全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（３）：３４８ ３５３
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０３０３４８０６
基于马尾松反转录转座子序列的 ＩＲＡＰ分子
标记开发及应用
崔博文１，２，范付华２，丁贵杰２，杨章旗３，文晓鹏１
（１．贵州大学农业生物工程研究院生命科学院 山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，
贵州 贵阳 ５５００２５；２．贵州大学贵州省森林资源与环境研究中心，贵州 贵阳 ５５００２５；３．广西林科院，广西 南宁 ５３００００）
收稿日期：２０１５１１０２
基金项目：贵州省重大专项（２０１２６０１１－１）和８６３计划（２０１１ＡＡ１００２０３０１）
作者简介：崔博文（１９８４—），博士生，主要从事森林培育研究，Ｅｍａｉｌ：ｈｂｑｈｄ１６ｃｕｉｂｏｗｅｎ＠１６３．ｃｏｍ
共同第一作者
通讯作者：文晓鹏，主要从事林木生物技术与遗传育种研究，Ｅｍａｉｌ：ｘｐｗｅｎｓｃ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ．
摘要：［目的］为了丰富马尾松遗传信息，开发更多适用于马尾松的新型分子标记。［方法］依据马尾松Ｔｙ１ｃｏｐｉａ类
型和Ｔｙ３ｇｙｐｓｙ类型反转录转座子ＲＴ序列的保守区域设计引物，建立了马尾松ＩＲＡＰＰＣＲ技术体系并以１２个基因
型个体为材料进行验证。［结果］４２条引物中筛选出多态性丰富、重复性好的２９条进行ＰＣＲ扩增，共获得２２７条谱
带，其中多态性条带２０７个，多态性比例为９１．１９％，平均观测等位基因数（Ｎａ）为１．９１１９±０．２８４１，有效等位基因
数（Ｎｅ）为１．４６８０±０．２８８２，Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数（Ｈ）为０．２９１１±０．１４４９，Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ信息指数（Ｉ）为０．４４７２±
０．１９５３；利用引物Ｐ１２、Ｐ１５或Ｒ１，可以将栽培种与无性系两类区分开；Ｐ２可作为核心引物，能将１２份供试材料
有效区分开来；采用ＩＲＡＰ标记构建了供试种质的ＤＮＡ指纹图谱；供试种质的遗传相似系数为０．４６ ０．６９，以相似
系数为基础，进行ＵＰＧＭＡ聚类分析，以０．５７为阈值可将供试种质分为三类，其中无性系内不同材料间也存在较大
的遗传变异。［结论］ＩＲＡＰ分子标记能有效地用于马尾松种质的鉴别与亲缘关系分析等相关研究。
关键词：反转录转座子；ＩＲＡＰ标记；马尾松；指纹图谱；多态性
中图分类号：Ｓ７９１２４８ 文献标识码：Ａ
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＩＲＡＰＭａｒｋｅｒｓＢａｓｅｄｏｎＧｅｎｏｍｉｃＬＴＲＲｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ
ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎＭａｓｓｏｎＰｉｎｅ（Ｐｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａ）
ＣＵＩＢｏｗｅｎ１，２，ＦＡＮＦｕｈｕａ２，ＤＩＮＧＧｕｉｊｉｅ２，ＹＡＮＧＺｈａｎｇｑｉ３，ＷＥＮＸｉａｏｐｅｎｇ１
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＲｅｓｏｕｒｃｅＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｉｎＭｏｕｎｔａｉｎｏｕｓＲｅｇｉｏｎ（ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ
ＡｇｒｏｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；２．ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＦｏｒｅｓｔ
ＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｏｆＧｕｉｚｈｏｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；３．ＧｕａｎｇｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，
Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００００，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏｄｅｖｅｌｏｐｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒＰｉｎｕｓｍａｓｏｎｉａｎａ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｒｅｇｉｏｎｏｆＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＴｙ１ｃｏｐｉａａｎｄＴｙ３ｇｙｐｓｙｔｙｐｅｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ，ｔｈｅ
ＩＲＡＰＰＣＲｓｙｓｔｅｍｆｏｒＰ．ｍａｓｏｎｉａｎａｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｎｄｅｘａｍｉｎｅｄｗｉｔｈ１２ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｏｆ４２ＩＲＡＰｐｒｉｍ
ｅｒｓ，２９ｇａｖｅｓｔａｂｌｅａｎｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓ，ｔｈｕｓｙｉｅｌｄｅｄ２２７ｂａｎｄｓ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈ２０７ｗｅｒｅｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｃ，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇｆｏｒ９１．１９％ ｏｆｔｈｅｔｏｔａｌ．ＴｈｅａｖｅｒａｇｅＯｂｓｅｒｖｅｄＮｕｍｂｅｒｏｆＡｌｅｌｅｓ，ＥｆｅｃｔｉｖｅＮｕｍｂｅｒｏｆＡｌｅｌｅｓ，
Ｎｅｉ’ｓＧｅｎｅｔｉｃＤｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄＳｈａｎｎｏｎＩｎｄｅｘｏｆＤｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅｔｗｅｌｖｅＰ．ｍａｓｏｎｉａｎａｇｅｍｐｌａｓｍｓｗｅｒｅ１．９１１９±
０２８４１，１．４６８０±０．２８８２，０．２９１１±０．１４４９ａｎｄ０．４４７２±０．１９５３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｔｙｐｅｓａｎｄ
ｃｌｏｎｅｓｃｏｕｌｄｂｅｅｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄｂｙｐｒｉｍｅｒｓＰ１２，Ｐ１５ｏｒＲ１，ａｎｄａｌｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｓｍｉｇｈｔｂｅｃｌａｒｉｆｉｅｄｂｙ
第３期 崔博文，等：基于马尾松反转录转座子序列的ＩＲＡＰ分子标记开发及应用
Ｐ２，ｗｈｉｃｈｗａｓｌａｂｅｌｅｄａｓｔｈｅｃｏｒｅｐｒｉｍｅｒｆｏｒｔｅｓｔｅｄｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ．Ｔｈｅｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｏｆｔｈｅ１２ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ
０．４６ｔｏ０．６９，ａｎｄｗｉｔｈｔｈｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄｏｆ０．５７，ａｌｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｓｗｅｒｅｇｒｏｕｐｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｓｕｂｃｌｕｓｔｅｒｓｂｙｔｈｅＵＰＧ
ＭＡ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＴｈｅＩＲＡＰｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｍａｙｅｆｅｃｔｉｖｅｌｙｆａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｉｎＰ．ｍａｓｏｎｉａｎａｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍａｓｓｏｎｐｉｎｅ；Ｐｉｎｕｓｍａｓｏｎｉａｎａ；ＩＲＡＰ；ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ；ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
马尾松（ＰｉｎｕｓｍａｓｏｎｉａｎａＬａｍｂ．）作为南方优
