全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"#$&, *
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!!文章编号!$##$($)*&""#$%##(#&,(#,
杜仲基因组微卫星特征及 **@标记开发
吴!敏$!"! 杜红岩$!"!!! 乌云塔娜$!"!! 刘攀峰$!"!! 荆!腾$!"
"$8中国林业科学研究院经济林研究开发中心!河南 郑州!)%###( "8国家林业局杜仲工程技术研究中心!河南 郑州!)%###(
8国家林业局泡桐研究开发中心!河南 郑州!)%####
收稿日期$ "#$)(#)(#
基金项目$ 国家林业公益性行业科研专项$杜仲育种群体建立与综合利用技术研究""#$##)#"*#
作者简介$ 吴敏!硕士研究生!研究方向$经济林栽培和育种80(1234$X136
通讯作者$研究员!博士生导师!主要从事杜仲育种.栽培与综合利用的研究8QA5%$%7$"+89:1
摘要!为全面解读杜仲的遗传背景!本研究在基因组测序"数据未公布#的基础上!通过 T`CB软件搜索杜仲基因组
""+ *),K&%) ,%& $+# GH#中的完整型"$ , 核苷酸重复#及复合型 CCS序列!共查找出 "% +*) 个 C92>:4Q<含有 )&&
%*" 个 CCS位点!占总 C92>:4Q<的 *%8I+ 从 CCS位点分布密度上讲!平均每 $ ,)* GH出现 $ 个微卫星!其中单核
苷酸重复单元的 CCS含量最多!约占总数的 %)8)I!其次为二核苷酸 ""#8),I#!而复合模式.三核苷酸.四核苷
酸.五核苷酸.六核苷酸和七核苷酸重复分别占 "#8"*I."8&*I.#8,,I.#8$I.#8$#I和 #8#$I!并发现 CCS中
均以含B.D的重复类型占主导地位+ 根据 CCS位点设计并合成引物 "*# 对! $+" 对 CCS引物扩增出清晰的目的条
带!其中 $+ 对引物多态性高.稳定性好!在 & 份杜仲资源中共检测到 &) 个等位基因!平均每个 CCS位点检测到 %8"%
个等位基因+ 本研究对于进一步利用 CCS分子标记分析杜仲遗传多样性.遗传图谱构建.杜仲雌雄株早期鉴定等具
有较高的应用价值+
关键词! 杜仲(基因组(CCS(标记开发(多态性
中图分类号!C,$&L)+ 文献标识码!B
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9:1H:=6Q CCSO:1@=)"BB6( R?6:1?""+!*),K&%)!,%&!$+# GH# G5=<36R` TCB8)&&!
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@A2@?[?O5$ ,)* GH 9:6@236?Q :6?CCS139O:<2@?43@?:6 @A?2[?O2R?8DA?CCS
:>9:1H:=6Q CCS! @O36=94?:@3Q?O?H?2@26Q A?H@26=94?:@3Q?
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
<@O=9@36RR?6?@3912H! 26Q 3Q?6@3>536R?2O45A,1 B#3)"$ @=)"BB6( =JB"6G$%( R?6:1?( CCS( 12OW?OQ?[?4:H1?6@( H:451:OHA3<1
CCS"<31H4?个!甚至更多核苷酸为基本单位组成的串联重复序
列片段!又称微卫星 EJB"139O:<2@?43@?EJB#!其最
常见的重复片段为 $ + 个核苷酸的重复序列!也
有少数 , 个核苷酸甚至更多核苷酸的重复序列!其
长度大多在 "## GH以内!普遍存在于真核生物和原
核生物基因组中,$!"- !分布于编码区和非编码区,- +
研究表明!CCS在植物种间.种内居群间乃至个体间
均存在高度多态性!且不同物种的 CCS序列在组成.
长度.突变率及在染色体上的分布情况表现出高度
的多态性!反映了高度的等位基因多样性,)- + 不同
的遗传材料在某一 CCS位点重复次数上的差异可导
致该 CCS位点长度的多态性!且在 CCS位点两侧有
一段相当保守的单拷贝序列!根据此保守序列设计
F-S引物能够精确检测出 CCS位点的长度多态性+
CCS标记主要包括基因组 CCS"R?6:139CCS#和表达
序列标签 CCS"0CD(CCS#+ CCS分子标记技术具有
共显性.数量多.范围广.多态性高等优点!并在近几
十年的不断发展中得到了广泛的应用!是基因定位.
