全 文 ：书犇犈犛诱变与离体培养结合筛选
柱花草抗寒突变体的研究
王小华，庄南生，王英，高和琼，韩平原
（海南大学农学院，海南 儋州５７１７３７）
摘要：采用硫酸二乙酯（ＤＥＳ）在不同温度下对柱花草愈伤组织进行化学诱变处理，并结合添加有不同浓度Ｌ羟脯
氨酸的培养基进行离体筛选，将经两步法筛选后存活的愈伤组织诱导成小苗，采用１℃下光照培养８ｄ对小苗进行
低温筛选，根据寒害程度将小苗分为４个等级。随机选取寒害程度最低的（一级伤害）小苗２株，分别切取其一部
分茎段为外植体进行愈伤的诱导，其愈伤组织作为测定抗寒生理指标的材料。结果表明，ＤＥＳ的浓度与愈伤组织
的存活率呈负相关，处理的温度与愈伤组织的存活率亦呈负相关，０．４％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ）处理的愈伤组织经两步筛
选后其存活率最高，为１８．６‰，而对照为６．６‰。经过两步法筛选后存活的愈伤组织诱导的小苗在低温筛选后得
到１４株一级伤害苗，而对照植株中未获得一级伤害苗。抗寒生理指标的测试表明，一级伤害小苗的抗寒能力显著
强于对照株。
关键词：柱花草；硫酸二乙酯；Ｌ羟脯氨酸；低温筛选；抗寒生理指标
中图分类号：Ｓ５４１．９０３．４；Ｑ９４５．７　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１０）０１０２６３０５
　 柱花草（犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊）是优良的热带、亚热带豆科牧草，原产于中、南美洲［１］。柱花草怕霜冻，耐
寒性能差，在广东、广西等省区易受寒害，难结籽，严重地影响了柱花草的进一步推广种植和产量的提高［２］。因
此，柱花草耐寒新品种的选育已提上新议程。虽然柱花草的植株再生体系已经成功建立［３］，但是利用组织培养和
化学诱变相结合的方法对柱花草进行抗寒育种在国内外尚未见报道。在本实验中，笔者利用硫酸二乙酯
（ｄｉｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ，ＤＥＳ）化学诱变结合添加Ｌ羟脯氨酸（Ｌｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ，ＬＨｙｐ）的筛选培养基对柱花草愈伤
组织进行处理，旨在获得柱花草抗寒无性系变异植株。
１　材料与方法
１．１　材料
热研２号柱花草（犛．犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｒｅｙａｎ２）种子由中国热带科学院农牧研究所提供，ＤＥＳ购自上海生物工
程公司。
１．２　方法
１．２．１　愈伤组织及再生植株的获得　参照蒋昌顺等［４］的方法诱导柱花草愈伤组织及再生植株，以柱花草愈伤组
织作为化学诱变的材料。
１．２．２　ＤＥＳ溶液的配制与诱变处理　利用过滤灭菌法配制成０．２％，０．４％和０．６％的ＤＥＳ（ｐＨ值７）溶液，将
愈伤组织切成３ｍｍ３ 的小块后，浸泡于诱变液中，放入恒温摇床，转速１００ｒ／ｍｉｎ。利用３种浓度的ＤＥＳ溶液对
愈伤组织分别在２５，２０，１５和１０℃四个温度梯度处理２ｈ，每个处理重复３次，处理完后用无菌水洗净，接种在愈
伤组织诱导培养基，１周后观察其存活率，存活率为经筛选存活的愈伤组织块数占筛选总数的百分比。
１．２．３　筛选压力浓度的确定及抗性愈伤组织的筛选　将对照愈伤组织接入添加有０．２，０．３，０．４，０．５和０．６
ｇ／Ｌ浓度ＬＨｙｐ的愈伤组织诱导培养基中，将褐化面积小于５０％的愈伤记作为存活愈伤，１周后观察其存活率。
参照郭岩等［５］的方法，用两步法筛选抗性愈伤组织，将诱变恢复１周后的愈伤组织切开转接到添加有较大致死剂
第１９卷　第１期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
２６３－２６７
２０１０年２月
 收稿日期：２００９０１１３；改回日期：２００９０３０６
基金项目：华南热带农业大学博士科研启动基金项目（Ｒｎｄｙ０５０２）资助。