势的用材树种，在其漫长的进化历程中，孕育了丰富
的遗传多样性资源。分子标记作为一种揭示遗传物
质真实性的简单直观工具，其结果不易受环境因素
影响，在植物种质资源的遗传多样性评价、亲缘关系
分析及遗传图谱构建等领域，显示出独特的优势。
迄今报道的马尾松分子标记技术有 ＳＳＲ、ＳＲＡＰ
等［１－２］，但这些标记开发过程复杂，成本高，多态率
低，因此，开发其它有效的分子标记，对马尾松种质
资源的评价和利用，尤其是近缘优良家系间的鉴定
及分子标记辅助选择显得尤为必要。
ＩＲＡＰ（ｉｎｔｅｒｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｓｍ）由 Ｋａｌｅｎｄａｒ等［３］在大麦中首先开发，是一种
基于植物反转录转座子序列间多态性的分子标记，
可以由同物种或近缘种的反转录转座子 ＲＴ序列和
ＬＴＲ的保守区开发获得［４－５］。作者所在课题组前期
工作显示，ＩＲＡＰ标记应用于马尾松遗传多样性评价
是可行的［６］。本文在已获得的马尾松反转录转座子
ＲＴ序列的基础上，开发ＩＲＡＰ引物，筛选并建立ＩＲＡＰ
分子标记实验体系，构建部分种质的ＩＲＡＰ指纹图谱
和分析其亲缘关系，为进一步开展马尾松种质的分子
系统学研究与遗传图谱构建等提供技术基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料制备
供试材料（表１）均采自广西南宁林科所国家马
尾松良种基地（广西武鸣县南宁地区林业科学研究
所）的样本区，随机选取８３号家系的５个无性系以
及无性系 Ｆ２周围的７份栽培种质单株，采集带有
新鲜健康针叶簇的多年生枝条，轻拭擦除其表面水
份并封存于封口袋中，带回室内取幼嫩针叶，经液氮
处理后储于－８０℃超低温冰箱备用。
采用天根生化科技（北京）有限公司 ＤＰ３２０新
型植物基因组提取试剂盒（简称 ＤＰ３２０），按操作方
法分别提取１２份材料的基因组 ＤＮＡ，１％琼脂糖凝
胶电泳检测 ＤＮＡ完整性及浓度，ＴＥ稀释后保存到
－２０℃冰箱备用。
表１ ＩＲＡＰ标记供试马尾松材料
采集区 编号 树高／ｍ 胸径／ｃｍ 类型 性状
２－２ Ｙ－１ － － 栽培型 速生
２－２ Ｙ－２ － － 栽培型 速生
２－２ Ｙ－３ － － 栽培型 速生
２－２ Ｙ－４ － － 栽培型 速生
２－２ Ｙ－５ － － 栽培型 速生
２－２ Ｙ－６ － － 栽培型 速生
２－２ Ｙ－７ － － 栽培型 速生
２－８ Ｆ－１ １３．６ ３４．２ 无性系 抗旱、速生
２－２ Ｆ－２ １４．３ ３１．３ 无性系 抗旱、速生
２－２ Ｆ－３ １８．９ ３８．８ 无性系 抗旱、速生
２－２ Ｆ－４ １８．８ ３６．５ 无性系 抗旱、速生
２－４ Ｆ－５ １９．６ ４２．０ 无性系 抗旱、速生
注：“－”代表数据缺失
１．２ ＩＲＡＰ扩增及ＰＣＲ产物检测
根据马尾松反转录转座子Ｔｙ１ｃｏｐｉａ和Ｔｙ３ｇｙｐ
ｓｙ的ＲＴ序列［７］，应用 ＣｌｕｓｔａｌＸｖｅｒｓｉｏｎ２软件确定不
同类型转座子氨基酸序列的保守区域（图 １），在
ＭＥＧＡ５．０５中将氨基酸序列转化为对应的核酸序
列，并采用Ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５．０和Ｏｌｉｇｏ６软件，以保守
区域上游（近ＲＴ序列５’端）２０ ２４ｂｐ逐条设计单
向引物。
ＩＲＡＰＰＣＲ反应体系总体积１０μＬ，其中含 ｍｉｘ
（天根生化科技有限公司）５μＬ，引物１０μｍｏｌ·Ｌ－１）
０．３μＬ，模板（１０ １５ｎｇ·μＬ－１）１μＬ，最后加ｄｄＨ２Ｏ
补齐。参照合成Ｔｍ值，采用退火温度梯度试验，确定
每条引物的退火温度。ＰＣＲ扩增程序为：最初设定循
环数为３５，扩增产物少的适当增加５个循环。
ＩＲＡＰＰＣＲ采用如下扩增程序：
９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，依照不同引
物设定相应退火温度，反应４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５
４０个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃中止反应。
反应最终扩增产物由 １．５％琼脂糖凝胶电泳
检测。
１．３ 数据处理与分析
电泳检测为清晰、可重复性强的谱带按“引物号
－片段长度”记录为指纹，有和无谱带分别赋值１和
０，建立种质的 ＤＮＡ指纹图谱及 ＩＲＡＰ标记数据矩
阵，通过 ＰＯＰＧＥＮＥ１．３２软件计算平均观察等位基
９４３
林 业 科 学 研 究 第２９卷
ａ．Ｔｙ１ｃｏｐｉａ类型，ｂ．Ｔｙ３ｇｙｐｓｙ类型
图１ 马尾松反转录转座子ＲＴ序列位置及保守区域
０５３
第３期 崔博文，等：基于马尾松反转录转座子序列的ＩＲＡＰ分子标记开发及应用
因数（Ｎａ）、有效等位基因数（Ｎｅ）、Ｎｅｉ’ｓ遗传多样