构建遗传连锁图谱和指纹数据库.品种鉴定.群体遗
传学研究及分子标记辅助育种等工作的理想
工具,% /,- +
杜仲"@=)"BB6( =JB"6G$%!"6 l)#!属杜仲科
"0=9:11329?2?#杜仲属"@=)"BB6(#!为单科单属单
种,&- !雌雄异株.多年生落叶乔木!是我国特有的名
贵经济树种+ 杜仲既是十分重要的优质天然橡胶资
源!又是名贵药材和工业原料!同时也能够改善生态
环境.增加碳汇储量,*- + 我国拥有世界 **I的杜仲
资源!具有独特的资源优势+ 目前杜仲的遗传背景
并不完全清晰!这给种质资源保存.杜仲良种选育.
杂交育种等带来很大困难+ BUNF.SBFE.TCCS等分
子标记的应用在一定程度上促进了杜仲遗传多样
性.品种改良和种质创新等研究,$# /$)- !在利用 CCS
分子标记研究方面!E?6R等利用 UTBC-\法开发了
$* 对具有多态性的 CCS引物!及中国林业科学研究
院经济林研发中心开发了 "# 对0CD(CCS引物!经验
证其中仅 $# 对 CCS引物得到成功扩增!难以满足研
究需要,$%- + 为此!本研究在采用 _3C?Y. 3`C?Y 及第
三代测序技术 F29.3:对杜仲基因组深度测序的基
础上!对数据进行系统分析!开发了杜仲 R?6:139
CCS<引物!为杜仲种质资源鉴定.遗传多样性分析
及分子标记辅助育种等研究提供更为丰富详尽的背
景资料+
$!材料与方法
C8CD植物材料
$8$8$!基因组测序材料!叶片样本采自湖北神农
架一株树龄 "## 多年的杜仲雄株"编号 $"##$p#!疑
似野生杜仲,$"- !液氮速冻后送武汉未来组生物科技
有限公司"J?;@:139<#进行基因组测序+
$8$8"!引物筛选供试材料!本研究引物筛选所用
的 & 份杜仲样品来自中国林业科学研究院经济林研
究开发中心杜仲基因库"表 $#!于 "#$ 年 + 月初采
集健壮.无病虫害的嫩叶!液氮保存带回实验室! /
&#b保存以备提取EJB+
表 CD杜仲试验材料
序号 样品编号 来源 经度K0 纬度KJ 海拔K1 气候类型
$ $"##$p 湖北神农架 $$#c$#d)+{ $c")d$,{ $ $+ 亚热带季风气候!!!
" _:6R1= 河南原阳! $$c)+d"&{ )c%%d+{ $#+ 暖温带大陆性季风气候
$#+##- 河南洛阳! $$"c"%d$){ )c*d%+{ $%* 暖温带大陆性季风气候
) $#%*#p 河南三门峡 $$#c*d,{ )c$+d$&{ $ #," 暖温带大陆性季风气候
% $#%&+- 河南洛阳! $$"c"%d$){ )c*d%+{ $%* 暖温带大陆性季风气候
+ $#%&,p 湖南江垭! $$#c,,d"{ "*c%$d$,{ $%* 亚热带季风性湿润气候
, $#+#$p 河南洛阳! $$"c"%d$){ )c*d%+{ $%* 暖温带大陆性季风气候
& $#%&%p 河南南阳! $$$c%&d"{ "c)&d$+{ "$& 季风大陆半湿润气候!
C8FD研究方法
$8"8$!基因组EJB提取及浓度测定!采用天根生
物公司"北京#新型植物基因组提取试剂盒"EF"#
/#"#提取杜仲基因组 EJB!$8%I琼脂糖凝胶电泳
检测EJB的质量! EJB样品上样量
"
N!电泳结束
后用.3:(S?Q P?4E:9pSy凝胶成像系统进行观察.
&&
第 期 吴!敏等$杜仲基因组微卫星特征及 CCS标记开发
拍照(紫外分光光度计检测 EJB含量及纯度!.
1hS
V
.
