全 文 ：书柱花草犛犚犃犘－犘犆犚体系优化及其
遗传多样性分析
张伟丽１，刘凤民２，刘艾３
（１．仲恺农业工程学院生命科学学院，广东 广州５１０２２５；２．仲恺农业工程学院教学科研基地，广东 广州５１０２２５；
３．仲恺农业工程学院园艺园林学院，广东 广州５１０２２５）
摘要：以热研２号、热研１３号柱花草为试验材料，对影响ＳＲＡＰ标记ＰＣＲ反应的模板、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、酶及引物浓
度进行了优化，建立了适合于柱花草ＳＲＡＰ标记的扩增体系。反应体系具体为：模板 ＤＮＡ４０ｎｇ，Ｍｇ２＋ ２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ酶１．０Ｕ，引物０．３μｍｏｌ／Ｌ，反应总体积为２５μＬ。采用优化的扩增体系，对９份
柱花草种质材料进行了遗传多样性分析。从４８对ＳＲＡＰ引物中筛选出１４对扩增清晰且多态性高的引物，共扩增
出１５４条谱带，其中有１５０条多态性谱带。多态性比率（ＰＰＢ）达９７．３６％。应用ＮＴＳＹＳｐｃ２．１数据分析软件计算
各品种间的遗传相似系数（ＧＳ），结果表明这些材料间的遗传相似系数的变化范围为０．３８６～０．８８２，平均遗传相似
系数为０．６３１，平均遗传距离（ＧＤ）为０．３６９。通过ＵＰＧＭＡ分子系统聚类法，将９份柱花草种质分为３个类群，有
钩柱花草是第Ⅰ类，西卡柱花草是第Ⅱ类，热研５号、热研１０号、热研１３号、白花库克、热研２号、格拉姆、Ｔａｒｄｉｏ为
第Ⅲ类。从遗传聚类图可以很明确地看出９份种源间的遗传距离及亲缘关系。对聚类结果分析显示，大部分具有
亲缘关系的品种及形态学、生物学特征相近的品种聚在一类，说明聚类分析结果与系谱及生物学特征具有一定的
相符性。
关键词：柱花草；ＳＲＡＰ；体系优化；遗传多样性
中图分类号：Ｓ５４１＋．９０３；Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０４０１５９１０
柱花草属（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊）植物是热带、亚热带地区的豆科牧草，柱花草属有４４个种和亚种［１］，柱花草中的很
多品种是优良的热带豆科牧草，具有茎叶产量高、草品质好、耐旱、耐酸性瘦土的特点，自２０世纪６０年代从东南
亚国家引入我国后，广泛用于青饲料、草粉生产、放牧、水土保持、果园覆盖和绿肥作物等［２］。
基于表型性状标记鉴定不同品种，以及确定品种分类地位、确定相互之间的亲缘关系越来越困难。同样柱花
草属内种和亚种的形态学上鉴定非常难［３］，分子标记方法对阐述物种间遗传关系提供了有效的手段。ＤＮＡ分子
标记在柱花草上的应用已有报道，利用随机扩增多态性ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）［４，５］、
限制性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＡＦＬＰ）［６］、序列标记位点（ｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｇｅｄ
ｓｉｔｅｓ，ＳＴＳ）［７］、微卫星标记（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ）［８］、核糖体ＤＮＡ转录间隔区（ｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆ
ｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ，ｎｒＤＮＡＩＴＳ）［９］、简单重复间序列区间（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，ＩＳＳＲ）ＰＣＲ扩增技
术［１０］等分子标记技术已用于柱花草的遗传差异研究。
相关序列扩增多态性（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）是一种新型的基于ＰＣＲ的标记，由
美国加州大学蔬菜作物系Ｌｉ和Ｑｕｉｒｏｓ［１１］于２００１年在研究芸薹属（犅狉犪狊狊犻犮犪）植物中开发的，标记采用长１７～１８
ｂｐ的引物对开放阅读框（ＯＲＦｓ）进行扩增，因不同物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。由于
ＳＲＡＰ技术简便、快速，扩增稳定，不需预知物种的序列信息等优点，故而迅速在植物遗传多样性分析和比较基因
组学研究等方面得到广泛应用［１２］。
ＳＲＡＰ标记在柱花草上的应用研究至今尚未见报道。因此，本研究以柱花草不同栽培种的品种资源为试验
材料，建立并优化了ＳＲＡＰ扩增反应的技术体系。并利用筛选的引物对９份种质资源进行了遗传多样性分析，
第２０卷 第４期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１５９－１６８
２０１１年８月
收稿日期：２０１１０４１５；改回日期：２０１１０５２７
基金项目：广东省科技计划项目（２０１０Ｂ０２０３０５０１１）资助。
作者简介：张伟丽（１９６９），女，河北乐亭人，副教授，硕士生导师，博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｅｉｌｉ７２１８＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕａｉ２６８＠１６３．ｃｏｍ
从分子水平上探讨这些柱花草种质的遗传多样性，对柱花草种质资源的鉴定、利用及其育种实践等具有一定的参
考价值。旨在探讨柱花草资源间的遗传基础，为柱花草种质的收集保护和育种开发提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料与管理
１．１．１ 植物材料 在ＳＲＡＰ体系优化中选用热研２号柱花草（犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．２）和热研１３号柱
花草（犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１３）。遗传多样性分析采用了９份柱花草属材料，这些柱花草属种质材料的
品种、特点以及来源地见表１。２００９年４月－２０１０年１２月植物材料种植在仲恺农业工程学院试验农场。
１．１．２ 植物盆栽种植及管理 将种子在８０℃热水中处理３～５ｍｉｎ后冷却，再浸泡于稀释８００倍的复方多菌灵
