全 文 ：书正交设计优化山野豌豆犛犚犃犘－犘犆犚
反应体系与引物筛选
刘颖１，王显国２，张巨明１，刘芳３
（１．华南农业大学农学院，广东 广州５１０６４２；２．中国农业大学动物科技学院，北京１００１９３；３．全国畜牧总站，北京１００１９３）
摘要：采用正交试验设计，以山野豌豆叶片ＤＮＡ为模板，从 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物和ＴａｑＤＮＡ聚合酶４种因素３个水
平，对山野豌豆ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系进行优化，并比较了不同浓度模板ＤＮＡ对扩增效果的影响，建立了山野豌
豆的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ最佳反应体系。结果表明，山野豌豆ＳＲＡＰ－ＰＣＲ最佳反应体系为：２μＬ１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（不含
Ｍｇ２＋）、３０ｎｇ的模板ＤＮＡ、引物２．０μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ
２＋２．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．５Ｕ、ｄＮＴＰ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，总
体积为２５μＬ。各因素对扩增反应结果均有不同影响，其中以引物浓度影响最大，ｄＮＴＰ浓度的影响最小。运用该
体系对３份山野豌豆种源进行验证，证明该体系稳定可靠，并从９８对ＳＲＡＰ引物组合中筛选出扩增条带清晰、多
态性丰富的２０对引物组合。这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为ＳＲＡＰ分子标记技术进行山野豌豆分子
遗传学研究奠定了基础。
关键词：山野豌豆；ＳＲＡＰ；ＰＣＲ体系优化；正交设计；引物筛选
中图分类号：Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０５０３２５０６
山野豌豆（犞犻犮犻犪犪犿狅犲狀犪）又叫落豆秧、高蔓草藤、宿根苕子，为豆科巢菜属多年生草本植物［１］。它表现出耐
寒、抗旱、叶量大、粗蛋白及动物必需氨基酸含量高、适应性广、再生力强、容易繁殖、产量高、品质好等优点［２５］。
另外，山野豌豆不仅是一种优良牧草，而且还是很好的防风固沙水保植物［６］、改土肥田绿肥作物［７］和草坪及药用
植物［８］，具有推广和应用价值。目前ＳＲＡＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）标记已在农作物和园艺
作物上有了较多成功的应用，但ＳＲＡＰ在豆科牧草种质资源上的应用还非常少，仅在苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅）［９１５］、大豆
（犌犾狔犮犻狀犲）［１６１８］、三叶草（犜狉犻犳狅犾犻狌犿）［１９，２０］、山羊豆（犌犪犾犲犵犲）［２１］、小扁豆（犔犲狀狊）［２２，２３］等属有相关报道。本研究主要
采用正交设计法对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应条件中主要因子：Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物、Ｔａｑ酶进行优化分析并确定了模板
ＤＮＡ浓度，旨在筛选出一个适用于野豌豆属的稳定性及重复性好，多态性高的最佳反应条件。此外，本研究还对
部分ＳＲＡＰ引物组合进行了多态性筛选，希望获得一些多态性丰富的ＳＲＡＰ引物组合，为开展ＳＲＡＰ标记技术
在山野豌豆种质鉴定、遗传多样性等方面的分子生物学研究提供有利依据。
１ 材料与方法
１．１ 供试材料
试验所用５份山野豌豆材料采自全国３个不同的地域，优化ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系的ＤＮＡ模板来自内蒙古呼
伦贝尔的９号、山西五台山的６号及北京百花山的１４号ＤＮＡ；筛选引物所用ＤＮＡ模板来自山西沁源的１１号、
北京灵山的５号及内蒙古呼伦贝尔的９号ＤＮＡ。
１．２ 试验设计与方法
１．２．１ ＰＣＲ反应体系设计与引物组合 采用Ｌ９（３４）正交试验设计，对 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶进
行４因素３水平筛选（表１）。体系优化分别采用３份不同ＤＮＡ进行，每份ＤＮＡ做２次重复，取其平均值作为统
计数据。体系总体积为２５μＬ，除表中变化的因素外，每管中还加入２μＬ１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ和５０ｎｇ的模板
ＤＮＡ，所用引物组合为 Ｍｅ２＋Ｅｍ４。
第２１卷 第５期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
３２５－３３０
２０１２年１０月
收稿日期：２０１１０９０７；改回日期：２０１１１１０７
基金项目：十二五国家科技支撑项目（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０１０２）资助。