1RS
值在 $L& "L# 范围内的样品!统一浓度至
)# 6R0
"
N
/$置于/"#b保存备用+
$8"8"!杜仲基因组 CCS位点的查找!利用 T`CB
软件对杜仲基因组序列进行 CCS位点查找! T`CB软
件能识别出序列中的单核苷酸 CCS和复合 CCS及
所在的位点+ 查找标准$单.二.三.四.五.六.七核
苷酸重复单元重复次数分别大于 $#.+.%.%.%.%.%
次!并且 CCS侧翼序列长度大于等于 %# GH+
$8"8!引物设计和评价!针对整个基因组中出现
次数相对较少的 CCS位点!利用 FO31?O " A@H8$KK
HO31?O8=@8??K#进行引物设计!并利用 \43R:, 对引
物进行评价+ 引物设计主要参数为$ $# 引物长度$
$& "% GH ("# P-含量$)# +#I(#预期扩增产
物长度$$## ## GH ()#/端
+
P绝对值不超过 *!
而 %/端和中间
+
P值相对较高(%#引物二聚体和发
夹结构的
+
P小于 )8% W92401:4/$+
$8"8)!F-S扩增!引物由生工生物工程"上海#股
份有限公司合成!引物扩增所用的 " fD2Y F-S 2`<(
@?O` 3;购自于天根生化科技"北京#有限公司+ F-S
反应体系为$ 2`<@?O` 3;&
"
N!HO31?O$.HO31?O" .模版
EJB各 #8&
"
N!加入 QQ_
"
\将体系补至 "#
"
N
,$%-
+
利用.3:(S2Q基因扩增仪"D$###进行 F-S扩增!循
环体系为$$#*)b预变性 136("#*)b变性 # <(
#D
1
b退火 # <()#,"b延伸 $ 136(%#返回第二
步!重复 "* 个循环(+#)b保存!并在 ") 小时内电泳
检测+
$8"8%!聚丙烯酰胺电泳检测!利用.3:/S2Q 迷你
小型垂直电泳槽"$+%(&##$#进行 +I非变性聚丙烯
酰胺凝胶电泳检测F-S扩增产物!$&# e电泳 )#
%# 136!电泳结束后用 P?4O?Q 荧光染料"美国#染色
# +# 136! .3:(S?Q P?4E:9pSy凝胶成像系统
进行观察拍照+
$8"8+!数据统计与分析!统计稳定且易于区分的
目的条带"忽略杂带和弱带#+ 用 F\FP0J0" 软
件计算具有多态性的 CCS位点的等位基因数"7(#!
有效等位基因数 " 7$#!J?3/ C 基因多样性 " *#和
CA266:6信息指数"4#+
"!结果与分析
FECD杜仲基因组**@位点的查找
本研究对杜仲基因组中 $ , 核苷酸重复完整
型和复合型 CCS进行查找分析+ 当前组装的杜仲基
因组""+ *),K&%) ,%& $+# GH#!平均每条 <92>:4Q 长
度为 $ ,"# GH!共查找出 "% +*) 个 C92>:4Q 含有
CCS位点")&& %*" 个#!占总 C92>:4Q 的 *%8I!平
均每一条 C92>:4Q含有 $& 个 CCS位点!只含有 $ 个
CCS位点的 C92>:4Q有 $# ,#+ 条"表 "#+ )&& %*" 个
CCS位点中复合模式的 CCS为 ** $+) 个!其中部分
微卫星信息见表 +
表 FD杜仲基因组**@分布统计
J=1G?OKC3Z?