（多硫）溶液中消毒３０ｍｉｎ，流水冲洗，播种于培养盆中，盆土为按２∶１∶１混合的园田土、椰糠和珍珠岩，经高温
灭菌后使用。柱花草幼苗在自然光照下，每隔１５ｄ施肥１次，待生长至２～３个月后，每份种质取５～１０个单株
的等量新鲜幼嫩叶提取试验ＤＮＡ。
表１ 供试柱花草品种
犜犪犫犾犲１ 犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊狏犪狉犻犲狋犻犲狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
序号Ｎｏ． 品种Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ 特点Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ 来源地Ｏｒｉｇｉｎ
１ 热研５号犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．５ 早熟、产量中、抗病Ｅａｒｌｙｍａｔｕｒｅ，ｍｅｄｉｕｍｙｉｅｌｄａｎｄ
ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
中国热带农业科学院ＣＡＴＡＳ
２ 热研１０号犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１０ 晚熟、抗病Ｌａｔｅｒｍａｔｕｒｅａｎｄａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ 中国热带农业科学院ＣＡＴＡＳ
３ 热研１３号犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１３ 高产、抗病 Ｈｉｇｈｙｉｅｌｄａｎｄｌａｔｅｒｍａｔｕｒｅ 中国热带农业科学院ＣＡＴＡＳ
４ 有钩柱花草犛．犺犪犿犪犾犪ｃｖ．Ｖｅｒａｎｏ 抗炭疽病Ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ
５ 西卡柱花草犛．狊犮犪犫狉犪ｃｖ．Ｓｅｃａ 抗炭疽病Ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ
６ 白花库克犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｗｈｉｔｅｃｏｏｋ 易感病Ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ
７ Ｔａｒｄｉｏ柱花草犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｔａｒｄｉｏＣＩＡＴ１２８３ 高抗病 Ｈｉｇｈａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ 国际热带农业中心ＣＩＡＴ
８ 热研２号犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．２ 早熟、高产、中抗Ｅａｒｌｙｍａｔｕｒｅ，ｈｉｇｈｙｉｅｌｄａｎｄｍｅｄｉ
ｕｍａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
中国热带农业科学院ＣＡＴＡＳ
９ 格拉姆犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｇｒａｈａｍ 早熟、易感病Ｅａｒｌｙｍａｔｕｒｅａｎｄｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ 澳大利亚Ａｕｓｔｒａｌｉａ
ＣＡＴＡＳ：中国热带农业科学院 ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ；ＣＩＡＴ：国际热带农业中心ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＴｒｏｐｉｃａｌ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ．
１．２ 试验方法
１．２．１ 基因组ＤＮＡ提取 采用ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，十二烷基硫酸钠）法［１３］。
１．２．２ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增 根据Ｌｉ和Ｑｕｉｒｏｓ［１１］提出的原则合成引物，引物序列如表２。ＳＲＡＰ引物合成由上
海生工有限公司完成，６个正向引物和８个反向引物，共组成４８对ＳＲＡＰ引物。反应程序：９４℃ 预变性４ｍｉｎ；
前５个循环在９４℃ 变性１ｍｉｎ，３３℃ 复性１ｍｉｎ，７２℃ 延伸１０ｓ条件下运行；随后的３０个循环在９４℃ 变性１
ｍｉｎ，５０℃ 复性１ｍｉｎ，７２℃ 延伸１０ｓ条件下运行；循环结束后７２℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ反应在ｅｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒ
ｃｙｃｌｅｒｇｒａｄｉｅｎｔｓ梯度ＰＣＲ仪上进行。将Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ聚合酶、引物浓度等设置不同的浓度梯度（详见结果
与分析部分）Ｍｅ６和Ｅｍ５引物组合进行ＰＣＲ扩增以确定最佳反应体系。本试验中用的 Ｍａｒｋｅｒ（Ｂ００６１），购自
北京鼎国生物技术有限责任公司，有６条带：６００，５００，４００，３００，２００和１００ｂｐ。
１．２．３ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增产物检测 扩增结束后，首先取１／６体积６×ｌｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ缓冲液与ＰＣＲ产物混合
后，上样于６％ 的聚丙烯酰胺凝胶进行分离（电泳仪为ＤＹＹ８Ｂ型，电泳槽为ＤＹＣＺ２８０型），电泳结束后快速银
染检测。
１．３ 柱花草９个品种的ＳＲＡＰ标记分析及数据处理分析
ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增产物以０或１统计建立二元数据矩阵，在相同迁移位置，有扩增带记为１，无带记为０。根
０６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