作者简介：刘颖（１９８７），女，满族，吉林通化人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：１０５４００２８８＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｊｉｍｍｚｈ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１．２．２ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增程序及扩增产物的检测
ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变
性１ｍｉｎ，３７℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，５个循环；
９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个
循环；循环结束后，７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。扩增结
束后，在扩增产物中加入５μＬ６×ｌｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ缓冲
液混匀，取８μＬ上样于２％的琼脂糖凝胶中进行分
离。
１．２．３ 模板ＤＮＡ浓度优化 应用上述体系最佳组
合，引物组合为 Ｍｅ２＋Ｅｍ４，ＤＮＡ模板为５号ＤＮＡ。
将２５μＬ扩增体系中模板ＤＮＡ用量分别设置６个梯
度处理，即１０，２０，３０，４０，５０和６０ｎｇ，对反应体系中的
模板ＤＮＡ浓度进行优化。
１．２．４ 多态性ＳＲＡＰ引物组合的筛选 根据上述试
表１ 犛犚犃犘－犘犆犚［犔９（３４）］正交试验设计
犜犪犫犾犲１ 犗狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀犳狅狉犛犚犃犘－犘犆犚［犔９（３４）］
序号
Ｎｏ．
ＴａｑＤＮＡ聚合酶
ＴａｑＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ）
ｄＮＴＰ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
（μｍｏｌ／Ｌ）
Ｍｇ２＋
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
１ ０．５ ０．２ ０．２ １．５
２ ０．５ ０．３ ０．４ ２．０
３ ０．５ ０．４ ２．０ ２．５
４ １．０ ０．２ ０．４ ２．５
５ １．０ ０．３ ２．０ １．５
６ １．０ ０．４ ０．２ ２．０
７ １．５ ０．２ ２．０ ２．０
８ １．５ ０．３ ０．２ ２．５
９ １．５ ０．４ ０．４ １．５
验结果确定的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ最佳反应体系，选取Ｌｉ和Ｑｕｉｒｏｓ［２４］及Ｒｉａｚ等［２５］发表的引物序列，包括７条正向引
物和１４条反向引物两两组合成９８个ＳＲＡＰ引物组合（表２），对３份山野豌豆种源材料进行多态性ＳＲＡＰ引物
组合的筛选。
表２ 犛犚犃犘引物序列
犜犪犫犾犲２ 犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犳狅狉犛犚犃犘犪狀犪犾狔狊犻狊
编号Ｃｏｄｅ 正向引物Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓ 编号Ｃｏｄｅ 反向引物 Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓ
Ｍｅ３ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴ Ｅｍ６ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ
Ｍｅ６ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡ Ｅｍ７ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ
Ｍｅ７ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＣＣ Ｅｍ８ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ
Ｍｅ８ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ Ｅｍ９ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡ
Ｍｅ１０ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＴＧ Ｅｍ１０ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＧ
Ｍｅ１１ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＴ Ｅｍ１１ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡ
Ｍｅ１２ ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＣＡ Ｅｍ１２ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＴＧ
Ｅｍ１３ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＧＣ
