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Antagonistic effect of actinomycetes D01 against four strains potato pathogens

放线菌D01对马铃薯4种病原真菌的抑菌作用



全 文 :放线菌犇01对马铃薯4种病原真菌的抑菌作用
陈淑琴,王生荣
(甘肃农业大学草业学院,甘肃 兰州730070)
摘要:采用PDA平板对峙法、生长速率法等方法,研究了放线菌D01对马铃薯干腐病菌、马铃薯黑痣病菌、马铃薯
炭疽病菌和马铃薯早疫病菌4种病原真菌的抑菌活性。结果表明,放线菌D01对4种病原真菌均表现出显著的抑
菌活性,发酵液抑菌率均在70%以上;经放线菌处理后,病原真菌的基内菌丝不同程度的发生了畸变;放线菌D01
对供试靶标真菌均有显著的拮抗作用,其中对马铃薯干腐病菌和马铃薯黑痣病菌的持续抑菌作用最强。
关键词:放线菌;病原真菌;马铃薯;抑菌活性
中图分类号:S435.3  文献标识码:A  文章编号:10045759(2014)05036505
犇犗犐:10.11686/cyxb20140544  
  甘肃省是全国马铃薯(犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿)主产区之一,省内大部分地区适宜马铃薯种植,主要分布在甘肃
中东部地区的大部分山地和张掖、武威等地海拔1700m左右的沙性土壤地区[12],随着种植面积的不断扩大,马
铃薯产业已经发展成为甘肃省贫困地区群众脱贫致富的一个主导产业。而近年来马铃薯真菌病害的普遍发生,
已成为影响马铃薯产量与质量的严重障碍。目前马铃薯生产中主要依靠化学农药来防治,但化学农药的长期频
繁使用已导致病菌抗药性逐渐增强、环境污染日益严重[3]。而拮抗性微生物是生物农药的重要来源,其中放线菌
是具有巨大应用价值的微生物类群,已有研究表明放线菌能产生许多重要生理活性物质,如抗生素类物质、植物
生长促进物质、植物生长抑制物质以及具有新特性的酶类,在农业生产和医药新药的筛选上显示出广阔的应用前
景[49]。放线菌作为农用抗生素的主要产生菌在植物病害的生物防治中占有重要的地位,是新医药、新农药和生
物防治活菌制剂的源头[1013],在目前10000多种微生物的生物制剂中,有50%以上是放线菌产生的[1416],应用放
线菌的生物资源有着巨大的社会效益和生态效益。
近年来,利用拮抗微生物尤其是真菌、细菌及其代谢产物控制植物病害已有一些报道[10],但利用放线菌及其
代谢产物抑制的报道还不多见。本文采用平板对峙法等对分离自马铃薯田的放线菌菌株D01对马铃薯4种病
原真菌皿内抑菌效果进行了测定,目的是为马铃薯真菌性病害生物防治提供新的途径和科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试靶标病原菌,马铃薯干腐病菌(犉狌狊犪狉犻狌犿spp.)、马铃薯黑痣病菌(犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻)、马铃薯炭疽病菌
(犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犮狅犮犮狅犱犲狊)、马铃薯早疫病菌(犃犾狋犲狉狀犪狉犻犪狊狅犾犪狀犻),均由甘肃农业大学植物病理学实验室2012年4
月到2012年8月分离得到。
放线菌D01的来源,分离自甘肃省主要马铃薯种植区土壤样品(2012年6月采自甘肃省定西市陇西县巩
昌),经过初步生理生化测定并测序鉴定(另文发表),编号为D01。
培养基,①PDA培养基,②高氏一号培养基,③液体发酵培养基:1%小米浸出汁1000mL、葡萄糖10.0g、蛋
白胨3.0g、NaCl2.5g、CaCO32.0g、pH值7.2~7.4。
1.2 方法
1)供试病原菌及放线菌的活化培养
第23卷 第5期
Vol.23,No.5
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA   
365-369
2014年10月
收稿日期:20130926;改回日期:20131205