据矩阵数据计算ＳＲＡＰ的总扩增带数（ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｎｄｓ，ＴＮＢ）、多态性带数（ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ，ＮＰＢ）、多态性条带百分比（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ，ＰＰＢ）［１４］。利用ＮＴＳＹＳｐｃ２．１计算各材料
间的ＮｅｉＬｉ遗传相似系数ＧＳ（即Ｄｉｃｅ遗传相似系数），犌犛犻犼＝２犪／（２犪＋犫＋犮），式中，犌犛犻犼代表种质犻和犼之间的
遗传相似系数，犪代表犻和犼种质共有的条带数，犫和犮分别代表犻和犼两种质各自特有的条带数。遗传距离（ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅ，ＧＤ）＝１－ＧＳ。同时，基于遗传相似系数进行非加权配对类平均法（ｕｎｗｅｉｇｈｔｐａｉｒｇｒｏｕｐｍｅｔｈ
ｏｄｕｓｉｎｇａｒｉｔｈｍｅｔｉｃａｖｅｒａｇｅ，ＵＰＧＭＡ）聚类分析［１５］。
表２ 犛犚犃犘所用引物序列
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲狆狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犻狀犛犚犃犘犪狀犪犾狔狊犻狊
编号Ｃｏｄｅ 正向引物Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓ 编号Ｃｏｄｅ 反向引物Ｒｅｓｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓ
Ｍｅ１ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ３′ Ｅｍ１ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴ３′
Ｍｅ３ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴ３′ Ｅｍ２ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣ３′
Ｍｅ４ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ３′ Ｅｍ３ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ３′
Ｍｅ５ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧ３′ Ｅｍ４ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ３′
Ｍｅ６ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡ３′ Ｅｍ５ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ３′
Ｍｅ８ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ３′ Ｅｍ６ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ３′
Ｅｍ７ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ３′
Ｅｍ８ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ３′
２ 结果与分析
２．１ 柱花草基因组ＤＮＡ的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系建立
２．１．１ Ｍｇ２＋浓度对ＰＣＲ扩增的影响 Ｍｇ２＋浓度对ＰＣＲ扩增效率和特异性都有影响，它是Ｔａｑ酶的激活剂，
影响Ｔａｑ酶的活性，同时又与ｄＮＴＰ和模板结合，降低了酶活性所需要的游离 Ｍｇ２＋的量。Ｍｇ２＋过多会增加产
量，但会出现非特异扩增；过少会降低Ｔａｑ酶的活性，使反应产物减少［１５］。当Ｍｇ２＋浓度为１．５ｍｍｏｌ／Ｌ时热研２
号以及热研１３号扩增产物较少（图１Ａ）；２．０ｍｍｏｌ／Ｌ时２个柱花草品种谱带显示较弱；当 Ｍｇ２＋浓度为２．５和
３．０ｍｍｏｌ／Ｌ时，２个品种扩增谱带均清晰且差异不大。综合比较，２个柱花草品种都是 Ｍｇ２＋ 浓度为２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ时扩增效果最好，条带清晰，带型丰富，多态性好。
２．１．２ ｄＮＴＰｓ浓度对ＰＣＲ扩增的影响 本试验设定的４个ｄＮＴＰｓ浓度的扩增结果差异很大（图１Ｂ）。在０．１
ｍｍｏｌ／Ｌ时２个柱花草品种扩增条带都较弱，且条带模糊。表现出低浓度的ｄＮＴＰｓ影响ＰＣＲ合成效率；当浓度
增加至０．２和０．３ｍｍｏｌ／Ｌ时扩增产物主带清晰，且分离效果佳；但０．４ｍｍｏｌ／Ｌ时条带减少。ｄＮＴＰｓ是ＰＣＲ
扩增反应的原料，必须达到一定浓度才能满足要求，但过高也会与Ｔａｑ酶竞争 Ｍｇ２＋，对扩增不利。因此，本试验
确定０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ为最佳反应浓度。
２．１．３ ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度对ＰＣＲ扩增的影响 ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度过低不能扩增，浓度太高产生非特异
性扩增。选择ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度时主要考虑到扩增效果和成本。２个品种的结果很一致，当ＴａｑＤＮＡ聚合
酶浓度为０．５Ｕ时扩增产物的谱带模糊，而当浓度为１．０和１．５Ｕ时扩增的条带增加且较清晰（图１Ｃ）。浓度为
２．０Ｕ时的条带较少且模糊。因考虑酶量较大时，易出现非特异性扩增。所以从稳定性以及经济问题方面考虑，
最终确定ＴａｑＤＮＡ聚合酶适宜用量为１．０Ｕ／２５μＬ。
２．１．４ 引物浓度对ＰＣＲ扩增的影响 引物浓度会影响ＰＣＲ扩增的特异性。较高的引物浓度会导致非特异性
产物扩增；过低则影响扩增效果。在试验中引物浓度为０．２，０．３，０．４，０．５μｍｏｌ／Ｌ时均有扩增产物（图１Ｄ）。０．２