Ｅｍ１４ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＣＧ
Ｅｍ１５ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＡＧ
Ｅｍ１６ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧ
Ｅｍ１７ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＴＣ
Ｅｍ１８ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＧＴ
Ｅｍ１９ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧ
２ 结果与分析
２．１ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ正交试验设计的扩增结果分析
山野豌豆ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系优化的正交试验结果如图１所示。参照何正文等［２６］的方法，对扩增结果进行直
观分析，依据谱带的亮度、清晰度以及条带数，将９个处理结果划分为９个评分等级以便统计分析，内蒙古呼伦贝
尔的ＤＮＡ扩增结果得分为１，３，２，５，６，７，９，４和８。山西五台山与北京百花山的ＤＮＡ扩增结果得分分别为１，
６，７，８，５，２，９，３和４及６，７，４，３，５，１，９，２和８。３份不同种源的９个处理结果的总平均得分为２．６７，５．３３，４．３３，
６２３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
５．３３，５．３３，３．３３，９．００，２．６７，６．６７。得分最高为组合７带型清晰，亮度高，且杂带少，扩增效果最好，选为山野豌
豆基因组ＳＲＡＰ－ＰＣＲ的最佳扩增反应体系。
参照张丽等［２７］的方法，对各组分浓度组合的正交试验结果进行了统计分析（表３），其中Ｔ值代表某水平下
某因子参与反应所产生的扩增条带的总和；Ｋ代表某因子在某水平参与反应所产生的扩增条带的平均值；Ｒ为某
因子的极差，即某因子在不同水平下最大平均值与最小平均值之差。Ｒ值的大小反映了该因子对试验结果影响
的大小，Ｒ值越大，影响越显著。从Ｒ值可看出，在选定的３个水平范围内，４个因素对结果的影响由大到小依次
为：引物＞ Ｍｇ２＋＞ ＴａｑＤＮＡ聚合酶＞ｄＮＴＰ。Ｋ值反映了影响因素各水平对反应体系的影响情况，Ｋ值越大，
反应水平越好。从Ｋ值结果来看，引物以水平３最好，Ｍｇ２＋以水平２最好，ＴａｑＤＮＡ聚合酶水平３最好，ｄＮＴＰ
以水平１最好。综上，各因素最佳的水平具体为引物２．０μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ
２＋２．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．５Ｕ、
ｄＮＴＰ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，该组合与直观分析得出的最佳组合７一致，进一步确定组合７为最优组合。
图１ 犛犚犃犘－犘犆犚正交试验设计结果
犉犻犵．１ 犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犛犚犃犘－犘犆犚狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀
１～９为处理代号，参见表１；Ｍ：ＤＮＡ分子量标准 ＤＬ２０００。１－９ｍｅａｎｔｒｅａｔｍｅｎｔＮｏ．ｓｈｏｗｎｉｎＴａｂｌｅ１；Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００．
２．２ 模板ＤＮＡ浓度的确定
应用上述最佳反应体系，对模板ＤＮＡ设置了１０，
２０，３０，４０，５０和６０ｎｇ６个浓度梯度进行优化。扩增
结果表明，在２５μＬ反应体系中６种模板ＤＮＡ用量
均能扩增出谱带，且带型一致。但模板ＤＮＡ浓度不
同，谱带的清晰度存在一定差异。模板ＤＮＡ用量为
１０和２０ｎｇ时条带清晰度不佳，３０～６０ｎｇ条带清晰
度稍强且表现一致。考虑到节省模板用量，最终选定
在２５μＬ反应体系中加３０ｎｇ模板ＤＮＡ为宜。
２．３ 反应体系的验证及多态性引物组合的筛选
应用上述最佳反应体系，随机组合了９８对ＳＲＡＰ
表３ 正交试验结果的统计分析
犜犪犫犾犲３ 犛狋犪狋犻狊狋犻犮狉犲狊狌犾狋狅犳狋犺犲狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀
序号
Ｎｏ．
ＴａｑＤＮＡ聚合酶
ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｄＮＴＰ 引物
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｍｇ２＋
Ｔ１ ６９ ４７ ５０ ６０
Ｔ２ ５６ ７２ ７２ ６１
Ｔ３ ５９ ６５ ６２ ６３
Ｋ１ ２３．００ １５．６７ １６．６７ ２０．００
Ｋ２ １８．６７ ２４．００ ２４．００ ２０．３３
Ｋ３ １９．６７ ２１．６７ ２０．６７ ２１．００
Ｒ ４．３３ ８．３３ ７．３３ １．００
７２３第２１卷第５期 草业学报２０１２年
图２ 优化的犛犚犃犘－犘犆犚反应体系在部分
引物组合中的扩增结果
犉犻犵．２ 犚犲狊狌犾狋狊犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔狅狆狋犻犿犻狕犲犱狊狔狊狋犲犿