性指数（Ｈ），Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ信息指数（Ｉ）。采用 ＮＴ
ＳＹＳｐｃ２．０１ｅ软件计算各材料间相似系数，利用 ＵＰ
ＧＭＡ法进行聚类分析。
２ 结果与分析
２．１ ＩＲＡＰ标记开发
根据引物设计原理，综合考虑引物长度、Ｔｍ值、
ＰＣＲ产物等因素，从所有７９条反转录转座子 ＲＴ序
列（图１）中获得４２条ＩＲＡＰ引物，其中１６条来自于
Ｔｙ１ｃｏｐｉａ家族，２６条来自 Ｔｙ３ｇｙｐｓｙ的对应区域。
ＰＭＲＴ１２、ＲＥＰＭ８、ＲＥＰＭ１８等 ９条序列都分别有两
个区域可获得待检的ＩＲＡＰ引物。
ＩＲＡＰＰＣＲ反应采用１０μＬ体系，分别进行退火
温度梯度筛选，根据扩增产物的扩增条带的数量和质
量确定最优的反应退火温度。结果表明，引物 Ｒ２１
在Ｈ（５９℃）时条带较清晰、多态性较好，但扩增产量
较低，在此条件下增加反应循环数可增加拷贝数，从
而获得较理想的扩增体系。经过初筛和复筛，筛选出
２９条扩增效果好、重复性强的多态性引物（表２），多
态率达到６９．０４％，可用于马尾松的后续研究。
２．２ 指纹图谱构建
ＩＲＡＰＰＣＲ扩增表明，栽培种质Ｙ１到Ｙ７和无
性系材料Ｆ１到 Ｆ５都有其特异指纹组合。如表３
所示，Ｐ１２２００到 Ｒ１６２０００所有谱带在抗旱无性
系材料中均出现，而在栽培材料中出现缺失带；引物
Ｐ１２和Ｐ１５，在指纹图中分别出现两条指示性特异
条带，故仅需一条引物就可判断供试材料是否属于
无性系材料。同样，表 ３中 Ｒ１６１１００到 Ｒ１１５００
全部谱带在栽培材料中同时出现，而在无性系材料
表２ ＩＲＡＰ引物信息
引物
名
引物序列（５′－３′） 位置
退火温
度／℃
ＧｅｎｅＢａｎｋ
登陆号
Ｐ１ ＡＧＧＧＴＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧ ６８→８９ ５４ ＪＱ９７５２２２
Ｐ２ ＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＴＡＴＴＴＡＴＣＴＧＧ ２２０→２４１ ６１ ＪＱ９７５１８２
Ｐ３ ＡＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧ ６８→８９ ５８ ＪＱ９７５２２３
Ｐ４ ＧＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧ ６３→８４ ５８ ＪＱ９７５１９１
Ｐ５ ＴＧＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡ ６０→８１ ６４ ＪＱ９７５２３３
Ｐ７ ＧＧＴＧＡＧＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＴＡ ６３→８４ ５２ ＪＱ９７５１９０
Ｐ８ ＴＴＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣ １５８→１７９ ６３ ＪＱ９７５１９０
Ｐ９ ＧＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣ ６１→８２ ５７ ＪＱ９７５２０１
Ｐ１１ＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＣＴ ６２→８３ ６１ ＪＱ９７５２２６
Ｐ１２ＡＡＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡ １１９→１４０ ５５ ＪＱ９７５１９２
Ｐ１４ＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＣＴＡＡＴＧＴＧＣ ６９→９０ ５５ ＪＱ９７５２１６
Ｐ１５ＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＡＴＣ １２１→１４２ ５２ ＪＱ９７５２０７
Ｐ１６ＡＧＧＧＴＡＴＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧ ５４→７５ ５９ ＪＱ９７５２３４
Ｒ１ ＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴ ２５→４４ ５３ ＪＱ９７５２４２
Ｒ３ ＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧ ２５→４５ ５２ ＪＱ９７５２４５
Ｒ５ ＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＧＡＴＧＴＣＡＣＴＡ １７５→１９４ ５１ ＪＱ９７５２５５
Ｒ８ ＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＣＡ １７５→１９４ ５４ ＪＱ９７５２４１