D:@24?;2136?Q D:@243Q?6@3>3?Q CCS )&& %*"
C?Y=?69?<9:6@236 CCS" l$# $# ,#+
C?Y=?69?<9:6@236 CCS" v$# $) *&&
表 HD杜仲基因组**@数据库的部分结果
<92>:4Q TE CCS类型 重复单元 CCS长度
<92>:4Qz<3Z?,#+)#* 单核苷酸 "B#$# $#
<92>:4Q$)&,z<3Z?$#,*& 单核苷酸 "D#%& %&
<92>:4Q$*+&z<3Z?"+%+*% 二核苷酸 "D-#+ $"
<92>:4Q"%&"z<3Z?$#%#,# 二核苷酸 "DB#%, $$)
<92>:4Qz<3Z?,#+)#* 三核苷酸 "PBB#% $%
<92>:4Q"z<3Z?&**,%) 三核苷酸 "BBD#,* ",
<92>:4Qz<3Z?,#+)#* 四核苷酸 "BBBD#% "#
<92>:4Q++"z<3Z?)"$++ 四核苷酸 "BBDP#+) $*"
<92>:4Q&z<3Z?%*&%# 五核苷酸 "BDDDD#% "%
<92>:4Q$&%)z<3Z?$#,#, 五核苷酸 "-B-B-#* )%
<92>:4Q"z<3Z?,$*%# 六核苷酸 "PBBPPP#% #
<92>:4Q+,)z<3Z?$**&") 六核苷酸 "BBBDDB#$ ,&
<92>:4Q++"z<3Z?)"$$+ 七核苷酸 "BBBBBBD#% %
<92>:4Qz<3Z?,#+)#* 七核苷酸 "DDDBBBD#+ )"
<92>:4Q+z<3Z?$)"+&) 复合模式 "D#$#"B#$# "#
<92>:4Q"$#z<3Z?*%,$& 复合模式 "BDB#$$2@9"BDB#$+ &)
F8FD杜仲基因组微卫星组成分析
在杜仲基因组数据库中共查找出 )&& %*" 个
CCS位点!从微卫星分布密度上讲!平均 $ ,)* GH 出
现 $ 个微卫星!CCS的分布频率" CCS的个数与总
<92>:4Q的比值#为 $&8$"+ 其中单碱基重复单元的
CCS含量最多!约占总数的 %)8)I!其次为二核苷
酸 " "#8),I#.复合模式 " "#8"*I#.三核苷酸
"L&*I#.四核苷酸"#8,,I#.五核苷酸"#8$I#.
六核苷酸"#8$#I#.七核苷酸"#8#$I# "表 )#+ 每
种重复单元包含不同种类的重复碱基!单核苷酸重
复 CCS由 ) 种不同的重复碱基组成!其中以 BKD为
主.占单核苷酸重复的 *&8,)I!且 B"$$ ,,%#!D
"$# *)#接近 $$$(二核苷酸重复 CCS组成类型
"$" 种#中BDKDB最多!共 )% *,# 个!占 )%8*,I!其
*&
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
次是 BPKD-""# #,%#占 "#8#&I+(三核苷酸重复
CCS组成类型 " +# 种# 中 BBDKDDB" ) # 占
""L&I!BDDKDBB"" $#)#!占 $$8#&I!BDBKDBD
"" $"##占 $$8$,I(四核苷酸重复 CCS组成类型
"$"& 种 # 中 BBBDKDBBB" $ %#, #! BDDDKDBBB
"%$,#分别占 )#L#I!$8&I(五核苷酸重复 CCS
组成类型 "$," 种#中 BBBBDKDDDDB!BDDDDKDB(
BBB占主导地位!共 )#" 个!占 +%8"+I(六核苷酸
重复 CCS组成类型""** 种#中 BBBBBDKDDDDDB!
PPDDDDK--BBBB!共 ) 个!占 $$8"#I(七核苷酸
重复 CCS组成类型")+ 种#中 BBBBBBDKDDDDDDB
"& 个#!占 $"8$I+
表 ID杜仲基因组中**@重复单元的分布特征
重复类型
CCS
数量
所在比
例KI
发生
频率
主要重复单元
单核苷酸 "+% %" %)8) *8&% BKD!PK-
二核苷酸 ** **$ "#8), 8,$ BDKDB!BPKD-!-DKPB!B-KDP
三核苷酸 $& *&% 8&* #8,#
BBDKDDB!BDDKDBB!BDBKDBD!
DD-KBBP!PBBK-DDDDPKBB-!
D-DKBPB
四核苷酸 ,* #8,, #8$)
BBBDKDBBB!BDDDKDBBB!
BBDBKDDBD!DBDDKBDBB
五核苷酸 +$+ #8$ #8#"
BBBBDKDDDDB!BDDDDKDBBBB!