基金项目:甘肃省科技厅重大科技专项(1102NKDM025)和科技部项目(2012BAD06B03)资助。
作者简介:陈淑琴(1988),女,甘肃白银人,在读硕士。Email:csq8899chenxi@163.com
通讯作者。Email:wangsr@gsau.edu.cn
4种病原真菌进行活化培养,无菌条件下,将病原菌菌种接种在PDA平板培养基上,25℃恒温培养3~4d,
备用。将保存的放线菌D01在高氏一号培养基上进行划线培养,28℃恒温培养4d,备用。
2)抑菌活性测定
①平板对峙法:在无菌操作条件下,倒PDA平板,冷却,用直径6mm的打孔器分别打病原菌和放线菌菌饼。
将病原菌接种在PDA平板中间,28℃培养1d后,然后在距离病原菌十字对称25mm处接种放线菌菌饼[17],每
处理3次重复,28℃恒温培养4d,观察记录对照菌落直径与处理后靶标真菌菌落直径,两者之差为抑菌带宽度。
②放线菌的发酵培养:放线菌菌株D01在高氏一号平板培养基28℃培养4d,按5%的量接种于250mL三角瓶
内的50mL的液体发酵培养基内,28℃,180r/min恒温振荡培养7d[18]。发酵液在4℃、10000r/min离心20
min,上清液4℃储存备用。③抑制菌丝生长速率法:PDA培养基分装灭菌,待冷却到55℃时,将放线菌菌株发酵
液与PDA培养基按1∶9的比例混匀,倒入无菌培养皿中制成含发酵液培养基。培养基凝固后,在每个培养基平
面接入靶标菌菌饼,将菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面,每处理3次重复。培养3~4d后,用十字交叉法测定
菌落直径,计算抑菌率[19]。
抑菌率(%)=(1-处理供试菌菌落直径/对照供试菌菌落直径)×100%
3)受抑菌丝显微观察
在被抑制的菌落边缘,挑取少量靶标真菌基内菌丝,镜检观察菌丝受抑制情况,并进行显微照相。
4)受抑菌丝再生能力测定
从被抑制的菌落边缘,挑取少量靶标真菌基内菌丝接种于PDA平板上,以正常基内菌丝为对照,28℃下培
养,每24h观察菌落生长情况,测量并记录菌落直径,确定受抑制靶标真菌菌丝的再生能力[1516],每处理3次重复。
2 结果与分析
2.1 放线菌D01对4种马铃薯病原真菌的抑制效果
采用平板对峙法、发酵液抑制菌丝生长速率法测定了放线菌D01对4种靶标真菌的抑菌作用,平板对峙培
养结果(表1)表明,放线菌D01对4种靶标真菌均具有显著的抑制作用,抑菌带宽度均大于15mm。生长速率法
培养结果(表1)也表明,放线菌D01对马铃薯黑痣病菌、马铃薯早疫病菌表现出显著的抑制作用,抑制率均大于
80%,对马铃薯干腐病菌、马铃薯炭疽病菌也有较显著的抑制效果,抑制率均在70%~75%之间。总体可以看
出,放线菌对马铃薯的4种病菌表现出了稳定的抑菌作用。
表1 放线菌犇01对4种靶标真菌的皿内抑制作用
犜犪犫犾犲1 犐狀犺犻犫犻狋犻狀犵犲犳犳犲犮狋狊狅犳犪犮狋犻狀狅犿狔犮犲狋犲狊犇01狅狀4狋犪狉犵犲狋狆犪狋犺狅犵犲狀狊
靶标真菌
Targetpathogens
对照菌落直径
CKcolony
diameter
(mm)
平板对峙法
ConfrontingincubationonPDAplates
菌落直径
Colonydiameter(mm)
抑菌带宽
Inhibitionzone(mm)
生长速率法
Detectingthefungigrowthrate
菌落直径
Colonydiameter(mm)
抑制率
Inhibitingratio(%)
马铃薯干腐病菌犉狌狊犪狉犻狌犿spp. 50.0 32.0 18.0b 15.0 70.0b
马铃薯早疫病菌犃犾狋犲狉狀犪狉犻犪狊狅犾犪狀犻 43.0 20.0 23.0a 8.7 81.7a
马铃薯黑痣病菌犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻 45.3 21.0 24.3a 8.3 81.6a
马铃薯炭疽病菌犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犮狅犮犮狅犱犲狊 36.0 17.0 19.0b 10.3 71.4b
