全 文 ：书不同产地白三叶种质遗传多样性的犛犚犃犘分析
张婧源，彭燕，罗燕，马啸
（四川农业大学草业科学系，四川 雅安６２５０１４）
摘要：采用ＳＲＡＰ分子标记技术，对不同产地的４１份白三叶材料进行遗传多样性分析，筛选出２０对随机引物组
合，获得以下结果：１）２０对随机引物组合共扩增出４７９条清晰可辨的条带，每对引物组合ＰＣＲ扩增出１３～４４条带
纹，平均为２３．９５条，多态性条带４１１条，多态性位点百分率（ＰＰＢ）占８５．１６％，多态性信息含量（ＰＩＣ）范围为０．１８２
～０．３３４，平均为０．２６８，表明供试白三叶种质具有丰富的遗传多样性；２）材料间遗传相似系数（ＧＳ）范围为０．５８６６
～０．９８９６，平均ＧＳ值为０．７３０７；表明供试白三叶种质在分子水平具有相对较远的亲缘关系；３）对所有材料进行
聚类分析和主成分分析发现，在犌犛＝０．７１的水平上，可将４１份白三叶材料分成３大类，大部分来自相同或相似生
态地理环境的材料能聚为一类，呈现出一定的生态地理环境分布规律。
关键词：白三叶；ＳＲＡＰ；遗传多样性
中图分类号：Ｑ９４３；Ｓ５４１＋．２０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１０）０５０１３００９
相关序列扩增多态性（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）是一种新型的基于聚合酶链式反应
的标记系统，也称基于序列扩增多态性（ｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＢＡＰ）。是利用独特的引物设
计对ＯＲＦｓ（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ，开放阅读框架）进行扩增。由于ＳＲＡＰ技术简便、快速，不需预知物种的序列信
息，故而近年来在植物遗传多样性分析［１］、种质鉴定［２］、遗传连锁图的构建［３］、基因连锁标记的寻找与基因定位［４］
和比较基因组学研究［５］等方面得到广泛应用。目前在芸苔属（犅狉犪狊狊犻犮犪）［４］、南瓜属（犆狌犮狌狉犫犻狋犪）［６］、芍药属（犘犪犲狅
狀犻犪）［７］以及柿子（犇犻狅狊狆狔狉狅狊犽犪犽犻）等植物［８］已经展开ＳＲＡＰ标记的研究工作，并已取得了一定的成果。在草业上
ＳＲＡＰ也已有了较多的应用，如野牛草（犅狌犮犺犾狅犱犪犮狋狔犾狅犻犱犲狊）［９］、垂穗披碱草（犈犾狔犿狌狊狀狌狋犪狀狊）［１０］和结缕草（犣狅狔
狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪）［１１，１２］等草种，但就豆科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）植物而言，仅见于紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）［１３］、花生（犃狉犪
犮犺犻狊犺狔狆狅犵犪犲犪）［１４］等少数植物。
白三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）别名白车轴草、荷兰翘摇，为豆科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ），三叶草属（犜狉犻犳狅犾犻狌犿），全属在
世界约有２５０余种，原产于欧洲、北非和亚洲西部，在温带及亚热带地区均有分布。为世界上分布最广的豆科牧
草之一［１５］。由于白三叶茎叶细软，叶量多，营养丰富，尤富含蛋白质，适口性好，刈牧兼用，耐践踏，再生性好等特
点使其种植已遍布我国各地，尤其在长江以南地区大面积栽培，在长江中下游平原的鄂、湘、江、浙、皖等省，以及
低山丘陵区的云、贵、川、广等省均有种植，是我国南方的当家豆科牧草［１６］。国内外学者已通过形态标记、细胞学
标记和同工酶生化标记等，对白三叶种质的遗传结构与生态型遗传分化及种质间遗传多样性进行研究［１７１９］。由
于分子标记技术简单、快捷、受环境影响小和可重复性强等优点，目前已被广泛应用在牧草遗传研究中，因此对白
三叶种质资源的遗传多样性方面的研究也逐步深入到了分子水平。在国外，对白三叶的分子水平上的研究相对
更多，Ｓｈａｒｍａｓ等［２０］利用形态学和ＲＡＰＤ分子标记（随机扩增多态性ＤＮＡ标记）对外来引进白三叶品种遗传多
样性进行了分析，Ｇｕｓｔｉｎｅ和Ｈｕｆｆ［２１］利用ＲＡＰＤ标记分析了美国东北部３个州人工管理的多年生牧场中白三叶
种群内和种群间的遗传变异，Ｊｏｙｃｅ等［２２］利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ分子标记（基于聚合酶链式反应的随机扩增多态性
ＤＮＡ标记）对近缘杂交的白三叶的遗传多样性进行了分析，Ｇｅｏｒｇｅ等［２３］利用ＳＳＲ标记（串联重复序列ＤＮＡ标
记）检测了不同产地白三叶品种的遗传多样性，Ｋ?ｌｉｋｅｒ等［２４］对白三叶进行了ＡＦＬＰ分子标记（扩增片段长度多
态性ＤＮＡ标记），Ｂａｒｒｅｔｔ等［５］更首次利用ＥＳＴ－ＳＳＲｓ（基于表达序列标签的串联重复序列ＤＮＡ标记）制作了白
１３０－１３８
２０１０年１０月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１９卷 第５期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５
收稿日期：２００９１１２２；改回日期：２００９１２３０
基金项目：国家科技支撑计划（２００８ＢＡＤＢ３Ｂ１０）和四川农业大学青年创新基金（００２３２５）资助。
作者简介：张婧源（１９８５），女，四川成都人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｍｅｎｇｔｉｎｇ＿２００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｐｅｎｇｙａｎｌｅｅ＠１６３．ｃｏｍ
三叶的完整基因连锁图；而国内对于白三叶在ＤＮＡ分子遗传多样性方面的研究报告相对较少，随着白三叶在我
国草地畜牧业、农业经济结构调整和生态环境建设等方面占有越来越重要的地位和作用，急切的需要开展更进一
步的分子水平的白三叶种质资源遗传特性的基础研究。
本试验利用ＳＲＡＰ标记技术对来自５大洲的４１份白三叶种质进行遗传多样性研究，目的在于：１）检测白三
叶种质资源遗传多样性水平与地理来源的关系；２）分析白三叶种质资源的遗传多样性，为优良白三叶种质资源
筛选提供依据；３）揭示白三叶种质资源的遗传结构及亲缘关系，为白三叶种质资源的保护、栽培利用以及核心种
质的构建提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 供试材料
供试的４１份白三叶种质材料均来源于美国国家遗传资源库（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ），其
中源自非洲的材料有８份、亚洲７份、大洋洲５份、欧洲１３份、美洲６份、亚欧交界２份（表１）。每份材料取５０粒