作者简介：王小华（１９８４），男，江西吉安人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｔｅｄｙ＿ｃｃ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｕａｎｇｎｓ＠１６３．ｃｏｍ
量ＬＨｙｐ的培养基，１周后挑选存活的愈伤组织转接到不含ＬＨｙｐ的培养基，恢复１周后再挑选生长良好的愈
伤组织切开转接到添加有临界致死剂量ＬＨｙｐ的培养基。
１．２．４　抗寒小植株筛选及抗寒等级的划分　将两步法筛选得到的抗性愈伤组织增殖后，用芽诱导和芽增殖培养
基诱导得到小苗，将长出的小苗放入１℃低温光照培养箱中８ｄ，以未经诱变处理和筛选的愈伤组织诱导的小苗
作为对照，再将小苗放入２５℃下光照培养箱恢复１周。根据低温处理后小苗的萎蔫部分占整个植株的百分比，
将低温伤害分为４个等级。一级、二级、三级和四级伤害，萎蔫部分分别占整个植株的０～５％，５％～１５％，１５％
～５０％和５０％～１００％。
１．２．５　小植株抗寒生理指标的测定　从一级伤害小植株和对照小植株中分别随机选取２株，分别记为ＤＥＳ１、
ＤＥＳ２、ＣＫ１ 和ＣＫ２，分别切取一部分植株的茎秆，接种于愈伤组织诱导培养基：ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇｍｅｄｉａ）
＋６ＢＡ（６ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）４．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ（ｎａｐｈｔｈｙｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）１．０ｍｇ／Ｌ，取其愈伤组织用于各项抗寒
生理指标的测定。
本实验采用测定常温下，以及在１℃下光照培养１，３，５，７ｄ后的愈伤组织游离脯氨酸含量和超氧化物歧化酶
活性。游离脯氨酸含量测定采用王韶唐［６］的方法。超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性测定采用张志良和瞿伟菁［７］的方法。
２　结果与分析
２．１　抗ＬＨｙｐ愈伤组织的获得和抗寒再生苗的筛选
２．１．１　利用ＤＥＳ对柱花草愈伤组织处理后的存活率
　愈伤组织的存活率随着ＤＥＳ溶液浓度和处理温度
的升高呈降低趋势（表１）。参照 Ｂｈａｇｗａｔ和 Ｄｕｎ
ｃａｎ［８］的研究结果，本实验采用表１中的７种不同的
ＤＥＳ浓度和处理温度进行大量实验。７种处理分别为
Ａ：０．２％ＤＥＳ（２５℃，２ｈ）、Ｂ：０．２％ＤＥＳ（２０℃，２ｈ）、
Ｃ：０．２％ＤＥＳ（１５℃，２ｈ）、Ｄ：０．２％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ）、
Ｅ：０．４％ＤＥＳ（１５℃，２ｈ）、Ｆ：０．４％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ）和
Ｇ：０．６％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ）。
２．１．２　不同浓度ＬＨｙｐ培养基对对照柱花草愈伤组
织的影响　当ＬＨｙｐ浓度超过０．３ｇ／Ｌ时，愈伤的存
活率急剧降低（图１），当浓度达到０．４ｇ／Ｌ时存活率
为２０％，并且在这些存活的愈伤中９０％左右都存在部
分褐化现象，当浓度达到０．５ｇ／Ｌ时存活率仅为３％，
且存活的愈伤组织块全部都存在部分褐化现象，表明
ＬＨｙｐ对柱花草愈伤组织的临界致死剂量大概是０．５
ｇ／Ｌ。本实验采用的两步筛选法，０．４ｇ／Ｌ作为第１次
筛选的浓度，０．５ｇ／Ｌ作为第２次筛选的浓度。
表１　犇犈犛对柱花草愈伤组织存活率的影响
犜犪犫犾犲１　犈犳犳犲犮狋狅犳犇犈犛狅狀狋犺犲狊狌狉狏犻狏犪犾狉犪狋犲
狅犳犮犪犾狌狊犳狉狅犿犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊
ＤＥＳ浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆＤＥＳ
（％）
处理温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
（℃）
总数
Ｔｏｔａｌ
ｎｕｍｂｅｒ
（块Ｂｉｔ）
存活数
Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ
ｎｕｍｂｅｒ
（块Ｂｉｔ）
存活率
Ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｒａｔｅ
（％）
０．２ ２５ ７０２ ５６ ８
０．２ ２０ ６８０ ６８ １０
０．２ １５ ６９１ ５５３ ８０
０．２ １０ ６８９ ６２０ ９０
０．４ ２５ ６９７ １４ ２
０．４ ２０ ７１０ ７８ １１
０．４ １５ ７０２ ４００ ５７
０．４ １０ ７３０ ６３５ ８７
０．６ ２５ ４８２ ０ ０
０．６ ２０ ４６２ ９ ２
０．６ １５ ７０６ ９２ １３
０．６ １０ ７０７ １０６ １５
图１　不同浓度犔犎狔狆培养基对对照柱花草愈伤组织的影响
犉犻犵．１　犈犳犳犲犮狋狅犳犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀’狊犔犎狔狆狅狀狋犺犲
狊狌狉狏犻狏犪犾狉犪狋犲狅犳犮犪犾狌狊犳狉狅犿犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊
２．１．３　ＤＥＳ处理愈伤后两步法筛选的结果　Ａ、Ｂ、Ｃ
和Ｇ四个处理的愈伤组织经两步筛选后的存活率低
于对照（表２），这可能是因为ＤＥＳ药剂本身对愈伤组
织有毒害作用，但值得注意的是，Ｂ和Ｃ两个处理的愈
伤组织经两步筛选后存活的愈伤组织块中存在有完全
无褐化、生长良好的愈伤组织块，而对照处理经两步筛
选后存活的愈伤组织块全都存在部分褐化现象。Ｄ、Ｅ
和Ｆ三种处理的愈伤组织经两步筛选后的存活率高
于对照，这可能是因为ＤＥＳ药剂使愈伤组织发生了一
４６２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１
定的抗ＬＨｙｐ变异，其中Ｆ处理的愈伤组织存活率最
高，为１８．６‰，且大部分都是完全无褐化、生长良好的
愈伤组织块。
２．１．４　低温处理对再生苗的影响　Ｃ、Ｄ和Ｆ三个处
理最终都得到了表型抗寒能力最高（一级伤害）的小苗
（表３），总计１４株，Ｄ处理的一级伤害小苗获得率最
高，为３％。Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ和Ｇ五个处理共得到２８株二
级伤害小苗，Ｆ处理的二级伤害小苗获得率最高，为
４．７％。而对照苗中都未筛选出一级或二级伤害小苗。
７种处理得到的再生苗在总体上都表现出比对照高的
表型抗寒能力。Ｄｏｒｆｆｌｉｎｇ等［９］采用未经任何处理的
小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）愈伤组织进行ＬＨｙｐ离体
筛选，亦能获得抗寒突变体，而本实验对照经两步法筛
选得到的愈伤只诱导出２株再生苗，经１℃下８ｄ低温
筛选后，发现皆为表型抗寒最弱的四级伤害苗，未得到
抗寒再生苗。
２．２　抗寒生理指标检测结果
现阶段所有低温筛选得到的苗都未进行移栽，主
要是因为一级伤害苗的数量太少，宜采用离体扩增得
到更多的苗。瓶苗本身都是比较小的，不宜直接取其
茎秆或叶片来测生理指标，通过切取其部分茎段诱导
愈伤组织用于生理指标检测。
表２　两步法筛选对不同浓度犇犈犛不同温度下
处理过的愈伤组织的影响
犜犪犫犾犲２　犈犳犳犲犮狋狅犳狋犺犲２狊狋犲狆狊犲犾犲犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲犔犎狔狆犮犪犾狌狊
狋狉犲犪狋犲犱犫狔犇犈犛狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅狀狋犺犲
狊狌狉狏犻狏犪犾狉犪狋犲狅犳犮犪犾狌狊犳狉狅犿犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