DDPPPKBB---!DPDPPKB-B--
六核苷酸 %#* #8$# #8#"
BBBBBDKDDDDDB!PPDDDDK
--BBBB
七核苷酸 +% #8#$ #8##
BBBBBBDKDDDDDDB!BBBBBDBK
DDDDDB
复合模式 ** $+) "#8"* 8+&
合计 )&& %*" $## $&8$"
F8HD杜仲基因组微卫星长度分布及变异
本研究中杜仲 R?6:139CCS序列长度变化范围
是 $# ", GH!平均长度为 $%8$, GH !不同类型
CCS长度变化范围差异很大+ 从图 $ 中可以看出!
长度为 $# GH的微卫星所占比例最大""8+#I#!其
次是长度为 $" GH 的微卫星"$)8*%I#!"* GH 的微
卫星仅占 #8$$I!大于等于 $ 的微卫星占 )8&I+
微卫星长度的变异情况揭示了微卫星获得或失
去重复单元速率的快慢程度+ 由图 " 可知!不同重
复 CCS类型中的重复长度不同!且长度的变异较大+
其中单核苷酸 CCS重复单元长度变化范围最大"$#
GH ", GH#!二核苷酸重复 CCS次之" $" GH
$*+ GH#!变异程度最低的为五核苷酸重复微卫星!
仅有 % 种不同微卫星变化长度+ 每种重复 CCS类型
都随着重复长度的递增!微卫星丰度呈递减趋势!即
CCS长度越长!微卫星出现频率越低+
图 $!杜仲基因组不同长度微卫星出现频率
FEID杜仲基因组**@引物的有效性检测
选择 & 份差异较大的杜仲样品进行引物筛选!
合成的 "*# 对R?6:139CCS<引物中共有 $+" 对能扩
增出明显的主条带!其中 % 对引物扩增出的条带大
于目的片段+ 从 $+" 对引物中进一步筛选出了主条
带清晰.多态性高.稳定性好的引物 $+ 对"见表 %#!
部分引物"P0g#*.P0g#,.P0g$*$ .P0g""#的扩
增效果见图 +
F8JD引物多态性分析
筛选出的 $+ 对引物在 & 份杜仲样品中检测到
&) 个等位基因!CCS位点检测到的等位基因数在
, 之间!平均每个 CCS位点检测到 %8"% 个等位基
因+ 目的片段差异最大的是 P0g$%&!F-S产物片
段长度 &, $% GH !目的片段差异最小是P0g",$!
F-S产物片段长度 $+) $&" GH+ "表 %#+
利用 $+ 个 CCS位点对 & 份杜仲样品进行F-S(
CCS检测表明$各位点有效等位基因数分布在 "8$+*
% %8&$& " 之间!平均每个位点的有效等位基因数
为 8)&& #!J?3/<指数"*#的分布范围在 #8%,#
#8,, ) 之间!平均每个位点的 * 值为 #8+*) + 4l
$ /
)
/6"!/6为产物条带的表型!平均每个位点的 4
值为 $8$# #!4值最高为 $8&)# , "P0g#)%#!4值最
低为 #8&+) , "P0g#%+#"表 +#+
!讨论
杜仲基因组微卫星种类丰富!数量多!$ , 核
苷酸的重复及复合型 CCS均有出现!其中单核苷酸
和二核苷酸重复占主导地位!分别占 CCS总数的
%)8)I!"#8),I!七核苷酸重复的微卫星最少!仅
占 #8$#I+ 有研究报道基因组越小!单碱基重复序
列越多!随着物种基因组的增大!其他类型微卫星逐
渐增多,$+ /$,- + 在本研究中杜仲单核苷酸 CCS达到
%)8)I!这可能与目前杜仲基因组数据不完全有很
#*
第 期 吴!敏等$杜仲基因组微卫星特征及 CCS标记开发
图 "!不同长度重复单元微卫星变异情况
表 JD9R**@引物信息
引物 重复单元 CCS类型
CCS长度
KGH
正向引物"%/(/# 反向引物"%/(/#
D
1
Kb
产物范围
C3Z?KGH
P0g#* "DBPB#$# H) )# P--DPBBPP-BDPDDPBBBD PP-B-P-PDB-BD-DD-D-D +#
$%% $&&
P0g#"+ "BDD--DB#+ H, )" -BP--B-D-BBDB--PBBD- -B--BPBPP-B-BBP-BDBB +#
$,# $*,
P0g#, "PDDDDP#, H+ )" DPPDD-DDPPB-BDP-D-DP B-P-BBDD-PBDDB-PDPPD +#
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")* ",)