种子，置于有盖培养皿内的吸水滤纸上萌发。萌发后的种子移栽至四川省眉山市洪雅县国家种质资源圃（东经
１０２°４９′～１０３°３２′，北纬２９°２４′～３０°００′，海拔２８００ｍ）种植。
１．２ 白三叶基因组ＤＮＡ提取
本试验于２００９年７月进行。每份材料采用ＳａｇｈａｉＭａｒｏｏｆ等［２５］的ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化铵）方法随
机选取１０～１５个生长良好的单株的幼嫩叶片等量混合提取ＤＮＡ。对比已知浓度的标准λＤＮＡ与样本ＤＮＡ在
０．８％（ｗ／ｖ）琼脂糖凝胶上的电泳图谱，计算出白三叶各种质材料的ＤＮＡ浓度。将所有样本的基因组ＤＮＡ用
０．１×ＴＥ缓冲液［１ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，０．１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（乙二胺四乙酸），ｐＨ８．０］稀释至１０ｎｇ／μＬ，储存于
－８０℃冰箱内，供ＳＲＡＰ扩增使用。
１．３ ＳＲＡＰ反应体系的建立及优化
参照前人发表的ＳＲＡＰ反应体系［２６２８］，利用单因素梯度组合试验的方法，得到优化后２０μＬＳＲＡＰ反应体
系：模板ＤＮＡ２μＬ（１０ｎｇ／μＬ），１０×ＰＣＲＢｕｆｅｒ２μＬ，Ｍｇ
２＋２μＬ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ），ｄＮＴＰ１．４μＬ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），
ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．４μＬ（２．５Ｕ／μＬ），上、下游引物均为１μＬ（１０μｍｏｌ／μＬ），灭菌水补足２０μＬ。
１．４ 引物筛选和ＰＣＲ反应
参照前人发表的引物［２９３３］，由９个上游引物和１２个下游引物组合成１０８对ＳＲＡＰ引物序列，交由上海生物
工程技术服务有限公司合成，选取４个ＤＮＡ质量较高且田间试验性状差异较大的材料ＰＩ２８２３７９，ＰＩ４０４９３０，
ＰＩ２９１８４１，ＰＩ４４０７４５对１０８对引物进行筛选，最终选出２０对条带清晰、稳定性高、多态性好的引物用于全部材料
进行ＰＣＲ扩增，引物序列见表２。
ＰＣＲ扩增程序参见Ｌｉ和Ｑｕｉｒｏｓ［４］的方法，采用以下程序：循环包括９４℃变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，３５℃复
性１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共５个循环；之后３５个循环：９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，最后
７２℃延伸１０ｍｉｎ；４℃保存。
１．５ 电泳检测
扩增产物在６％聚丙烯酰胺凝胶上（丙烯酰胺∶甲叉＝１９∶１，７ｍｏｌ／Ｌ尿素，１×ＴＢＥ缓冲液）进行电泳检
测。样孔中每样品点样１０μＬ，以博瑞克公司的Ｄ２０００ＤＮＡ 梯度 Ｍａｒｋｅｒ为对照，先在北京六一电泳仪厂的
ＤＹＹ６Ｃ电泳仪上进行２００Ｖ恒定电压下３０ｍｉｎ的预电泳，然后在４００Ｖ恒定电压下电泳９０～１００ｍｉｎ，停止电
泳后再用０．１％的ＡｇＮＯ３ 进行银染色并在ＮａＯＨ 液中显色［２９］，凝胶在灯光下用高分辨率数码相机照相保存以
供分析。
１．６ 数据处理
对获得的清晰可重复的ＤＮＡ条带进行统计，在相同迁移位置上，将稳定出现的有条带的记为１，无带的记为
０，依次构成遗传相似矩阵。
据表征矩阵，统计ＳＲＡＰ扩增产物的条带总数和多态性条带数量，计算多态性位点百分率（ＰＰＢ，ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ）、引物多态性信息含量（ＰＩＣ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃｏｎｔｅｎｔ）和Ｄｉｃｅ遗传相似系数（ＧＳ）
１３１第１９卷第５期 草业学报２０１０年
表１ 供试材料及来源
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲狋犲狊狋犿犪狋犲狉犻犪犾狊犪狀犱狊狅狌狉犮犲狊狅犳犜．狉犲狆犲狀狊
序号
Ｎｏ．
材料编号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｃｏｄｅ
地理来源
Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｏｒｉｇｉｎ
地理类群
Ｇｅｏｇｒａｐｌｙｔａｘａ
序号
Ｎｏ．
材料编号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｃｏｄｅ
地理来源
Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｏｒｉｇｉｎ
地理类群
Ｇｅｏｇｒａｐｌｙｔａｘａ
１ ＰＩ２８２３７９ 非洲南部ＳｏｕｔｈＡｆｒｉｃａ 非洲Ａｆｒｉｃａ ２２ ＰＩ２０８５６７ 意大利Ｉｔａｌｙ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
２ ＰＩ３００１５５ 非洲南部ＳｏｕｔｈＡｆｒｉｃａ 非洲Ａｆｒｉｃａ ２３ ＰＩ２８２３７７ 意大利Ｉｔａｌｙ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
３ ＰＩ３００１５６ 非洲南部ＳｏｕｔｈＡｆｒｉｃａ 非洲Ａｆｒｉｃａ ２４ ＰＩ２３７７３４ 德国Ｇｅｒｍａｎｙ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
４ ＰＩ２２６１０２ 肯尼亚Ｋｅｎｙａ 非洲Ａｆｒｉｃａ ２５ ＰＩ２３２１１２ 德国Ｇｅｒｍａｎｙ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
５ ＰＩ５１６４０８ 肯尼亚Ｋｅｎｙａ 非洲Ａｆｒｉｃａ ２６ ＰＩ２９４５４４ 法国Ｆｒａｎｃｅ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
６ ＰＩ２７８１７１ 尼日利亚Ｎｉｇｅｒｉａ 非洲Ａｆｒｉｃａ ２７ ＰＩ２８８０８４ 爱尔兰Ｉｒｅｌａｎｄ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
７ ＰＩ５１７５１５ 埃塞俄比亚Ｅｔｈｉｏｐｉａ 非洲Ａｆｒｉｃａ ２８ ＰＩ２８８０８５ 爱尔兰Ｉｒｅｌａｎｄ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
８ ＰＩ３２２６９９ 喀麦隆Ｃａｍｅｒｏｏｎ 非洲Ａｆｒｉｃａ ２９ ＰＩ２４９８７３ 希腊Ｇｒｅｅｃｅ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