处理总数
Ｔｏｔａｌ
ｎｕｍｂｅｒ
（块Ｂｉｔ）
筛选后存活数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆｓｕｒｖｉｖｉｎｇ
ｃａｌｕｓａｆｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ
（块Ｂｉｔ）
存活率
Ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｒａｔｅ
（‰）
Ａ０．２％ＤＥＳ（２５℃，２ｈ） ２７５６ ３ １．１
Ｂ０．２％ＤＥＳ（２０℃，２ｈ） １５６７ ５ ３．２
Ｃ０．２％ＤＥＳ（１５℃，２ｈ） ２３６５ １１ ４．６
Ｄ０．２％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ） ２００４ ２０ １０．０
Ｅ０．４％ＤＥＳ（１５℃，２ｈ） １９８０ １４ ７．１
Ｆ０．４％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ） １２３５ ２３ １８．６
Ｇ０．６％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ） ９８７ ２ ２．０
ＣＫ ３０２ ２ ６．６
　注：处理总数是第１次筛选时的愈伤总数，筛选后的存活数是经两步
筛选后存活的愈伤总数。
　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｗａｓｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔｈｅｃａｌｕｓｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔ
ｓｔｅｐｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｓｕｒｖｉｖｉｎｇｎｕｍｂｅｒａｆｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓｗａｓｔｈｅｎｕｍ
ｂｅｒｏｆｔｈｅｓｕｒｖｉｖｉｎｇｃａｌｕｓａｆｔｅｒｔｈｅ２ｓｔｅｐｓｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．
表３　１℃下８犱低温处理对具有抗犔犎狔狆愈伤组织诱导出的小苗的影响
犜犪犫犾犲３　犈犳犳犲犮狋狅犳１℃－８犱犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狋狉犲犪狋犿犲狀狋狅狀狋犺犲狆犾犪狀狋犾犲狋狊犻狀犱狌犮犲犱犳狉狅犿狋犺犲犔犎狔狆狉犲狊犻狊狋犪狀狋犮犪犾狌狊犲狊
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
诱导小苗植株数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｌａｎｔｌｅｔｓｉｎｄｕｃｅｄ
筛选后存活植株数Ｓｕｒｖｉｖａｌｎｕｍｂｅｒａｆｔｅｒｉｎｄｏｏｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
一级伤害１ｓｔｉｎｊｕｒｙ 二级伤害２ｎｄｉｎｊｕｒｙ 三级伤害３ｒｄｉｎｊｕｒｙ 四级伤害４ｔｈｉｎｊｕｒｙ
Ａ０．２％ＤＥＳ（２５℃，２ｈ） １３ ０（０） ０（０） １（７．７） １２（９２．３）
Ｂ０．２％ＤＥＳ（２０℃，２ｈ） １８６ ０（０） ２（１．１） ６（３．２） １７８（９５．７）
Ｃ０．２％ＤＥＳ（１５℃，２ｈ） ２３６ ２（１．０） ６（２．５） ２２（９．３） ２０６（８７．３）
Ｄ０．２％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ） ２０２ ６（３．０） ０（０） ６（３．０） １９０（９４．０）
Ｅ０．４％ＤＥＳ（１５℃，２ｈ） １４８ ０（０） ６（４．０） １２（８．１） １３０（８７．８）