μｍｏｌ／Ｌ时，扩增产物电泳谱带少且均较模糊，在０．３和０．４μｍｏｌ／Ｌ时谱带清晰稳定，其中０．３μｍｏｌ／Ｌ时谱带
多而丰富。０．５μｍｏｌ／Ｌ时电泳谱带明显减少且均较模糊。考虑到引物量过大易形成引物二聚体，所以确定引物
浓度为２５μＬ体系中加入０．３μｍｏｌ／Ｌ的引物效果好。
１６１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
图１ ２种柱花草不同浓度水平 犕犵２＋、犱犖犜犘狊、犜犪狇犇犖犃聚合酶、引物的犛犚犃犘－犘犆犚电泳图谱
犉犻犵．１ 犛犚犃犘－犘犆犚狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅犳犕犵２＋，犱犖犜犘狊，犜犪狇犇犖犃狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲
犪狀犱狆狉犻犿犲狉狊狅狀狋狑狅犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犮狌犾狋犻狏犪狉狊
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ．Ａ：ａ１、ａ２、ａ３和ａ４泳道分别为热研２号柱花草的Ｍｇ２＋浓度１．５，２．０，２．５，３．０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｂ１、ｂ２、ｂ３和ｂ４泳道分别为热研１３号柱花
草的 Ｍｇ２＋浓度１．５，２．０，２．５，３．０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｌａｎｅａ１，ａ２，ａ３ａｎｄａ４ａｒｅ１．５，２．０，２．５ａｎｄ３．０ｍｍｏｌ／Ｌｏｆ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊
ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．２，ｌａｎｅｂ１，ｂ２，ｂ３ａｎｄｂ４ａｒｅ１．５，２．０，２．５ａｎｄ３．０ｍｍｏｌ／Ｌｏｆ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１３；Ｂ：ａ１、ａ２、ａ３和ａ４泳道分别为热研
２号柱花草的ｄＮＴＰｓ浓度０．１，０．２，０．３，０．４ｍｍｏｌ／Ｌ，ｂ１、ｂ２、ｂ３和ｂ４泳道分别为热研１３号柱花草的ｄＮＴＰｓ浓度０．１，０．２，０．３，０．４ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｌａｎｅａ１，ａ２，ａ３ａｎｄａ４ａｒｅ０．１，０．２，０．３ａｎｄ０．４ｍｍｏｌ／Ｌｏｆ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．２，ｌａｎｅｂ１，ｂ２，ｂ３ａｎｄｂ４ａｒｅ
０．１，０．２，０．３ａｎｄ０．４ｍｍｏｌ／Ｌｏｆ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１３；Ｃ：ａ１、ａ２、ａ３和ａ４泳道分别为热研２号柱花草的ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度０．５，
１．０，１．５，２．０Ｕ，ｂ１、ｂ２、ｂ３和ｂ４泳道分别为热研１３号柱花草ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度０．５，１．０，１．５，２．０ＵＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｆｒｏｍｌａｎｅａ１，ａ２，ａ３ａｎｄａ４ａｒｅ０．５，１．０，１．５ａｎｄ２．０Ｕｏｆ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．２，ｌａｎｅｂ１，ｂ２，ｂ３ａｎｄｂ４ａｒｅ０．５，１．０，１．５ａｎｄ２．０Ｕｏｆ
犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１３；Ｄ：ａ１、ａ２、ａ３和ａ４泳道分别为热研２号柱花草的引物浓度０．２，０．３，０．４ａｎｄ０．５μｍｏｌ／Ｌ，ｂ１、ｂ２、ｂ３和ｂ４泳道分
别为热研１３号柱花草的引物浓度０．２，０．３，０．４ａｎｄ０．５μｍｏｌ／ＬＰｒｉｍｅｒｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｌａｎｅａ１，ａ２，ａ３ａｎｄａ４ａｒｅ０．２，０．３，０．４ａｎｄ０．５
μｍｏｌ／Ｌｏｆ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．２，ｌａｎｅｂ１，ｂ２，ｂ３ａｎｄｂ４ａｒｅ０．２，０．３，０．４ａｎｄ０．５μｍｏｌ／Ｌｏｆ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｒｅｙａｎ１３
２．１．５ ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系的确定 该体系的模板ＤＮＡ的浓度，本试验参考了结缕草属（犣狅狔狊犻犪）植物［１６］和
樱桃（犆犲狉犪狊狌狊）［１７］在ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系优化时得到的模板ＤＮＡ浓度范围要求较宽的结论：模板质量浓度对
ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应的影响不大，在所设定的梯度范围３０～９０ｎｇ的扩增结果都无太大的差异，条带都较清晰和稳
定。所设定的梯度范围均适合ＳＲＡＰ的扩增，效果都较好。经过综合考虑和结合预试验结果，确定柱花草ＳＲＡＰ
－ＰＣＲ体系中ＤＮＡ浓度采用４０ｎｇ［１８］。
２６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
总之，Ｍｅ６和Ｅｍ５引物组合在供试柱花草属植
物的２个基因型中扩增的谱带清晰（图１），说明这１
对引物可区分这２个供试材料，而且在后续试验中很
好区分了９个柱花草品种，综合考虑以上各种因素，从
结果稳定性和经济性出发，确立柱花草属植物ＳＲＡＰ
－ＰＣＲ最佳反应体系：模板 ＤＮＡ４０ｎｇ，Ｍｇ２＋ ２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．０
Ｕ，上、下引物分别为０．３μｍｏｌ／Ｌ，反应总体积为２５μＬ。
２．２ 不同品种的ＳＲＡＰ标记分析