９ ＰＩ２２１９６２ 阿富汗Ａｆｇｈａｎｉｓｔａｎ 亚洲Ａｓｉａ ３０ ＰＩ２２１５２４ 瑞典Ｓｗｅｄｅｎ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
１０ ＰＩ２２３２９７ 阿富汗Ａｆｇｈａｎｉｓｔａｎ 亚洲Ａｓｉａ ３１ ＰＩ２３４４８９ 西班牙Ｓｐａｉｎ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
１１ ＰＩ４２００１４ 日本Ｊａｐａｎ 亚洲Ａｓｉａ ３２ ＰＩ５１６４１０ 罗马利亚Ｒｏｍａｎｉａ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
１２ ＰＩ４２００１０ 日本Ｊａｐａｎ 亚洲Ａｓｉａ ３３ ＰＩ２３７２９２ 丹麦Ｄｅｎｍａｒｋ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ
１３ ＰＩ２２７８７４ 伊朗Ｉｒａｎ 亚洲Ａｓｉａ ３４ ＰＩ４０４９３０ 乌拉圭Ｕｒｕｇｕａｙ 美洲Ａｍｅｒｉｃａ
１４ ＰＩ２３９９８３ 伊朗Ｉｒａｎ 亚洲Ａｓｉａ ３５ ＮＳＬ５４５９ 美国ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ 美洲Ａｍｅｒｉｃａ
１５ ＰＩ２６９９８１ 巴基斯坦Ｐａｋｉｓｔａｎ 亚洲Ａｓｉａ ３６ Ｇ１５２４２ 美国ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ 美洲Ａｍｅｒｉｃａ
１６ ＰＩ５１７５０８ 新西兰ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ 大洋洲Ｏｃｅａｎｉａ ３７ ＰＩ３０６２８６ 阿根廷Ａｒｇｅｎｔｉｎａ 美洲Ａｍｅｒｉｃａ
１７ ＰＩ１９０１２５ 新西兰ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ 大洋洲Ｏｃｅａｎｉａ ３８ ＰＩ２９１８２６ 智利Ｃｈｉｌｅ 美洲Ａｍｅｒｉｃａ
１８ ＰＩ２９１８４４ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ 大洋洲Ｏｃｅａｎｉａ ３９ ＰＩ３０８５４９ 哥伦比亚Ｃｏｌｏｍｂｉａ 美洲Ａｍｅｒｉｃａ
１９ ＰＩ２９１８４１ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ 大洋洲Ｏｃｅａｎｉａ ４０ ＰＩ２０９９８６ 土耳其Ｔｕｒｋｅｙ 亚欧交界Ｂｏｒｄｅｒｏｎ
２０ ＰＩ２９１８４９ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ 大洋洲Ｏｃｅａｎｉａ ＡｓｉａａｎｄＥｕｒｏｐｅ
２１ ＰＩ３１５５４３ 乌克兰Ｕｋｒａｉｎｅ 欧洲Ｅｕｒｏｐｅ ４１ ＰＩ４４０７４５ 俄罗斯联邦 亚欧交界Ｂｏｒｄｅｒｏｎ
ＲｕｓｓｉａｎＦｅｄｅｒａｔｉｏ ＡｓｉａａｎｄＥｕｒｏｐｅ
表２ 用于白三叶犛犚犃犘分析的引物序列
犜犪犫犾犲２ 犘狉犻犿犲狉犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犻狀犛犚犃犘犪狀犪犾狔狊犲狊狅犳犜．狉犲狆犲狀狊
编号Ｃｏｄｅ 上游引物Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓ 编号Ｃｏｄｅ 下游引物Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓ
ｍｅ１ ５ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ３′ ｅｍ１ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴ３′
ｍｅ２ ５ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ３′ ｅｍ２ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣ３′
ｍｅ３ ５ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴ３′ ｅｍ３ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ３′
ｍｅ４ ５ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ３′ ｅｍ４ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ３′
ｍｅ５ ５ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧ３′ ｅｍ５ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ３′
ｍｅ６ ５ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＯＧＧＴＡＡ３′ ｅｍ６ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ３′
ｍｅ７ ５ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＣＣ３′ ｅｍ７ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ３′
ｍｅ８ ５ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ３′ ｅｍ８ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ３′
ｍｅ９ ５ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＣＡ３′ ｅｍ９ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡ３′
ｅｍ１０ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＧ３′
ｅｍ１１ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡ３′
ｅｍ１２ ５ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＴＴ３′
２３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５
来估计各种质间的遗传多样性［３０，３４，３５］。各遗传参数按以下公式计算：犘犘犅＝犖犘犅／犜犖犅，式中，ＴＮＢ指总扩增的