Ｆ０．４％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ） ２５６ ６（２．３） １２（４．７） ２６（１０．２） ２１２（８２．８）
Ｇ０．６％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ） １２ ０（０） ２（１６．６） ２（１６．６） ８（６６．６）
ＣＫ ２４６ ０（０） ０（０） １４（５．７） ２３２（９４．３）
　注：括号内数字为各级伤害苗占该处理苗总数的百分数。
　Ｎｏｔｅ：Ｆｉｇｕｒｅｓｉｎｂｒａｃｋｅｔｓｒｅｆｅｒｔｏｅａｃｈｉｎｊｕｒｙｐｌａｎｔｌｅｔｓａｓｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓｏｆｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆｅａｃｈｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．
２．２．１　小苗诱导愈伤组织的游离脯氨酸含量　随着低温胁迫时间的增加，愈伤组织体内的游离脯氨酸含量不断
增加（表４）。在１℃下１ｄ后，ＤＥＳ１ 和ＤＥＳ２ 分别是ＣＫ２ 的７．０６和６．３５倍，在１℃下７ｄ后，ＤＥＳ１ 和ＤＥＳ２ 虽分
别由峰值降为２７８．８１和３００．３４μｇ／ｇ，但是这２个值都高于ＣＫ１ 和ＣＫ２ 在整个过程的峰值。以上结果表明，低
温胁迫下，一级伤害小苗具有显著高于对照的累计脯氨酸的能力。
２．２．２　各级伤害小苗诱导愈伤组织的ＳＯＤ活性　在低温处理前５ｄ，ＳＯＤ活性都不断增加（表５），低温处理５ｄ
５６２第１９卷第１期 草业学报２０１０年
后，都减少，在整个过程中，同一低温处理下，抗寒系的ＳＯＤ活性都高于对照。１℃下３ｄ，ＣＫ１、ＣＫ２ 和ＤＥＳ１ 的
差异未达到极显著，１℃下７ｄ，ＣＫ２ 和ＤＥＳ２ 的差异也未达到极显著，在１℃下７ｄ，ＤＥＳ１ 是ＣＫ１ 的１．８６倍，为各
时期差异最大值。值得注意的是，当低温胁迫７ｄ后ＤＥＳ１ 降低为３０２．２６Ｕ／ｇＦＷ，这一数值比ＣＫ１ 的峰值
２９５．７３Ｕ／ｇＦＷ还高。以上分析说明，在整个低温胁迫过程中，抗性系整体表现出更强的ＳＯＤ活性。
表４　从一级伤害和对照小苗所诱导愈伤组织在各低温处理下的游离脯氨酸含量
犜犪犫犾犲４　犘狉狅犾犻狀犲犮狅狀狋犲狀狋狅犳狋犺犲犮犪犾狌狊犲狊犻狀犱狌犮犲犱犳狉狅犿狋犺犲狆犾犪狀狋犾犲狋狊狅犳狋犺犲１狊狋
犮犺犻犾犻狀犵犻狀犼狌狉狔犪狀犱犆犓狊犺狅狅狋狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狊狋狉犲狊狊 μｇ／ｇ
处理时间Ｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ｄ） ＣＫ１ ＣＫ２ ＤＥＳ１ ＤＥＳ２
０ ４２．６４±３．６７Ｂ ２１．５６±２．４４Ｃ ５３．９９±２．７５Ａ ５１．４６±３．６６Ａ
１ ７１．１０±３．４０Ｂ ２６．３７±４．０３Ｃ １８６．２０±１８．６７Ａ １６７．３５±９．６７Ａ
３ ２１０．４７±１２．３８Ｂ ２２２．８０±２５．５０Ｂ ３８８．１７±１１．３５Ａ ３５９．８０±３６．９８Ａ
５ ２４３．０７±２４．３８Ｂ ２２７．３６±２０．４７Ｂ ３８０．４６±３４．６７Ａ ３５０．７４±２６．３４Ａ
７ １５０．６３±１１．３９Ｄ １８７．１６±１０．５１Ｃ ２７８．８１±１５．３１Ｂ ３００．３４±１２．６７Ａ
　注：同行中不同字母表示数值之间的差异极显著（犘＜０．０１）。下同。
　Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｒｏｗｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０１ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