２．２．１ 基因组 ＤＮＡ 遗传多态性分析 从４８对
ＳＲＡＰ引物中共筛选出１４对多态性好、条带清晰的引
物。对９份柱花草种质扩增的结果见表３。１４条引物
共扩增出１５４条带，平均每条引物扩增出１１条带，最
多的能得到１５条清晰带，最少的有７条清晰带。在
１５４条带中，有１５０条重复性好、清晰的多态性条带，
多态性条带比率为９７．４０％。结果均表明在这些柱花
草种质间存在丰富的遗传多样性，同时也说明ＳＲＡＰ
标记在检测柱花草基因组遗传多态性上有较显著的检
出效率。柱花草的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增片段大约集中
在１００～６００ｂｐ（图２），也有一些少数特异位点在此范
围以外。为了统计方便，当分子量大于６００ｂｐ以及小
于１００ｂｐ的条带不予记录，过弱的带也不予记录。
表３ １４对犛犚犃犘引物的扩增结果
犜犪犫犾犲３ 犚犲狊狌犾狋狅犳犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犛犚犃犘
犫狔１４狆狉犻犿犲狉狊狆犪犻狉
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
扩增总条带数
Ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒ
ｏｆｂａｎｄｓ
（ＴＮＢ）
多态性条带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
（ＮＰＢ）
多态性比率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｂｉｃ
ｂａｎｄｓ
（％）
Ｍｅ１＋Ｅｍ２ １２ １１ ９１．６７
Ｍｅ１＋Ｅｍ３ ９ ９ １００．００
Ｍｅ１＋Ｅｍ４ １３ １２ ９２．３１
Ｍｅ１＋Ｅｍ５ １３ １３ １００．００
Ｍｅ１＋Ｅｍ６ １４ １４ １００．００
Ｍｅ１＋Ｅｍ７ １１ １０ ９０．９１
Ｍｅ１＋Ｅｍ８ １１ １１ １００．００
Ｍｅ４＋Ｅｍ３ ９ ９ １００．００
Ｍｅ４＋Ｅｍ４ １２ １１ ９１．６７
Ｍｅ５＋Ｅｍ１ １０ １０ １００．００
Ｍｅ５＋Ｅｍ２ ８ ８ １００．００
Ｍｅ５＋Ｅｍ３ １５ １５ １００．００
Ｍｅ５＋Ｅｍ４ ７ ７ １００．００
Ｍｅ８＋Ｅｍ２ １０ １０ １００．００
平均值Ａｖｅｒａｇｅ １１ １０．７１ ９７．６１
总数Ｔｏｔａｌ １５４ １５０．００ ９７．４０
２．２．２ 遗传相似性分析 用ＮＴＳＹＳｐｃ软件，通过扩增谱带的１，０原始数据矩阵，对９份种源进行遗传相似性
分析，结果表明，供试材料样本间相似系数（ＧＳ）的变异范围为０．３８６～０．８８２，平均ＧＳ为０．６３１，平均遗传距离
（ＧＤ）为０．３６９。
根据相似系数矩阵表，对不同品种种间的遗传相似系数进行了比较分析（表４）。从种间的遗传相似系数来
看，热研１０号柱花草与热研１３号柱花草的遗传相似系数最大，高达０．８８２，说明在这９个品种中它们的遗传距
离最近。热研１０号柱花草与热研５号柱花草的遗传相似系数值为０．８７６，说明这２个品种的遗传距离较近。同
样，热研２号柱花草分别与白花库克柱花草、格拉姆柱花草的遗传距离也较近，遗传相似系数分别为０．８５６和
０．８５０。而有钩柱花草与西卡柱花草的遗传相似系数为０．７２６，遗传距离较近。但这２个品种与其他７个柱花草
品种的遗传相似系数都较低（０．３８６～０．４７７）。有钩柱花草与热研１０号柱花草的遗传相似系数最低，为０．３８６。
它们之间的遗传距离最远。
２．２．３ 遗传多样性的分子聚类分析 基于遗传相似系数，利用ＵＰＧＭＡ方法对９份供试材料进行聚类分析（图
３）。由聚类图可把９份柱花草种质分为２个大类群（ＧＳ＝０．６５处）：圭亚那柱花草（犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊）类包括热研５
号、热研１０号、热研１３号、白花库克、热研２号、格拉姆、Ｔａｒｄｉｏ（第Ⅰ类）；有钩柱花草和西卡柱花草是第Ⅱ类。
其中有钩柱花草与西卡柱花草的遗传距离较近。从地域来源看分类，西卡和有钩柱花草都来源于澳大利亚，所以
它们聚在一类中。而其他７个品种都是圭亚那柱花草种聚为一类。
对第Ⅰ类圭亚那种的７份柱花草材料进行分析，１４对引物共扩增出１１１条带，有９０条为清晰的多态带，多
态性条带比率为８１．０８％。圭亚那柱花草种内的遗传相似系数为０．６７３～０．８８２，说明圭亚那柱花草种内有较大
的遗传分化。从ＧＳ＝０．７８处可将圭亚那种柱花草分为３组：其中热研５号、热研１０号、热研１３号柱花草为一
组（Ａ组），这组中热研５号和热研１０号柱花草是从ＣＩＡＴ１８４群体中选育出的早花和晚花抗病品种，热研１３号
柱花草是从ＣＩＡＴ１０４４群体中选育出的高产抗病品种，所以从抗病性来说这３个品种聚在一起；白花库克、热研
３６１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
２号、格拉姆柱花草为一组（Ｂ组），库克与格拉姆都是对炭疽病高度敏感的品种，热研２号为中抗品种，它们聚在
一起；Ｔａｒｄｉｏ柱花草单独为一组（Ｃ组），Ｔａｒｄｉｏ柱花草是其中最抗病的品种。
图２ 引物组合 犕犲１＋犈犿５、犕犲１＋犈犿６、犕犲１＋犈犿７、犕犲１＋犈犿８对９个柱花草品种的扩增结果
犉犻犵．２ 犚犲狊狌犾狋狅犳犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犫狔犛犚犃犘狆狉犻犿犲狉犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀犕犲１＋犈犿５，犕犲１＋犈犿６，
犕犲１＋犈犿７犪狀犱犕犲１＋犈犿８犻狀狀犻狀犲犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊
泳道编号１～９与表１中编号一致Ｔｈｅｌａｎｅｎｕｍｂｅｒｓａｒｅｔｈｅｓａｍｅａｓｔｈｅｔａｂｌｅ１
表４ ９个柱花草品种的遗传相似系数
犜犪犫犾犲４ 犆狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狅犳犵犲狀犲狋犻犮狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔犪犿狅狀犵狀犻狀犲犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊狏犪狉犻犲狋犻犲狊
品种序号ＶａｒｉｅｔｉｅｓＮｏ． １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