ＳＲＡＰ条带数（ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｎｄｓ），ＮＰＢ指多态性条带数（ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ）；犘犐犆犻＝２犳犻（１－
犳犻），式中，犘犐犆犻表示引物“犻”的多态性信息含量，“犳犻”表示有带所占的频率，“１－犳犻”表示无带所占的频率，对每个
引物组合而言，计算犘犐犆应该求平均值，即犘犐犆犪狏＝∑犘犐犆犻／犖，这里犖 是各引物组合的多态性带数（ＮＰＢ）［３１］；
标记指数（ＭＩ，ｍａｒｋｅｒｉｎｄｅｘ）犕犐＝犖犘犅×犘犐犆［２３］。在 ＨａｒｄｙＷｅｉｎｂｅｒｇ平衡的基础上，计算各种质材料Ｎｅｉ基
因多样性指数［３３］，利用ＮＴＳＹＳＰＣ２．１０软件计算Ｄｉｃｅ遗传相似性系数（ＧＳ），根据 ＵＰＧＭＡ法［３６］进行聚类分
系和主成分分析（ＰＣｏＡ）。
以上参数计算分别在ＰＯＰＧＥＮＥ１．３１、ＤＣＦＡ１．１中进行。
２ 结果与分析
２．１ 供试白三叶ＳＲＡＰ扩增产物的多态性分析
从１０８对引物组合中筛选出２０对条带清晰、多态
性好的引物组合（表３）对４１份白三叶基因组ＤＮＡ进
行ＰＣＲ扩增，共得到４７９条清晰可辨的条带，平均每
对引物组合扩增出２３．９５条带，ｍｅ５＋ｅｍ９引物组合
扩增出最多的４４条带，而ｍｅ４＋ｅｍ６组合扩增出的条
带最少，仅有１３条；多态性条带总数４１１条，平均每对
引物扩增２０．５５条，引物的平均多态性位点百分率
（ＰＰＢ）为８５．１６％，不同的ＳＲＡＰ引物组合所揭示的
参试材料的多态性信息含量（ＰＩＣ）范围为０．１８２～
０．３３４，平均为０．２６８；不同的ＳＲＡＰ引物组合的标记
指数（ＭＩ）为２．１８５～１１．０６８，平均为５．６９７。结果表
明ＳＲＡＰ分子标记能检测出较多的白三叶遗传位点，
获得多态性相对较好的ＰＣＲ结果。
２．２ 不同产地白三叶种质亲缘关系分析
对扩增结果用ＮｅｉＬｉ相似系数（ＧＳ）和遗传距离
（ＧＤ）的计算方法，得到供试材料相似性矩阵。４１份
白三叶材料的ＧＳ值为０．５８６６～０．９８９６，ＧＳ平均值
为０．７３０７，变幅为０．４０３，其遗传距离ＧＤ（１－犌犛）为
０．０１０４０～０．４１３４０，平均为０．２６９４。其中，来自非
洲肯尼亚的ＰＩ５１６４０８与来自欧洲法国的ＰＩ２９４５４４之
间的遗传距离最大，为０．４１３４，表明它们之间的亲缘
关系较远。而来自非洲南部的２份种质ＰＩ３００１５５和
ＰＩ３００１５６之间的遗传距离最小，仅为０．０１０４，表明这
２份材料之间具有很近的亲缘关系。分析结果表明，
供试材料之间差异明显，具有相对较远的亲缘关系。
表３ 白三叶犛犚犃犘分析的引物组合以及其序列扩增结果
犜犪犫犾犲３ 犘狉犻犿犲狉犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊
狌狊犲犱犻狀犛犚犃犘犪狀犪犾狔狊犲狊狅犳犜．狉犲狆犲狀狊
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
扩增总
条带数
ＴＮＢ
多态性
条带
ＮＰＢ
多态性
比率
ＰＰＢ（％）
多态性信
息含量
ＰＩＣ
标记
指数
ＭＩ
ｍｅ１＋ｅｍ１ ２８ ２７ ９６．４３ ０．３２８ ８．８５９
ｍｅ１＋ｅｍ３ ２１ １８ ８５．７１ ０．２３２ ４．１８１
ｍｅ１＋ｅｍ６ ３１ ２５ ８０．６５ ０．２８６ ７．１３９
ｍｅ２＋ｅｍ６ １８ １４ ７７．７８ ０．２７８ ３．８９０
ｍｅ２＋ｅｍ７ ２１ ２０ ９５．２４ ０．２６３ ５．２６９
ｍｅ２＋ｅｍ９ １３ １２ ９２．３１ ０．２１０ ２．５２２
ｍｅ２＋ｅｍ１２ ２２ １９ ８６．３６ ０．２４６ ４．６７７
ｍｅ３＋ｅｍ８ ３０ ２８ ９３．３３ ０．２６５ ７．４２２
ｍｅ４＋ｅｍ１ ３０ ２９ ９６．６７ ０．３３４ ９．６９１
ｍｅ４＋ｅｍ２ ２１ １６ ７６．１９ ０．２９６ ４．７３４
ｍｅ４＋ｅｍ３ ２７ ２０ ７４．０７ ０．２４７ ４．９３５
ｍｅ４＋ｅｍ６ １４ １１ ７８．５７ ０．２３５ ２．５８８
ｍｅ４＋ｅｍ７ ２２ ２１ ９５．４５ ０．２９３ ６．１６２
ｍｅ４＋ｅｍ１１ １７ １２ ７０．５９ ０．１８２ ２．１８５
ｍｅ５＋ｅｍ４ ３０ ２９ ９６．６７ ０．３２７ ９．４８４
ｍｅ５＋ｅｍ７ ２９ ２５ ８６．２１ ０．２８３ ７．０７３
ｍｅ５＋ｅｍ９ ４４ ３６ ８１．８２ ０．３０７ １１．０６８
ｍｅ６＋ｅｍ７ １７ １４ ８２．３５ ０．２８２ ３．９５１
ｍｅ７＋ｅｍ８ ２６ ２２ ８４．６２ ０．２７１ ５．６９９
ｍｅ８＋ｅｍ３ １８ １３ ７２．２２ ０．１８５ ２．４０９
平均值Ａｖｅｒａｇｅ ２３．９５ ２０．５５ ８５．１６ ０．２６８ ５．６９７
总数Ｔｏｔａｌ ４７９ ４１１ ８５．８０
２．３ 不同产地白三叶种质的聚类分析
基于（ＮｅｉＬｉ）遗传相似系数，利用ＵＰＧＭＡ法（非加权组平均法）构建了４１份白三叶材料间的遗传关系聚类
图（图１）。在遗传相似系数为０．７１的水平上，可将供试白三叶种质分为３大类。其中，非洲、亚洲和大洋洲的２０
份材料聚为第Ⅰ类，该类大部分种质的形态及农艺性状表现为前期生长速度快、分蘖能力强、花期迟、完成生育期
所需时间较短，植株相对高大，生态适应能力较强。该大类中源于非洲的８份材料，ＰＩ２８２３７９、ＰＩ３００１５５、
ＰＩ３００１５６、ＰＩ２２６１０２、ＰＩ５１６４０８、ＰＩ２７８１７１、ＰＩ５１７５１５、ＰＩ３２２６９９优先聚为 Ａ亚类，然后源于大洋洲的５份材料，
ＰＩ５１７５０８、ＰＩ１９０１２５、ＰＩ２９１８４４、ＰＩ２９１８４１、ＰＩ２９１８４９聚为Ｂ亚类，源于亚洲的７份材料，ＰＩ４２００１４和ＰＩ４２００１０，
３３１第１９卷第５期 草业学报２０１０年
ＰＩ２２７８７４和ＰＩ２３９９８３以及ＰＩ２２１９６２、ＰＩ２２３２９７和ＰＩ２６９９８１分属于Ｃ、Ｄ、Ｅ亚类。来自欧洲和美洲的１９份材
料，ＰＩ２３７７３４、ＰＩ２３２１１２、ＰＩ２９４５４４、ＰＩ２８８０８４、ＰＩ２８８０８５、ＰＩ２４９８７３、ＰＩ２２１５２４、ＰＩ２３４４８９、ＰＩ５１６４１０、ＰＩ２３７２９２、
ＰＩ３１５５４３、ＰＩ２０８５６７、ＰＩ２８２３７７、ＰＩ４０４９３０、ＮＳＬ５４５９、Ｇ１５２４２、ＰＩ３０６２８６、ＰＩ２９１８２６和ＰＩ３０８５４９聚为第Ⅱ类，该类
主要特征表现为花期较早，植株低矮，叶片极小。而来自亚欧交界处的２份材料，ＰＩ２０９９８６和ＰＩ４４０７４５单独成
为第Ⅲ类。这样的聚类结果揭示了供试材料的聚类与其形态特征、最初的地理来源以及地理分布存在一定相关
性。
图１ ４１份白三叶种质基于犖犲犻犔犻相似系数的犝犘犌犕犃聚类图
犉犻犵．１ 犝犘犌犕犃犱犲狀犱狉狅犵狉犪犿犳狅狉犜．狉犲狆犲狀狊犫犪狊犲犱狅狀犖犲犻犔犻’狊犵犲狀犲狋犻犮狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狊
２．４ 供试材料的主成分分析
对４１份白三叶材料的ＳＲＡＰ标记的原始矩阵进行主成分分析，前２个主成分所能解释的遗传变异分别为