Ｒ９ ＧＡＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＣ １２１→１４１ ５７ ＪＱ９７５２４３
Ｒ１３ＡＧＡＧＧＴＡＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＴＴＡ １→２０ ５２ ＪＱ９７５２５０
Ｒ１４ＴＴＧＧＴＴＡＴＧＣＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＧＡ １９８→２１９ ５２ ＪＱ９７５２４７
Ｒ１６ＡＧＣＧＧＴＡＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡ １→２０ ５７ ＪＱ９７５２４４
Ｒ１７ＡＧＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＡＴＣＧＣＴＡＣＣＣ ５０→７１ ５５ ＪＱ９７５２４４
Ｒ１９ＡＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＴＡＣＡＣＣＣ ４５→６６ ５７ ＪＱ９７５２５４
Ｒ２０ＣＡＡＧＡＴＡＡＧＡＣＴＣＡＡＴＣＣＧＣＡＣＡＡ ３９０→４１３ ６４ ＪＱ９７５２５４
Ｒ２１ＧＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＴＡＣＡＣＣＣ ４５→６６ ５９ ＪＱ９７５２４９
Ｒ２２ＧＡＴＡＡＧＡＣＴＣＡＡＴＣＣＧＣＡＣＡＡＧ ３９３→４１４ ５９ ＪＱ９７５２４９
Ｒ２３ＧＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＴＡＣＡＣＣＣＴＴＣＡ ４９→７０ ６３ ＪＱ９７５２３９
Ｒ２４ＧＡＴＡＡＧＡＣＴＣＡＡＴＣＣＧＣＡＣＡＡ ４９→６９ ５２ ＪＱ９７５２４０
Ｒ２５ＡＧＣＧＧＴＡＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＴＴＡ １→２０ ５５ ＪＱ９７５２５２
注：退火温度处的“”表明ＰＣＲ扩增反应为４０个循环
中有缺失现象；引物 Ｒ１在１７００ｂｐ和１５００ｂｐ处
可区分这两类种质。此外，也有一些引物可以将所
有供试材料区分开，如引物Ｐ２（图２）的扩增产物具
有各自特异的指纹标记，这一类引物可作为核心
标记。
表３ 不同性状马尾松种质的ＩＲＡＰ指纹识别码
位点／ｂｐ
样品
Ｙ１ Ｙ２ Ｙ３ Ｙ４ Ｙ５ Ｙ６ Ｙ７ Ｆ１ Ｆ２ Ｆ３ Ｆ４ Ｆ５
Ｐ１２２００ １ ０ １ ０ １ １ ０ １ １ １ １ １
Ｐ１２１６００ ０ １ ０ ０ １ ０ ０ １ １ １ １ １
Ｐ１２１４００ １ １ １ ０ １ １ ０ １ １ １ １ １
Ｐ１５２０００ １ １ ０ １ ０ ０ ０ １ １ １ １ １
Ｐ１５１６００ ０ ０ １ １ ０ ０ １ １ １ １ １ １
Ｒ１７４２５ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ １ １ １
Ｒ２１１４００ ０ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １
Ｒ１９００ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ １
Ｒ３４００ ０ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １
Ｒ１６２０００ １ １ ０ １ ０ ０ ０ １ １ １ １ １
Ｒ１６１１００ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ ０ １
Ｒ２２１０５０ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １
Ｒ２１１６００ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １
Ｒ１１７００ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １
Ｒ１１５００ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ ０ ０ １
１５３
林 业 科 学 研 究 第２９卷
图２ 引物Ｐ２扩增电泳图
２．３ 基于ＩＲＡＰ标记的马尾松种质亲缘关系分析
利用２９条引物对１２个马尾松样品进行扩增，
共扩增２２７个位点，其中多态性位点２０７个，多态性
比例为 ９１．１９％，平均观测等位基因数（Ｎａ）为
１．９１１９±０．２８４１，有效等位基因数（Ｎｅ）＝１．４６８０
±０．２８８２，Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数（Ｈ）为０．２９１１±
０．１４４９，Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ信息指数（Ｉ）＝０．４４７２±
