮犪犾狊犮犪狏犲狀犵犻狀犵犪犮狋犻狏犻狋狔
狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狅犾狏犲狀狋犲狓狋狉犪犮狋狊狅犳犃.犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿
图4 毛细辛不同溶剂提取物金属离子螯合能力
犉犻犵.4 犜犺犲犿犲狋犪犾犻狅狀犮犺犲犾犪狋犻狀犵狆狅狑犲狉狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狅犾狏犲狀狋
犲狓狋狉犪犮狋狊狅犳犃.犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿
毛细辛在陕西和甘肃等地作为药物细辛使用,国内外对其研究较少,但细辛属植物在含有的天然产物成分和
化学性质方面都有很多的相似性。如谢百波等[14]的研究发现马兜铃内酰胺I(aristololactamI)和(2S)柚皮素
5,7二犗β犇吡喃葡萄糖苷在多种细辛属植物 (犃.犾狅狀犵犲狉犺犻狕狅犿犪狋狅狊狌犿 的根茎和根、犃.犿犪狓犻犿狌犿 的根、犃.
犻犮犺犪狀犵犲狀狊犲以及犃.犮犪狀犪犱犲狀狊犲全草)中均有发现,故认为这两个成分很可能是该属植物的共有成分。
毛细辛及其他细辛属植物在挥发油组成和非挥发性成分上都很相似,所以它们的药理作用也很相似。通过
分析国内外对其他细辛的研究就可以对毛细辛药用价值有所了解。
Dan等[25]的研究发现北细辛(犃.犺犲狋犲狉狅狋狉狅狆狅犻犱犲狊var.犿犪狀犱狊犺狌狉犻犮狌犿)的挥发油对5种植物病原菌有光谱
抗菌效果,尤其对恶疫霉(phytophthoracactorum)有最佳杀灭效果,挥发油中发挥生物活性的主要是甲基丁香酚
(约占挥发油质量的59.42%)。毛细辛的挥发油含量约为北细辛的1/5[26],且扈成浩等[27]的实验发现毛细辛挥
发油主要成分与北细辛相近,而以榄香脂素为主,那么可以推知毛细辛挥发油对植物病原菌也应有抗菌效果,只
是可能稍弱,具体的结果仍需要实验支持。
Cai等[28]的研究发现,毛细辛、青城细辛(犃.狊狆犾犲狀犱犲狀狊)和皱花细辛(犃.犮狉犻狊狆狌犾犪狋狌犿)95%的乙醇提取物或
水提物对4种肿瘤细胞株(HL60,BGC823,KB和Bel7402)中的一或两种有选择性的细胞毒活性,这为开发
毛细辛的抗肿瘤药性提供了指导。
前文已提到毛细辛具有镇痛、解热等药理作用,但是其作用的机理尚不清除。Kim 等[29]研究发现华细辛
(犃.狊犻犲犫狅犾犱犻犻)的甲醇提取物通过激活类鸦片受体(opioidreceptor)同时抑制血管缓激肽(bradykinin)和组胺调
节的机体反应来发挥镇痛和抗发炎作用。毛细辛与华细辛同属,其镇痛和解热机理或许可以从中得到启示。
在抗氧化研究方面,Iwashinaa等[30]研究75种广义细辛属植物的黄酮组成,发现了3个查尔酮和1个橙酮。
3个查尔酮为:柑橘酮2’,4’二O葡糖苷,柑橘酮4,2’,4’三O葡糖苷,柑橘酮4O葡糖苷(chalcononaringe
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nin2,4’diOglucoside,4,2’,4’triOglucoside,4Oglucoside);1个橙酮鉴定为金鱼草素4,6二O葡糖苷
(aureisidin4,6diOglucoside)。此外,还发现一些黄酮醇类物质,它们是山奈酚3,7O葡糖苷(kaempferol3,
7Oglycoside),槲皮素(quercetin),异鼠李醇(isorhamnetin),黄酮,芹菜苷元6,8二C葡糖苷 (apigenin6,8di
Cglycoside),黄烷酮,柚苷5,7二O葡糖苷 (naringenin5,7diOglucoside),種吨酮(xanthone)和芒果甙
(mangiferin)。这些黄酮类物质都有一定的抗氧化活性。
毛细辛中含有 (2S)柚皮素5,7二犗β犇吡喃葡萄糖苷,Lin和Chiou
[31]的研究显示柚皮素对人视网膜色
素上皮细胞 (ARPE219)和人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)有抗氧化作用,当上述细胞面临缺氧或者受到NaN3
和H2O2 氧化胁迫时,一定浓度的柚皮素能提高细胞的生存率,同时对这两种细胞均有抗氧化作用。那么,毛细
辛提取物能否通过发挥其抗氧化活性来治疗老年视网膜黄斑变性将是一个令人期待的问题。
尽管毛细辛及其他细辛属植物在医药方面的巨大价值和潜能,但是在实际用药过程中,仍然不得不面对一个
头疼的问题:它们的毒性。Schaneberg和Khan[32]的研究发现:细辛属植物具有肾毒性并可能致命的原因是它
们都含有马兜铃酸 (aristolochicacid)I和II。因而,将毛细辛提取物用于抗氧化剂或其他药用时,一定要充分考
虑安全问题。
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犃狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋犪犮狋犻狏犻狋犻犲狊犻狀狏犻狋狉狅狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆狅犾犪狉狊狅犾狏犲狀狋犲狓狋狉犪犮狋狊狅犳犃狊犪狉狌犿犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿
HEQuanlei,MIAOFang,LIChunling
(ColegeofLifeScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Theantioxidativeactivities犻狀狏犻狋狉狅ofdifferentsolventextractsof犃狊犪狉狌犿犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿 werestudied
toprovidemoreinformationforfutureresearchonthemedicinalvalueof犃.犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿.Thepowderedmate
rialof犃.犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿 wasextractedwith50%ethanolrefluxingextractionandtheethanolcondensatewas
evaporatedtodrynessundervacuumonarotaryevaporator.ThecondensatewasthenextractedwithPetroleum
ether,ethylacetateornbutanolorwateratthesamevolumetogetfourdifferentextracts.Thefourextracts
werethenexaminedfortheirantioxidativeactivitiesbyDPPH (1,1diphenyl2plcrylhydrazyl),Fenton,NBT
(nitrotetrazoliumbluechloride)reductionandFe2+chelation.Theresultssuggestthatthefoursolventextracts
of犃.犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿hadacertaindegreeofantioxidantactivity,andtheactivityhadapositivecorrelationwith
theconcentrationoftheextract.TheethylacetateextracthadhigheractivityinscavengingDPPH·(IC50=
0.376mg/mL)andO2· (IC50=0.297mg/mLHilethenbutanolextracthadthehighest·OHscavenging
capacity(IC50=0.776mg/mL).Thewaterextractwasthemostpowerfulforchelatingmetalions(IC50=
0.026mg/mL)andwasmorepowerfulthanthatofBHT(2,6ditertbutyl4methylphenol)(IC50=0.373
mg/mL).Thisstudyhasshownthattheethylacetateextract,nbutanolextractandwaterextractof犃.犺犻
犿犪犾犪犻犮狌犿haveremarkablefreeradicalscavengingactivities,andthewaterextractcanbeselectedasanew
metalionchelatingreagent.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犃狊犪狉狌犿犺犻犿犪犾犪犻犮狌犿;extract;antioxidantactivity;freeradicalscavenging
092 ACTAPRATACULTURAESINICA(2012) Vol.21,No.5