１５．８３％和８．１６％，对４１份种质做前２个主成分的三维排序图，位置靠近者表示关系密切，远离者表示关系疏
远，将位置靠近的白三叶材料归为一类，可将供试材料分成３类，所形成的白三叶材料的位置分布图（图２）所示，
主成分分析结果与聚类结果基本一致，同一地区的大部分白三叶材料基本能聚在一起，主成分分析的结果更直观
地表明了不同白三叶材料之间的亲缘关系，是对聚类分析结果的直观解释和佐证。
３ 讨论
３．１ ＳＲＡＰ分子标记对白三叶遗传多样性研究的有效性
本研究利用ＳＲＡＰ标记对４１份白三叶种质进行遗传多样性的分析，结果表明，白三叶ＳＲＡＰ标记表现出较
高的多态性，高于ＲＡＰＤ分子标记对三叶草属其他物种的研究，例如Ｋｏｎｇｋｉａｔｎｇａｍ等［３７］对不同地区红三叶栽
４３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５
图２ ４１份白三叶种质基于犖犲犻犔犻相似系数的主成分分析
犉犻犵．２ 犜犺犲狆狉犻狀犮犻狆犪犾犮狅狅狉犱犻狀犪狋犲犪狀犪犾狔狊犻狊（犘犮狅犃）狅犳４１犜．狉犲狆犲狀狊犫犪狊犲犱
狅狀犖犲犻犔犻’狊犵犲狀犲狋犻犮狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狊
培品种的ＲＡＰＤ分析研究中所选样本的ＰＰＢ为６９．６％，Ｕｌｏａ等［３８］对红三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲）的ＲＡＰＤ研
究所得的ＰＰＢ为７４．２％，同时也高于同科植物紫花苜蓿的ＳＲＡＰ分析结果（ＰＰＢ为８３．８８％）［３９］，这些差异可能
是由于材料和研究方法的不同造成的。由此说明ＳＲＡＰ技术对白三叶的扩增具有较高的效率，适合对大规模白
三叶种质的遗传变异检测，可作为白三叶新品种选育的早期选择及分子标记辅助育种的有力工具。
３．２ 白三叶种质遗传变异与地理来源的相关性分析
遗传变异和地理环境之间的关系一直是植物遗传学研究中普遍关注的问题。本试验通过对４１份来自世界
各地不同大洲的白三叶材料的ＳＲＡＰ统计分析和聚类分析，证明供试白三叶种质呈现出一定地理来源分布规律
和地域分布性规律，这也与 Ｗｉｌｓｏｎ等［４０］的研究所得，种质的地理分布与分子标记间存在相关性的结论相符合。
通过研究发现白三叶材料间存在着较高的遗传分化，而聚类分析把４１份材料分为３大类，也揭示了３个与地理
起源密切相关的遗传多样性资源群。从供试材料的聚类图可以看出，相似的生态环境或地理来源的白三叶种质
能聚为一类，主要表现在来自美洲和欧洲的全部材料聚为第ＩＩ类，这种聚类分析的结果可能与白三叶起源于欧
洲，并由欧洲传入美洲有关，由于大陆间地形的相互阻隔造成了基因漂移的阻隔，加上相同起源地白三叶材料原
有基因突变在物种进化过程中适应了各地域间海拔高度、土壤类型、气候特征和降水等方面存在的差异，从而使
其固有的个别变异基因得以保存并延续下来，最终使不同来源地的白三叶材料间呈现出按起源地分布的规律，这
一研究结果与谢国禄［４１］的研究相一致。
与此同时第Ｉ类在ＧＳ为０．７５时，来自非洲的全部材料和来自大洋洲的全部材料又分别聚为Ａ、Ｂ２个亚
类，这说明白三叶种质资源呈现一定的地域分布规律，而造成这一结果可能是在白三叶材料的长期进化过程中由
于所处生长环境的不同，地理类型、土壤酸碱度、年积温和年降水量、日照时数等生态环境因子的明显差异对白三
５３１第１９卷第５期 草业学报２０１０年
叶生长期的自然选择造成一定影响，加上自然突变、人为选择等其他因素，使各方面都存在了一定的变异度，使得
个体中发生的不定向变异导致群体遗传结果的定向变异，最终使同一地区材料的基因型趋近于相似。
另外部分聚类也非完全符合地理起源和地域性的分布规律，如来自亚洲的所有材料在ＧＳ为０．７５时就分别
聚成了Ｃ、Ｄ、Ｅ３个亚类，造成这种聚类划分的现象可能有以下方面的原因：１）白三叶是异花授粉植物，花粉间的
窜粉可能导致天然杂交现象的出现；２）本研究的材料来源于生境差别较大，其光照、降水、年均温等气候条件以
及土壤、海拔、经纬度、洋流等生境条件存在差异，因此可能阻碍种质间的基因漂移，从而造成了较明显的遗传差
异，这也符合聚类结果与生境表现出一定的相关性［４２］的研究结论；３）由于自然选择所造成的选择压力也可能导
致生境相距存在差异的种质产生遗传变异，加上人类活动以及利用方式的不同都可能导致其个别基因发生变
异［４３］，从而形成遗传的多样性，这也符合聚类的结果反映出自然和人工选择的深刻影响［１４］的研究结论。
这一研究结果为今后制定世界范围内白三叶资源遗传多样性原位保护措施、保护范围以及白三叶品种改良
中亲本选择、发掘新的抗逆基因提供了重要参考。针对白三叶所潜藏的巨大的可选择利用的优异性状，应充分发
掘其原生种质的遗传潜力，培育出更多适应性更强，农艺性状更优良的品种。
参考文献：
［１］ 姜树坤，马慧，刘君，等．利用ＳＲＡＰ标记分析玉米遗传多样性［Ｊ］．分子植物育种，２００７，５（３）：４１２４１６．
［２］ 张建成，王传堂，焦坤，等．ＳＲＡＰ标记技术在花生种子纯度鉴定中的应用［Ｊ］．中国农学通报，２００５，２１（１２）：３５３９．
［３］ 赵丽萍，柳李旺，龚义勤，等．萝卜品种指纹图谱ＳＲＡＰ与ＡＦＬＰ分析［Ｊ］．植物研究，２００７，２７（６）：６８７６８４．
［４］ ＬｉＧ，ＱｕｉｒｏｓＣＦ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ），ａｎｅｗｍａｒｋｅｒｓｙｓｔｅｍｂａｓｅｄｏｎａｓｉｍｐｌｅＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎ：
ＩｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｍａｐｐｉｎｇａｎｄｇｅｎｅｔａｇｇｉｎｇｉｎＢｒａｓｓｉｃａ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３：４５５４６１．
［５］ ＢａｒｒｅｔｔＢ，ＧｒｉｆｆｉｔｈｓＡ，ＳｃｈｒｅｉｂｅｒＭ，犲狋犪犾．Ａｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｍａｐｏｆｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，
１０９（３）：５９６６０８．
［６］ ＦｅｒｒｉｏｌＭ，ＰｉｃｏＢ，ＮｕｚｅＦ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆａｇｅｒｍｐｌａｓｍｃｏｌｅｃｔｉｏｎｏｆ犆狌犮狌狉犫犻狋犪狆犲狆狅ｕｓｉｎｇＳＲＡＰａｎｄＡＦＬＰｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．
ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１０７：２７１２８２．