2.2 受抑菌丝的形态变化
显微观察发现,受抑制靶标真菌的菌丝形态均发生了显著的变化,但变化的细微处不同,放线菌作用于马铃
薯黑痣病菌和马铃薯早疫病菌后,观察到其基内菌丝表现畸形,菌丝变粗,顶端变圆,隔膜增多等畸变现象(图
1)。而马铃薯干腐病菌和马铃薯炭疽病菌在受到放线菌抑制后,镜检可以发现其基内菌丝的细胞壁被消解,原生
663 ACTAPRATACULTURAESINICA(2014) Vol.23,No.5
质浓缩,菌丝尖端膨大等(图2)。由此可以看出,经放线菌处理以后,靶标真菌的基内菌丝发生了不同程度的畸
变,而且会随着处理时间的延长而程度加深。
2.3 受抑制菌丝的再生能力测定
测定靶标真菌受抑制的菌丝能否恢复生长能力,也就是放线菌对靶标真菌是否具有持续抑菌作用,结果表
明,被抑制的马铃薯干腐病菌和马铃薯早疫病菌菌丝在正常条件下仍然可以恢复生长,但生长速率缓慢,菌落比
对照稀疏,日生长量远低于对照(图3,图4);马铃薯炭疽病菌受D01抑制后,被抑制的菌丝在48h后才缓慢恢复
生长,但生长量小,且菌落颜色加深(图5);马铃薯黑痣病菌受D01抑制后,受抑制的菌丝在正常条件下生长明显
缓慢,24h内生长量为零,此后逐渐缓慢恢复生长(图6)。放线菌D01对马铃薯的4种病原真菌不同程度的表现
了持续抑菌作用。
图1 放线菌犇01对马铃薯黑痣病菌的作用
犉犻犵.1 犐狀犺犻犫犻狋犻狀犵犲犳犳犲犮狋狊狅狀犚.狊狅犾犪狀犻
A.CK菌丝体Normalmycelium;B.抑制后的菌丝体Inhibitingmycelium;C.CK;D.皿内拮抗作用Antifungalactivityinpetridishes.
 
图2 放线菌犇01对马铃薯干腐病菌的作用
犉犻犵.2 犐狀犺犻犫犻狋犻狀犵犲犳犳犲犮狋狊狅狀犉狌狊犪狉犻狌犿狊狆狆.
A.CK菌丝体Normalmycelium;B.抑制后的菌丝体Inhibitingmycelium;C.CK;D.皿内拮抗作用Antifungalactivityinpetridishes.
 
图3 干腐病菌受抑制后菌丝再生能力的变化
犉犻犵.3 犌狉狅狑狋犺狅犳犿狔犮犲犾犻狌犿狅犳犉狌狊犪狉犻狌犿狊狆狆.
 
图4 早疫病菌受抑制后菌丝再生能力的变化
犉犻犵.4 犌狉狅狑狋犺狅犳犿狔犮犲犾犻狌犿狅犳犃.狊狅犾犪狀犻
 
763第23卷第5期 草业学报2014年
图5 炭疽病菌受抑制后菌丝再生能力的变化
犉犻犵.5 犌狉狅狑狋犺狅犳犿狔犮犲犾犻狌犿狅犳犆.犮狅犮犮狅犱犲狊 
图6 黑痣病菌受抑制后菌丝再生能力的变化
犉犻犵.6 犌狉狅狑狋犺狅犳犿狔犮犲犾犻狌犿狅犳犚.狊狅犾犪狀犻 
3 结论与讨论
1)平板对峙法和生长速率法的结果表明,放线菌D01对4种马铃薯病原菌均有较强的抑制作用,其中放线
菌D01对马铃薯黑痣病菌和马铃薯早疫病菌表现出了显著的抑菌效果,抑菌带较宽,均大于20.0mm,发酵液提
取物的抑菌率也都大于80%;而对马铃薯炭疽病菌和马铃薯干腐病菌也有较显著的抑制作用,拮抗带宽度也都
在15.0~20.0mm,发酵液提取物的抑菌率也都在70%~75%。
2)受抑制菌丝的显微观察和再生能力的测定结果表明,放线菌D01对4种马铃薯病原真菌均表现出较显著
的持续作用,对受抑制菌丝观察也发现,放线菌可能产生或者分泌了某种物质,使得靶标真菌的菌丝发生畸变,从
而达到对靶标真菌的持续抑制效果。放线菌可能合成了多种抗生素,干扰了病原菌的代谢作用,影响病原菌的形
态结构;或者分泌了某种细胞壁降解酶类或有毒的次生代谢产物,导致细胞破裂,菌丝尖端几丁质呈裸露状态,生
长受阻,从而抑制病原菌的发生发展。
目前,对放线菌作用于植物病害防治的研究已经取得了很大进展,但应用的过程中还存在一些问题。诸如有
很多放线菌在实验室中生防效果良好,但在大田试验中不尽人意;放线菌活菌制剂在田间的不稳定性;部分放线
菌抗菌谱较窄,应用价值也比较低等等。分子生物学、遗传学等多种手段的应用,将会进一步明确放线菌的生防
机制,进行菌种改良与高效筛选,使其更好地投入到农业生产实践中。
参考文献:
[1] 牛秀群,李金花,张俊莲,等.甘肃省干旱灌区连作马铃薯根际土壤中镰刀菌的变化[J].草业学报,2011,20(4):236243.