２ ０．８７６
３ ０．８２４ ０．８８２
４ ０．４３１ ０．３８６ ０．４５０
５ ０．４４４ ０．４１２ ０．４７７ ０．７２６
６ ０．７９１ ０．７９７ ０．７１９ ０．４３１ ０．４１８
７ ０．６８０ ０．６８６ ０．６７３ ０．４２５ ０．４１２ ０．７３２
８ ０．７５２ ０．７４５ ０．６８０ ０．４７１ ０．４４４ ０．８５６ ０．７０６
９ ０．７５８ ０．７２６ ０．６７３ ０．４２５ ０．４２５ ０．８２４ ０．６９９ ０．８５０
品种序号１～９与表１中编号一致Ｔｈｅｖａｒｉｅｔｉｅｓｎｕｍｂｅｒｓａｒｅｔｈｅｓａｍｅａｓｔｈｅｔａｂｌｅ１．
４６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
图３ 基于１４对犛犚犃犘引物的９个柱花草品种的犝犘犌犕犃聚类
犉犻犵．３ 犝犘犌犕犃犱犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳狀犻狀犲犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵犲狉犿狆犾犪狊犿狊犫犪狊犲犱１４犛犚犃犘狆狉犻犿犲狉狊
３ 结论与讨论
３．１ 柱花草属ＳＲＡＰ－ＰＣＲ优化体系的建立
通过单因子试验对柱花草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系进行优化，以上述所确定的条件，用 Ｍｅ６和Ｅｍ５引
物组合在供试柱花草属植物２个基因型中可扩增出清晰的谱带，且１对引物即可区分这２个供试材料，在后续试
验中多引物对用此体系能很好区分９个柱花草品种，综合考虑以上各种因素，从结果稳定性和经济性出发，确立
柱花草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ最佳反应体系：模板ＤＮＡ１μＬ（４０ｎｇ）、Ｍｇ
２＋２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰｓ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、
ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．０Ｕ、上、下引物各为０．３μｍｏｌ／Ｌ，反应总体积为２５μＬ。
此最佳体系与标准ＰＣＲ及他人的研究在各因素的浓度方面存在差异，这可能是由于不同植物的基因组和标
记类型不同造成的。该反应体系的成功建立为今后ＳＲＡＰ标记在柱花草属植物的种源鉴定、遗传多样性分析、
指纹图谱及遗传图谱构建等方面的广泛应用奠定了重要基础，也促进了分子标记技术在草业遗传育种和分子生
物学研究中的进程；试验优化了柱花草的ＳＲＡＰ标记技术体系，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法亦能获得较
清晰的电泳图谱，尤其是小片段和较近的片段之间效果更好。本试验优化的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ体系在柱花草属植物
９个基因型中均获得清晰稳定的扩增结果。因此，ＳＲＡＰ可望在柱花草属植物起源和进化研究中得到广泛应用。
３．２ 柱花草属植物种质资源间存在的遗传多样性的情况
ＲＡＰＤ与ＩＳＳＲ标记技术都曾用于柱花草属植物的遗传多样性研究［１０，１８］，ＲＡＰＤ方法简单、成本低，但重复
性较差、检测位点不多；ＩＳＳＲ是一种重复性好，效率高的分子标记，而且引物具有通用性，其不足之处在于ＰＣＲ
扩增反应的最适条件需要一定时间摸索［１９］。
ＳＲＡＰ多态性好，效果稳定。具有简便、稳定、中等产率、高共显性、易于测序等优点。它利用独特的引物设
计对ＯＲＦｓ进行扩增，正、反引物分别与外显子和内含子（或启动子）区域配对，因不同物种、不同个体的内含子、
启动子与间隔区长度不等而产生多态性。可以弥补ＲＡＰＤ与ＩＳＳＲ标记技术的不足。
利用ＳＲＡＰ技术的研究结果与ＲＡＰＤ和ＩＳＳＲ标记技术在柱花草属植物的遗传多样性的研究结果相吻合，
研究表明柱花草属植物存在着丰富的遗传变异。西卡柱花草与有钩柱花草遗传关系较近，其他圭亚那种（格拉
姆、热研２号、热研５号，热研１０号，热研１３号、白花库克、Ｔａｒｄｉｏ柱花草）在同一分支上［１０，１８］。
本研究通过ＳＲＡＰ分子标记技术对柱花草属植物的遗传多样性进行研究，结果１４对引物共扩增出１５４条谱
带，其中１５０条多态性谱带，多态性比率（ＰＰＢ）为９７．４０％，不同种质资源间的遗传相似性变异范围很大，为
５６１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
０．３８６～０．８８２。这些结果从分子标记的角度进一步说明了柱花草属植物种质资源间存在丰富的遗传变异。柱花
草属植物丰富的遗传变异为柱花草属植物的优良品系选育、开发和利用提供了空间，对柱花草种质资源的鉴定、
利用及其育种实践等具有一定的参考价值。
３．３ 柱花草属植物遗传多样性的特点
聚类分析的结果表明了供试的柱花草材料的遗传关系与其地理分布、生态类型、形态特征等具有一定的相关
性。这与其他物种应用ＳＲＡＰ分子标记进行多态性检测的研究结果一致［２０２２］。
柱花草属的中心起源地在巴西和哥伦比亚。绝大部分柱花草种分布在南美洲，极少部分在北美洲、非洲及东
南亚和印度，分布非常广泛［１］。从种间关系来看，有钩柱花草与西卡柱花草之间，圭亚那柱花草类之间的遗传相
似系数较高，遗传距离较近，这个结果与蒋昌顺等［１８］，唐燕琼等［１０］的研究结果一致，也认为是与它们的起源和分
布区域相似性有关。有钩柱花草和西卡柱花草的起源与分布区域相似，来源地均为澳大利亚。圭亚那柱花草类
的起源与分布区域相似。其中热研２号、热研５号、热研１０号、热研１３号均由中国热带农业科学院选育而来；而
Ｔａｒｄｉｏ柱花草来源于哥伦比亚，因此它跟其他圭亚那类柱花草的遗传相似系数较低。白花库克和格拉姆柱花草
均来自澳大利亚，它们的遗传相似系数高达０．８２３。
从聚类图上可以看出，９份种源材料并不是完全按照种的划分进行聚类的，而出现了交叉聚类现象。热研５
号、热研１０号、热研１３号和白花库克柱花草聚在圭亚那的同一个组；而热研２号和格拉姆柱花草聚在另一个组。
从聚类图上可以发现，虽然白花库克柱花草与热研２号柱花草靠得很近，但它们没有聚在一起。来自于同一地域
的多数资源可以聚在一起，但由于地区间种质资源的交流并通过杂交和选择导致了某些基因在不同地区种质间