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林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
图 !引物P0g(#*.P0g#,.P0g$*$.P0g"" 在 & 个优良无性系间的多态性
表 PD杜仲**@位点基因的多样性分析
位点名称N:93 等位基因数 62 有效等位基因数 6? J?3/<基因多样性指数 A CA266:6信息指数T
P0g#* +8### # 8%%% + #8,$& & $8)&& #
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P0g"" ,8### # 8&,& & #8,)" " $8+"& +
P0g"* %8### # 8"## # #8+&, % $8$ ,
P0g",$ ,8### # 8"&" $ #8+*% $8%"+ *
P0g"&* )8### # "8*#* $ #8+%+ " $8"$ #
?`26 %8"%# # 8)&& # #8+*) $8$# #
大关系!也可能与杜仲是孓遗树种!在长期的进化过
程中出现的变异有关+ 微卫星的形成可能与 EJB
复制过程中出现的滑脱.碱基交替以及重组不平衡
有一定的关系!微卫星重复序列"如 PB.-B.PD等
重复#可以通过影响 EJB的结构而影响 EJB重
组,"!$&- !因此微卫星中的重复单元碱基组成在很大
程度上会影响生物的生命活动+ 杜仲 CCS在非编码
区的含量要比在编码区的含量多,$*- !R?6:139CCS<
出现的频率为 $&8$"!相比杜仲 0CD(CCS<出现的频
率""8+*I#较高,$%-
CCS序列显示出显著的碱基偏好性!BKD的频
率显著高于 PK-+ 其中 BKD占单核苷酸 CCS总数
的 *&8,)I!二到七核苷酸重复的 CCS中也均以含
B.D的重复类型占主导地位+ 从总体来看!各种重
复类型的 CCS位点都存在着长度越长出现的频次
越少的趋势+ 本研究中若不统计单核苷酸重复的
CCS!杜仲基因组 CCS也是以二.三核苷酸重复单元
为主!这和大多数植物一致+ 但优势类型在不同物
种间的分布有较大差异!在拟南芥".#(I6G"D%6%*(J60
(7(#.水稻"K#HL( %(&6M(#.高粱"<"#>*=BI6)"J"##.油
茶"-(B$J6( "J$6E$#(#.玉米"8$( B(H%#.枣"86L6D*=%
W=W=I(#.二穗短柄草"Z#()*HD"G6=BG6%&()*H"7#中即
有相似现象!其中油茶的优势重复类型为二碱基重
复!水稻.高粱的优势复生类型为三碱基重复!而玉
米.枣.二穗短柄草基因组的优势重复为六碱基重
复,"# /")- + 杜仲转录组中二核苷酸重复占 +*L*#I!
其次是三核苷酸"""L&"I# ,$%- !在杜仲基因组数据
中!若不统计单核苷酸和复合模式的税收政策卫星!
"*
第 期 吴!敏等$杜仲基因组微卫星特征及 CCS标记开发
其结果是二核苷酸重复"&#L,$I#和三核苷酸重复
"$%L"I#占主导地位!这与杜仲转录组中 CCS的
优势重复相似+
"*# 对引物中有 % 对引物扩增片段与预期产物
片段大小不符!大于目的片段!这可能与扩增片段中
插入内含子有关!属于无效扩增,"%- + $+ 对扩增条带
清晰.多态性高.稳定性好的引物的扩增片段大小在
&, #& GH!其中具有多态性的 CCS主要是三核苷
酸重复的 CCS!另外也有四核苷酸至七核苷酸重复
的 CCS!这在一定程度上验证了低级单元 CCS的多
态性普遍比高级单元的高这一推断,"+- + 杜仲 R?(
6:139CCS平均有效等位基因数达到 8)&& #!相比
杜仲0CD(CCS"$8,%$ %#的多态性高,$%!",- !这表明来
源于基因组的 CCS比来源于 0CD的 CCS具有更丰
富的多态性,"&- +
本研究对杜仲 CCS标记的开发以及物种进化.
遗传多样性等方面的研究将提供重要信息!并对于
进一步利用 CCS分子标记分析杜仲遗传多样性.遗
传图谱构建.杜仲雌雄株早期鉴定等具有一定的实
际应用价值+
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