［７］ ＨａｎＸＹ，ＷａｎｇＬＳ，ＳｈｕＱＹ，犲狋犪犾．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｒｅｅｐｅｏｎｙｇｅｒｍｐｌａｓｍｕｓｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，４６：１６２１７９．
［８］ ＧｕｏＤＬ，ＬｕｏＺＲ．ＧｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆｓｏｍｅＰＣＮＡｐｅｒｓｉｍｍｏｎｓ（犇犻狅狊狆狔狉狅狊犽犪犽犻Ｔｈｕｎｂ．）ｆｒｏｍＣｈｉｎａａｎｄＪａｐａｎｒｅｖｅａｌｅｄ
ｂｙＳＲＡＰａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＣｒｏｐＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００６，５３：１５９７１６０３．
［９］ ＢｕｄａｋＨ，ＳｈｅａｒｍａｎＲＣ，ＰａｒｍａｋｓｉｚＩ，犲狋犪犾．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｕｆｆａｌｏｇｒａｓｓｇｅｒｍｐｌａｓｍｕｓｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍ
ｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１０８：３２８３３４．
［１０］ 陈智华，苗佳敏，钟金城．野生垂穗披碱草种质遗传多样性的ＳＲＡＰ研究［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（５）：１９２２００．
［１１］ 陈宣，郭海林，薛丹丹．结缕草属植物耐盐性ＳＲＡＰ分子标记研究［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（２）：６６７５．
［１２］ 郭海林，郑轶琦，陈宣．结缕草属植物种间关系和遗传多样性的ＳＲＡＰ标记分析［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（５）：２０１２１０．
［１３］ ＶａｎｄｅｍａｒｋＧＪ，ＡｒｉｓｓＪＪ，ＢａｕｃｈａｎＧＡ，犲狋犪犾．Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｍｏｎｇｈｉｓｔｏｒｉｃａｌｓｏｕｒｃｅｓｏｆａｌｆａｌｆａｇｅｒｍ
ｐｌａｓｍａｎｄｓｅｌｅｃｔｅｄｃｕｌｔｉｖａｒｓｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００６，１５２：９１６．
［１４］ 张建成，王传堂，焦坤，等．ＳＲＡＰ标记技术在花生种子纯度鉴定中的应用［Ｊ］．中国农学通报，２００５，１２（２１）：３５３９．
［１５］ 董宽虎，沈益新．饲草生产学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００３：７８７９．
［１６］ 陈宝书．牧草饲料作物栽培学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００１：２２４．
［１７］ 切彩．１１分白三叶材料形态特征及其同工酶和种子贮藏蛋白遗传多样性研究［Ｄ］．乌鲁木齐：新疆农业大学，２００９．
［１８］ 杨珍．高加索三叶草鱼白三叶草及其杂交胚立体培养技术的研究［Ｄ］．呼和浩特：内蒙古农业大学，２００８．
［１９］ 杨珍，何丽君，王明玖．高加索三叶草×白三叶胚萌发条件的探索［Ｊ］．草业科学，２００９，２６（１）：５０５４．
［２０］ ＳｈａｒｍａｓＴＲ，ＳｉｎｇｈＲＫ，ＣｈａｈｏｔａＲ，犲狋犪犾．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｕ
ｓｉｎｇａｇｒｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＲＡＰＤｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００５，５９：３４．
［２１］ ＧｕｓｔｉｎｅＤＬ，ＨｕｆｆＤＲ．Ｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎａｎｄａｍｏｎｇｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｍａｎａｇｅｄｐｅｒｍａｎｅｎｔｐａｓｔｕｒｅｓｏｆ
ｔｈｅＮｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎＵＳＡ［Ｊ］．ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，１９９９，３９：５２４５３０．
６３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５
［２２］ ＪｏｙｃｅＴＡ，ＡｂｂｅｒｔｏｎＭＴ，ＭｉｃｈａｅｌｓｏｎＹｅａｔｅｓＴＰＴ，犲狋犪犾．ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｂｅｔｗｅｅｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＲＡＰＤＰＣＲ
ａｎｄｈｅｔｅｒｏｓｉｓｉｎｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｓｏｆｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊Ｌ．）［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１９９９，１０７（３）：１５９１６５．
［２３］ ＧｅｏｒｇｅＪ，ＤｏｂｒｏｗｏｌｓｋｉＭＰ，ＶａｎＺｉｊｌｄｅＪｏｎｇＥ，犲狋犪犾．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｃｕｌｔｉｖａｒｓｏｆｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅
犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊Ｌ．）ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＳＳＲｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，２００６，４９：８．
［２４］ Ｋ?ｌｉｋｅｒＲ，ＨｏｎｅｓＥＳ，ＪａｈｕｆｅｒＭＺＺ，犲狋犪犾．ＢｕｌｋｅｄＡＦＬＰａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｔｈｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ
（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊Ｌ．）［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００１，１２１：３０５３１５．
［２５］ ＳａｇｈａｉＭａｒｏｏｆＭＡ，ＳｏｌｉｍａｎＫＭ，ＪｏｒｇｅｎｓｅｎＲＡ．ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｐａｃｅｒｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎｂａｒｅｌｙ：Ｒｉｂｏｓｏｍａｌｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ，ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｏｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｙｎａｍｉｃｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄ
ＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，１９８４，８１：８０１．
［２６］ 王志勇，袁学军，刘建秀，等．狗牙根ＳＲＡＰＰＣＲ反应体系优化及引物筛选［Ｊ］．草业学报，２００８，３（１７）：７９８５．
［２７］ 薛丹丹，郑轶琦，王志勇，等．结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系的建立和优化［Ｊ］．草业学报，２００８，６（１７）：９３１０１．
［２８］ 易杨杰，张新全，黄琳凯，等．野生狗牙根种质遗传多样性的ＳＲＡＰ研究［Ｊ］．遗传，２００８，３０（１）：９４１００．
［２９］ 许绍斌，陶玉芬，杨昭庆，等．简单快速的ＤＮＡ银染和胶保存方法［Ｊ］．遗传，２００２，２４（３）：３３５３３６．
［３０］ ＲｏｌｄａｎＲｕｉｚＩ，ＤｅｎｄａｕｗＪ，ＶａｎＢｏｃｋｓｔａｅｌｅＥ，犲狋犪犾．ＡＦＬＰｍａｒｋｅｒｓｒｅｖｅａｌｈｉｇｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｒａｔｅｓｉｎｒｙｅｇｒａｓｓｅｓ（犔狅犾犻狌犿
ｓｐｐ．）［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，２０００，６：１２５１３４．
［３１］ ＡｒｃｈａｋＳ，ＧａｉｋｗａｄＡＢ，ＧａｕｔａｍＤ，犲狋犪犾．ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＲＡＰＤ，ＩＳＳＲａｎｄ
ＡＦＬＰ）ｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃａｓｈｅｗ（犃狀犪犮犪狉犱犻狌犿狅犮犮犻犱犲狀狋犪犾犲Ｌ．）ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｏｆＩｎｄｉａ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，２００３，４６：３６２３６９．
［３２］ ＰｏｗｅｌＷ，ＭｏｒｇａｎｔｅＭ，ＡｎｄｒｅＣ，犲狋犪犾．ＴｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＲＡＰＤ，ＡＦＬＰａｎｄＳＳＲ（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ）ｍａｒｋｅｒｆｏｒｇｅｒｍｐｌａｓｍａ
ｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，１９９６，２：２２５２３８．
［３３］ 车永和，李立会，何蓓如．冰草属植物遗传多样性取样策略基于醇溶蛋白的研究［Ｊ］．植物遗传资源学报，２００４，５：２１６
２２１．
［３４］ 冯宗云，李宏，张立立，等．西藏野生大麦醇溶蛋白的遗传多样性［Ｊ］．四川大学学报，２００４，４１：４４０４４５．
［３５］ 车永和，李立会，何培茹．冰草属（犃犵狉狅狆狔狉狅狀Ｇａｅｒｔｎ．）植物遗传多样性取样策略基于醇溶蛋白的研究［Ｊ］．植物遗传资源
学报，２００４，５：２１６２２１．
［３６］ ＲｏｈｌｆＦＪ．ＮＴＳＹＳｐｃ．ＮｕｍｅｒｉａｌＴａｘｏｎｏｍｙａｎｄＭｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ （Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）［Ｍ］．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＥｘｔｅｒＳｏｆｔ
ｗｅｒｅ，１９９４．
［３７］ ＫｏｎｇｋｉａｔｎｇａｍＰ，ＷａｔｅｒｗａｙＭＪ，ＦｏｒｔｉｎＭＧ，犲狋犪犾．Ｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎａｎｄｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｃｕｌｔｉｖａｒｓｏｆｒｅｄｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅
犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲Ｌ．）－Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｏｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ｉｓｏｚｙｍｅ，ａｎｄＲＡＰＤｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１９９５，８４：２３７２４６．
［３８］ ＵｌｏａＯ，ＯｒｔｅｇａＦ，ＣａｍｐｏｓＨ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｒｅｄｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲Ｌ．）ｂｒｅｅｄｉｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓａｓ
ｒｅｖｅａｌｅｄｂｙＲＡＰＤｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，２００３，４６（６）：５２９５３５．
［３９］ 关潇．野生紫花苜蓿种质资源遗传多样性研究［Ｄ］．北京：北京林业大学，２００９．
［４０］ ＷｉｌｓｏｎＢＬ，ＫｉｔｚｍｉｌｅｒＪ，ＲｏｌｅＷ，犲狋犪犾．Ｉｓｏｚｙｍｅｖａｒｉａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｉｎ犈犾狔犿狌狊犵犾犪狌犮狌狊ｆｒｏｍｔｈｅＣａｌｉ