狌狊犻狀犵狊狅犿犲狆狉犻犿犲狉犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊
Ｍ：ＤＮＡ分子量标准 ＤＬ２０００；１～３为引物组合 Ｍｅ３Ｅｍ１７；４～６为引
物组合 Ｍｅ１２Ｅｍ１９；７～９为引物组合 Ｍｅ１１Ｅｍ１９；１０～１２为引物组合
Ｍｅ１０Ｅｍ１６；每对引物的 ＤＮＡ模板依次为１１号、５号、９号 ＤＮＡ。Ｍ：
ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；１－３：ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｓＭｅ３Ｅｍ１７；４－６：
ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｓＭｅ１２Ｅｍ１９；７－９：ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｓＭｅ１１
Ｅｍ１９；１０－１２：ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｓＭｅ１０Ｅｍ１６；ＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｓａｒｅ
１１，５ａｎｄ９ｆｒｏｍｌｅｆｔｔｏｒｉｇｈｔｉｎｅａｃｈｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．
引物组合对３份山野豌豆种源进行了ＳＲＡＰ扩增
（图２）。结果表明，１）在筛选的９８对引物组合中，
９４对引物组合扩增得到清晰稳定的谱带，占总数的
９５．９％，表明该反应体系具有较好的稳定性；在有扩
增产物的９４对引物组合中有２０对引物组合扩增出
多态性条带，占总数２１．３％。２）９８对引物共扩增
出９８３条带，其中２０对具有多态性的引物组合扩增
出的条带总数为１６４条，占总条带数的１６．７％，具
有多态性的条带有３０条，平均每对引物组合扩增出
１．５条。３）不同引物组合检测到的多态性位点数
目存在差异，变异幅度为１～７。
３ 讨论与结论
３．１ 正交试验设计优化ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系
ＰＣＲ 扩增体系主要影响因素包括 Ｍｇ２＋、
ｄＮＴＰ、引物、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶以及模板ＤＮＡ。本
研究优化出的体系表明引物浓度对扩增结果影响最
大，这与黄春琼等［２８］、周良彬等［２９］的结果不一致，
这主要是因为本研究在引物梯度设计时加入了以前
文献中不常见到的高浓度———２．０μｍｏｌ／Ｌ，仅在昝
逢刚等［３０］对荔枝（犔犻狋犮犺犻犮犺犻狀犲狀狊犻狊）和许永华等［３１］
对人参（犘犪狀犪狓犵犻狀狊犲狀犵）的研究中分别出现过５
ｍｍｏｌ／Ｌ和２．０μｍｏｌ／Ｌ的高引物浓度。虽说文献
中常见引物浓度要以最低引物量产生所需要的结果
为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，但
本研究结果表明高浓度的引物浓度不但没有引起错
配反而得到更清晰的条带，从图１可看到７道与９
道均得到１ｋｂ处的条带，而９道的引物浓度仅为
０．２μｍｏｌ／Ｌ，这说明此带并非非特异性条带。此后
以６号与１４号为ＤＮＡ模板进行的重复试验，也证
实了２．０μｍｏｌ／Ｌ的引物浓度并无非特异性扩增条带，反而条带清晰这一论断。其次，影响较大的是 Ｍｇ
２＋浓度。
这与王芳［１８］、王俊娥［２１］、艾鹏飞等［３２］、仲丛来等［３３］在大豆、山羊豆、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）和麻疯树（犑犪狋狉狅
狆犺犪犮狌狉犮犪狊）上的试验结果一致，这说明在ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系中 Ｍｇ２＋浓度的影响是很大的，在以后的优化试
验中要重点关注。再次，影响因子较小的是ＴａｑＤＮＡ聚合酶用量和ｄＮＴＰ浓度，其中不同ｄＮＴＰ浓度的扩增效
果差异很小。在正交试验之后，本研究又对ＤＮＡ模板用量进行了单因素优化。虽然ＤＮＡ模板用量对扩增的影
响不大［３４，３５］，但本研究证实用量过少会明显影响条带的数量与清晰度，ＤＮＡ模板用量为１０～２０ｎｇ明显没有３０
～６０ｎｇ的条带清晰度高，所以本实验选择３０ｎｇ的ＤＮＡ模板用量，此结果与孙佩光等［３６］、陈庆榆等［３７］的研究
结果一致。
３．２ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应优化体系的验证
本研究不仅通过９８对引物对优化出的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系进行了验证，而且在优化过程中选用了３种来
自北京、山西、内蒙古不同地域的模板ＤＮＡ取得了二次验证，以此保证了优化体系的稳定性与良好的适用性。
与此同时，本研究亦筛选出２０对多态性良好的引物，对以后山野豌豆的分子生物学研究打下了良好的基础。
８２３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５
３．３ 结论
本研究利用正交试验设计对山野豌豆ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系进行优化，得到的最佳反应体系为：２μＬ１０×
ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（不含 Ｍｇ２＋）、３０ｎｇ的模板ＤＮＡ、引物２．０μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ
２＋２．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．５Ｕ、
ｄＮＴＰ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，总体积为２５μＬ。
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ＬＩＵＹｉｎｇ１，ＷＡＮＧＸｉａｎｇｏｕ２，ＺＨＡＮＧＪｕｍｉｎｇ１，ＬＩＵＦａｎｇ３
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅ
ｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００９３，Ｃｈｉｎａ；
３．ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｎｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅａＳＲＡＰ－ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ４ｆａｃｔｏｒｓ（Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰ，
ｐｒｉｍｅｒａｎｄＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ａｔ３ｌｅｖｅｌｓｐｌｕｓｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄＳＲＡＰ－ＰＣＲ
ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ犞犻犮犻犪犪犿狅犲狀犪ｗａｓ：２μＬ１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ
２＋ｆｒｅｅ），３０ｎｇｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ，Ｍｇ２＋２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，
ｄＮＴＰ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐｒｉｍｅｒ２．０μｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．５Ｕｉｎａｔｏｔａｌｏｆ２５μＬｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ．
ＥａｃｈｆａｃｔｏｒｈａｄａｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲ．ＰｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｈａｄｔｈｅｇｒｅａｔｅｓｔｅｆｆｅｃｔａｎｄｄＮＴＰ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｈａｄｔｈｅｌｅａｓｔｅｆｆｅｃｔ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄＳＲＡＰ－ＰＣＲｓｙｓｔｅｍｗａｓｔｅｓｔｅｄｏｎｔｈｒｅｅ犞．犪犿狅犲狀犪ｇｅｒｍ
ｐｌａｓｍａｎｄｗａｓｓｈｏｗｎｔｏｂｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅ．Ｔｗｅｎｔｙｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｗｉｔｈａｂｕｎｄａｎｔｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｓｍｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ９８ｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄＳＲＡＰ－ＰＣＲｓｙｓｔｅｍａｎｄｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｓｍｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｐｒｏｖｉｄｅａｂａｓｉｓｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｅａｒｃｈｏｎ犞．犪犿狅犲狀犪．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犞犻犮犻犪犪犿狅犲狀犪；ＳＲＡＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｙｓｔｅｍ；ｏｒｔｈｏｇ
ｏｎａｌｄｅｓｉｇｎ；ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒｓ
０３３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５