０．１９５３，表明供试种质的遗传差异大。基于这些
ＩＲＡＰ标记，计算Ｊａｃｃａｒｄ相似系数，所有材料相似系
数０．４６ ０．６９，其中无性系材料在０．６０ ０．６９，表
明马尾松无性系材料也存在一定的遗传差异。据此
相似系数为基础进行 ＵＰＧＭＡ聚类分析，以相似系
数０．５７为阈值，供试材料可聚为三类（图３）：大部
分栽培种为第一类，无性系类 Ｆ１到 Ｆ４为第二类，
Ｙ３和Ｙ４组成第三类；无性系Ｆ５与栽培种聚在第
一类，且与Ｙ２表现了较高的相似性，进一步显示马
尾松无性系存在较大的遗传变异。
图３ 马尾松种质的聚类分析图
３ 讨论
反转录转座子是数量最大的可自由活动的转座
子，在裸子植物基因组中以高拷贝存在，直接或间接
参与植物基因组扩增、重排、突变等事件［８－１０］，其特
殊的生物学特性和转座机制不断引起植物进化、遗
传及基因多样性研究的关注。分子标记作为一种简
单直观的揭示遗传物质真实性的工具，其鉴定结果
不易受环境因素影响，ＩＲＡＰ分子标记是基于同物种
或近缘种的反转录转座子ＲＴ序列和 ＬＴＲ的保守区
设计引物，对相邻 ＬＴＲ间的区域进行 ＰＣＲ扩增，而
开发的一种新型分子标记［４－５］。本文在５８条 Ｔｙ１
ｃｏｐｉａ和２２条 Ｔｙ３ｇｙｐｓｙ的 ＲＴ序列中，分别获得引
物２６条和１６条，从 Ｔｙ３ｇｙｐｓｙ家族 ＲＴ序列中获得
引物的潜力优于Ｔｙ１ｃｏｐｉａ家族，但因前者在松科植
物基因组中的拷贝数低于后者［７］，使二者最终确定
的有效多态性引物数量相差不大，引物多态率达到
６９．０４％，此结果优于 Ｂａｉ等［１１］开发的基因组 ＳＳＲｓ
引物在马尾松自然群体扩增的多态率（５０％）。同
时筛选出的马尾松ＩＲＡＰ标记具有较丰富的多态性，
ＩＲＡＰ作为一种分子辅助标记可以较好的区分供试
马尾松材料。繁琐的实验步骤和冗长的实验周期会
带来更多的实验误差，相对于 ＳＳＲ标记、ＳＲＡＰ标记
ＰＣＲ产物采用 ＰＡＧＥ胶检测［１２－１３］，ＩＲＡＰ标记实验
周期短，仅需采用一般 ＰＣＲ反应扩增体系［１４］，而扩
增产物用１．５％的琼脂糖凝胶检测就可得到较好的
扩增效果［６］，因此具有操作简便的特点。
反转录转座子在同物种或同一物种不同个体间
具有高度异质性，这一特性使ＩＲＡＰ标记被认为是构
建ＤＮＡ指纹图谱的理想标记技术［１５］。近年来，基
于反转录转座子的分子标记被开发并在遗传多样性
分析和品种鉴定等方面得以应用［１６－１８］，尤其对遗传
距离较近或同源的物种及家系具有较好的扩增效
果［１９］。本文应用较少的引物序列组合，就可构建出
较清晰的马尾松指纹图谱；令人感兴趣的是，优良家
系８３号的５个无性系，仅用一条引物（Ｐ２）就可以
全部区分开来，反应出ＩＲＡＰ标记在马尾松种质鉴定
及种苗纯度检测上具有高效性，同时也说明马尾松
无性系也广泛存在ＤＮＡ水平上的遗传变异，通过体
细胞变异选种也是马尾松实现遗传改良的重要
途径。
通过ＩＲＡＰ技术发现，本研究所检测的１２份马
尾松材料的Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数（Ｈ）和Ｓｈａｎｎｏｎ’
ｓ信息指数（Ｉ）均高于李广军等［２０］对广西古蓬（Ｈ＝
０．２７６５，Ｉ＝０．４２７８）种源马尾松遗传多样性的研
究，说明该采集区组多样性较为丰富，同时也支持了
李志辉等［２１］提出的种子园的遗传多样性高于天然
林的观点。
聚类分析结果显示无性系个体间的亲缘关系较
近，与栽培种亲缘关系较远。理论上同一家系无性
系间的遗传背景是较为一致的，而栽培种个体间差
２５３
第３期 崔博文，等：基于马尾松反转录转座子序列的ＩＲＡＰ分子标记开发及应用
异较大，本文的７个栽培种因相似系数差异大而被
划分到两大类（图３）。由于这七个栽培种在种子园
中位于优良无性系间，以避免无性系间造成自交或
近交，与无性系较远的亲缘关系在分子水平佐证了
该种子园区组分配的合理性。Ｆ５与８３号家系的其
他无性系个体间差异较大而与栽培种Ｙ２表现了较
高的相似性并归属于一类，产生此结果可能归因于
１）本文获得的 ＩＲＡＰ标记与马尾松的一些速生基
因／ＱＴＬ连锁，因为Ｆ５的胸径和树高值均大于其他
４个无性系材料（表１）；２）转座子发生横向传递［２２］，
导致Ｆ５与Ｙ２间出现相似反转录转座子。
４ 结论
综上所述，ＩＲＡＰ标记因其显性标记属性，在种
质遗传多样性分析和构建遗传图谱时，无法区分基
因型是纯合体还是杂合体，但其多态性丰富、重复性
好。本文建立的马尾松 ＩＲＡＰ标记体系操作简便，
易于掌握，并且利用较少的引物就可以获得丰富的
基因组信息，为马尾松种质鉴定、亲缘关系分析、遗
传多样性评价及遗传图谱构建等相关研究提供了新
途径。
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（责任编辑：张 研）
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