ｆｏｒｎｉａＦｌｏｒｉｓｔｉｃＰｒｏｖｉｎｃｅ［Ｊ］．ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｏｔａｎｙｒｅｖｕｅＣａｎａｄｉｅｎｎｅｄｅＢｏｔａｎｉｑｕｅ，２００１，７９：１３９１５３．
［４１］ 谢国禄．北美白三叶草收集种和品种的ＲＡＰＤ标记遗传变异［Ｊ］．ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，２００２，４２（２）：３４２３４７．
［４２］ 安晓珂．三叶草属三种植物遗传多样性的ＲＡＰＤ分析［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２００８．
［４３］ ＢｏｒｔｏｌｉｎｉＦ，ＡｇｎｏｌＭＤ，ＳｃｈｉｆｉｎｏＷｉｔｔｍａｎｎＭＴ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＵＳＤＡｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊
Ｌ．）ｃｏｒｅｃｏｌｅｃｔｉｏｎｂｙＲＡＰＤｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＣｒｏｐＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００６，５３：１０８１１０８７．
７３１第１９卷第５期 草业学报２０１０年
犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔犻狀狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犵犲狉犿狆犾犪狊犿犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔犛犚犃犘犿犪狉犽犲狉狊
ＺＨＡＮＧＪｉｎｇｙｕａｎ，ＰＥＮＧＹａｎ，ＬＵＯＹａｎ，ＭＡＸｉａｏ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ’ａｎ６２５０１４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＳＲＡＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）ｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
４１ｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｕｓｉｎｇ２０ｐａｉｒｓｏｆｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅ：１）Ｔｈｅ
ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓａｍｐｌｉｆｉｅｄ４７９ｃｌｅａｒｂａｎｄｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ４１１ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ，ｗｈｉｃｈｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ１３ｔｏ４４ｂａｎｄｓｐｅｒ
ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｏｆ２３．９５ｂａｎｄｓ．Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｌｏｃｉｗａｓ８５．１６％，ａｎｄｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｓｍｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃｏｎｔｅｎｔｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．１８２ｔｏ０．３３４ｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｏｆ０．２６８，ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｅｓｔｅｄ
ｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｈａｄａｒｉｃｈｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｇｅｒｍｐｌａｓｍ．２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．５８６６ｔｏ０．９８９６
ａｍｏｎｇａｌａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｏｆ０．７３０７，ｗｈｉｃｈａｌｓｏｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｒｉｃｈｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎ
ａｍｏｎｇｔｈｅｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ．３）Ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆ４１ｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｄｉｖｉｄｅｄｔｈｅｍｉｎｔｏ３ｇｒｏｕｐｓｏｎｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆ０．７１ａｎｄｍｏｓｔｏｆｔｈｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｅ
ｏｒｓｉｍｉｌａｒｅｃｏｌｏｇｉｃｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｏｎｅｇｒｏｕｐ，ｓｈｏｗｉｎｇａｃｅｒｔａｉｎｄｅｇｒｅｅｏｆｅｃｏｇｅｏｇｒａｐｈ
ｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）；ＳＲＡＰ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔ
檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵
ｙ
８３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５