的渗入，这使得不同地方的材料被聚合到了一起。最特别的是来自哥伦比亚的Ｔａｒｄｉｏ柱花草。从外部形态看，
Ｔａｒｄｉｏ柱花草与其他圭亚那柱花草类相比，植株矮小，早期生长更慢，其在圭亚那柱花草类中单独为一支，与其
他圭亚那柱花草类的遗传基础差异较大，亲缘关系较远。说明这份材料不但在外部形态上表现出特异性，而且遗
传基质上也存在一些特异的基因，Ｔａｒｄｉｏ柱花草是其中最抗病的一个品种。另外聚类结果在柱花草抗炭疽病特
性方面也有一定的规律。其中热研５号、热研１０号、热研１３号柱花草这些中等以上抗性品种聚为一组，白花库
克、格拉姆柱花草高感品种与中抗品种热研２号聚为一组；而最抗病的Ｔａｒｄｉｏ柱花草单独聚为一组。
圭亚那柱花草是目前世界上栽培面积最大的柱花草属植物，也是柱花草属中分支最多、起源最早、分布最广
和遗传多样性最丰富的一类［２３，２４］。在全球范围内推广种植的柱花草品种中，约有２１个栽培品种属于圭亚那柱
花草种［２５］。本结果也体现和验证了这一点。聚类结果将形态上与其他的柱花草相差较大的有钩柱花草（叶子细
长，种子有钩）和西卡柱花草（叶子较大，叶上长有绒毛）分为２类；绝大多数形态没有特殊差异的材料（如圭亚那
柱花草类），通过ＳＲＡＰ分子标记聚类分析也能将其区分开来。
３．４ ＳＲＡＰ分子标记技术可以有效地应用于柱花草植物遗传多样性的研究
本研究应用ＳＲＡＰ分子标记技术对９份柱花草属植物的遗传多样性进行研究，１４对引物扩增出１５４条清晰
的用于多样性分析的谱带，其中多态性条带就有１５０条，多态性比率为９７．４０％。这一方面说明了柱花草属植物
不同种质资源间存在着丰富的遗传变异，同时也说明了ＳＲＡＰ分子标记技术在柱花草属植物遗传多样性研究中
有较高的检出效率。
分子标记技术通过直接检测ＤＮＡ本身的序列变化，对种质间的遗传多样性进行研究，被认为是目前最有效
的遗传多样性分析方法。本研究通过ＳＲＡＰ分子标记技术对柱花草属植物的遗传多样性进行研究，通过聚类分
析柱花草材料的遗传关系与其地理分布、生态类型、形态特征以及抗病性等等具有一定的相关性。相对其他作物
丰富的遗传背景来说，柱花草材料起源于国外，我国的育成栽培种较少，因此柱花草育种中应该进一步拓宽育种
的遗传资源，使育成品种的适应性更为广泛，性状更加符合生产的需要。因此通过分子标记做出聚类图可以较好
地反映柱花草材料的区域特征，快速地评价材料的类型并且服务于育种，可以有效地缩短育种时间，提高育种效
率。这些都体现出ＳＲＡＰ分子标记技术在柱花草属植物遗传多样性研究中的优越性和有效性。本研究结论为
ＳＲＡＰ分子标记技术在柱花草属植物进一步研究中的应用奠定了良好的基础。
６６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４
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狊犲犪犫狉犪狀犪，ａｎｄ犛．犳狉狌狋犻犮狅狊犪ｂｙＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｗｏｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｒｅｇｉｏｎｓ［Ｊ］．ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅ，１９９９，（３）：１９９２０２．
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ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，９９：１１７９１１８６．
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ｑｕｅｎｃｅｔａｇｇｅｄｓｉｔｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，９８：１０５４１０６２．
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７６１第２０卷第４期 草业学报２０１１年
犗狆狋犻犿犻狕犪狋犻狅狀狅犳犛犚犃犘－犘犆犚狊狔狊狋犲犿犪狀犱犻狋狊犪狆狆犾犻犮犪狋犻狅狀犻狀犵犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊
ＺＨＡＮＧＷｅｉｌｉ１，ＬＩＵＦｅｎｇｍｉｎ２，ＬＩＵＡｉ３
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＺｈｏｎｇｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ
５１０２２５，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｅａｃｈｉｎｇａｎｄＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅｒｃｈＢａｓｅ，ＺｈｏｎｇｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
ａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＬａｎｄｓｃａｐｅ
Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，ＺｈｏｎｇｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｇｅｒｍｐｌａｓｍ，犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．２ａｎｄ犛．犵狌犻犪狀犲狀
狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１３ｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＭｇ２＋，ｄＮＴＰｓ，ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｐｒｉｍｅｒｓａｎｄＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｏｎｔｈｅＳＲＡＰ－ＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆ
ＳＲＡＰｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｙｓｔｅｍｉｎ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｓｙｓｔｅｍｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｓｆｏｌｏｗｓ：ｔｅｍｐｌａｔｅ
ＤＮＡ４０ｎｇ，Ｍｇ２＋２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１Ｕ，ｐｒｉｍｅｒ０．３μｍｏｌ／Ｌ，ｔｈｅｔｏｔａｌｒｅａｃｔｉｏｎ
ｖｏｌｕｍｅｗａｓ２５μＬ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆｎｉｎｅ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙ
ｕｓｉｎｇｔｈｉｓｏｐｔｉｍｕｍｓｙｓｔｅｍ．ＦｏｒｔｙｅｉｇｈｔｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｆｏｒａｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｂｙＳＲＡＰｉｎ
犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ．Ｆｏｕｒｔｅｅｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｐｒｉｍｅｒｓｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ４８ｐｒｉｍｅｒｓｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒＳＲＡＰ
－ＰＣＲ，ａｎｄ１５０ｏｆｔｈｅ１５４ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄ，ｓｈｏｗｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｂｉｎｄｓｆｒｏｍｅａｃｈ
ｐｒｉｍｅｒｗａｓ１１．０ａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓｗａｓ９７．３６％．ＴｈｅＮｅｉ’ｓｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ
ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｔｈｅｔｅｓｔｅｄａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．３８６ｔｏ０．８８２ｂｙｓｏｆｔｗａｒｅＮＴＳＹＳｐｃ２．１ｂａｓｅｄｏｎＳＲＡＰ
ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅＮｅｉ’ｓｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｗａｓ０．６３１，ａｖｅｒａｇｅｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅ（ＧＤ）ｗａｓ０．３６９．Ｂａｓｅｄｏｎ
ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｂａｎｄｓ，ｎｉｎｅ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｇｅｒｍｐｌａｓｍｗｅｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎｔｏｔｈｅｒｅｍａｊｏｒｇｒｏｕｐｓｂｙＵＰＧＭＡｃｌｕｓｔｅｒ
ａｎａｌｙｓｉｓ，ｇｒｏｕｐⅠ，ｇｒｏｕｐⅡａｎｄｇｒｏｕｐⅢ．ＧｒｏｕｐⅠｉｎｃｌｕｄｅｄ犛．犺犪犿犪狋犪ｃｖ．Ｖｅｒａｎｏ，ａｎｄｇｒｏｕｐⅡｉｎｃｌｕｄｅｄ
犛．狊犮犪犫狉犪ｃｖ．Ｓｅｃａ．ＧｒｏｕｐⅢｉｎｃｌｕｄｅｄ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．５，犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１０，犛．
犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．１３，犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｗｈｉｔｅｃｏｏｋ，犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．２，犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．
Ｇｒａｈａｍａｎｄ犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｔａｒｄｉｏＣＩＡＴ１２８３．Ｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｓｈｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｂａｓｉｓａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｌｅｖｅｌｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｉｎｅ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ．Ｔｈｅｍｏｓｔｏｆｔｈｅｖａｒｉｅｔｉｅｓｗｉｔｈｒｅｌａ
ｔｉｖｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｉｎｔｈｅｉｒｐｅｄｉｇｒｅｅｓａｎｄｓｉｍｉｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｅｒｅｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓａｍｅｇｒｏｕｐ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊；ＳＲＡＰ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
８６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４