[2] 范士杰,王蒂,张俊莲,等.不同栽培方式对马铃薯土壤水分状况和产量的影响[J].草业学报,2012,21(2):271279.
[3] 徐久志.马铃薯真菌病害的症状与防治措施[J].现代农业科技,2011,14:178180.
[4] AndersonAS.Thetaxonomyofstreptomycesandrelatedgenera[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMi
crobiology,2001,51:797814.
[5] HopwoodDA.Streptomycesgenes:from WaksmantoSanger[J].JournalofIndustrialMicrobiology& Biotechnology,
2003,30:468471.
[6] WatveMG,TickooR.HowmuchantibioticsareproducedbythegenusStreptomyces[J].Microbiology,2001,176:386
390.
[7] 阮继生,刘志恒,梁丽糯,等.放线菌研究与应用[M].北京:科学出版社,1990.
[8] 方羽声,杨坚华,张洪玲,等.放线菌对4种病原真菌的拮抗作用初探[J].广东农业科学,2001,5:3941.
[9] 张茹,李金花,柴兆祥,等.甘肃河西马铃薯根生防木霉菌对接骨木镰刀菌的拮抗筛选及鉴定[J].草业学报,2009,18(2):
138145.
[10] 乔红萍,宗兆峰.用重寄生菌防治植物病害[J].中国生物防治,2002,18(4):176179.
863 ACTAPRATACULTURAESINICA(2014) Vol.23,No.5
[11] 安德荣,慕小倩,刘翠娟,等.土壤拮抗放线菌的分类和筛选[J].微生物学杂志,2002,22(5):13.
[12] 吴艳辉,赵春田,裘娟萍.植物病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定[J].农药,2010,49(2):146149.
[13] 胡艳梅,杨龙.利用微生物防治植物病害的研究进展[J].中国生物防治,2006,22:190193.
[14] ZimandG,EladY,ChetI.Effectof犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犺犪狉狕犻犪狀狌犿on犅狅狋狉狔狋犻狊犮犻狀犲狉犲犪pathogenicity[J].Phytopathology,1996,
86(11):12551260.
[15] 韩立荣,赵科刚,顾彪,等.5株放线菌对9种靶标病原真菌的持续抑菌作用[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),
2006,34(2):5356.
[16] 方中达.植病研究方法[M].北京:中国农业出版社,1998.
[17] GethaK,VikineswaryS.Antagonisticeffects犛狋狉犲狆狋狅犿狔犮犲狊狏犻狅犾犪犮犲狌狊狀犻犵犲狉strainG10on犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿f.sp.
cubenserace4:indirectevidencefortheroleofantibiosisintheantagonisticprocess[J].JournalofIndustrialMicrobiology,
2002,28:303310.
[18] 李丽梅.植物病原真菌拮抗放线菌的筛选及其发酵条件研[D].沈阳:沈阳农业大学,2006.
[19] 潘争艳,刘伟成,裘季艳,等.放线菌6和 A21对蔬菜枯萎病和灰霉病的控制作用[J].华北农学报,2005,20(4):92
97.
犃狀狋犪犵狅狀犻狊狋犻犮犲犳犳犲犮狋狅犳犪犮狋犻狀狅犿狔犮犲狋犲狊犇01犪犵犪犻狀狊狋犳狅狌狉狊狋狉犪犻狀狊狆狅狋犪狋狅狆犪狋犺狅犵犲狀狊
CHENShuqin,WANGShengrong
(ColegeofPrataculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:FungistaticactivityofactinomycetesstrainD01on犉狌狊犪狉犻狌犿spp.,犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻,犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻
犮犺狌犿犮狅犮犮狅犱犲狊and犃犾狋犲狉狀犪狉犻犪狊狅犾犪狀犻wasstudiedbyconfrontingincubationonPDAplates,andassessingthe
fungigrowthrates.Aninhibitionratioofmorethan70%tofourpotatofungalpathogenswasgainedbyD01.
Substratemyceliumoftargetpathogenssuppressedwithantagonisticactinomyceteshadbeendeformedor
lysed.ActinomycetesD01showedpersistentinhibitioneffectsonthetargetpathogensindifferentdegrees,es
pecialyon犆.犮狅犮犮狅犱犲狊and犚.狊狅犾犪狀犻.
犓犲狔狑狅狉犱狊:actinomycetes;pathogenicfungi;potato;antibioticactivity
963第23卷第5期 草业学报2014年