表５　从一级伤害和对照小苗所诱导愈伤组织在各低温处理下的犛犗犇活性
犜犪犫犾犲５　犛犗犇犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀狋犺犲犮犪犾狌狊犲狊犻狀犱狌犮犲犱犳狉狅犿狋犺犲狆犾犪狀狋犾犲狋狊狅犳狋犺犲１狊狋
犮犺犻犾犻狀犵犻狀犼狌狉狔犪狀犱犆犓狊犺狅狅狋狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狊狋狉犲狊狊 Ｕ／ｇＦＷ
处理时间Ｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ｄ） ＣＫ１ ＣＫ２ ＤＥＳ１ ＤＥＳ２
０ １６４．１９±２．３４Ａ １５９．９３±１１．４２Ａ １７９．４２±３６．７８Ａ １７９．８７±２２．３４Ａ
１ ２３９．６９±２５．６５Ｂ ２３１．６８±１３．５３Ｂ ２９６．５７±２４．９８Ａ ２９２．１４±１２．１２Ａ
３ ２８３．４３±５５．０４ＡＢ ２５７．６２±３９．２５Ｂ ３４１．３０±２６．０７ＡＢ ３４５．１８±３４．７８Ａ
５ ２９５．７３±１０．５６Ｂ ３２９．１９±１８．５６Ｂ ４１３．６１±４１．６７Ａ ４２４．５６±１１．８８Ａ
７ １６２．１１±３４．４７Ｃ １７２．８８±４１．５１ＢＣ ３０２．２６±９．８０ＡＢ ２４３．５０±５．７５Ｂ
３　结论与讨论
在ＤＥＳ用来诱变植物愈伤组织的实验中，其处理时间一般不超过２ｈ［１０］，本实验的ＤＥＳ诱变处理时间都采
用２ｈ，而通过采用改变处理液的温度来改变其诱变效果。一般ＤＥＳ诱变实验的处理温度为室温（２５℃），而本实
验的研究结果表明，最佳处理为０．４％ＤＥＳ在１０℃下处理愈伤组织２ｈ。这说明在使用半衰期较短的烷化剂进
行化学诱变实验时，考虑到温度对其诱变效果和毒性都存在影响，应该严格设置不同温度梯度，寻找适合的处理
温度。一概地使用室温（２５℃），可能会错过更好诱变效果的处理，而根本不控制其处理时的温度，则更会导致在
相同处理下其实验结果偏差较大。
确定了采用两步法筛选柱花草抗性愈伤组织，第１步和第２步筛选的ＬＨｙｐ浓度分别为０．４和０．５ｇ／Ｌ，总
计筛选得到一级伤害苗１４株。测定愈伤组织的抗寒生理指标能够很好的反映出植株的抗寒能力。张栋梁等［１１］
通过测定茄子（犛狅犾犪狀狌犿犿犲犾狅狀犵犲狀犪）抗性系愈伤组织及其再生苗的电导率、游离脯氨酸含量和丙二醛含量等抗
寒生理指标发现，愈伤能够很好的体现其再生苗的抗寒水平。愈伤组织生理指标的检测结果表明，一级伤害和对
照在多项生理指标上有明显区别，说明所得植株是变异体的可能性较大，但再生植株所表现的抗寒性是否属于基
因水平上的变异，以及是否能够在有性繁殖世代中保持，仍需进一步研究。
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犚犲狊犲犪狉犮犺狅狀狊犮狉犲犲狀犻狀犵狅犳犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犿狌狋犪狀狋狊狑犻狋犺犲狀犺犪狀犮犲犱犮犺犻犾犻狀犵狉犲狊犻狊狋犪狀犮犲
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ＷＡＮＧＸｉａｏｈｕａ，ＺＨＵＡＮＧＮａｎｓｈｅｎｇ，ＷＡＮＧＹｉｎｇ，ＧＡＯＨｅｑｉｏｎｇ，ＨＡＮＰｉｎｇｙｕａｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｎｚｈｏｕ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｃｕｔｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓｏｆ犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊犵狌犻犪狀犲狀狊犻狊ｃｖ．Ｒｅｙａｎ２ｓｅｅｄｌｉｎｇｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｅｘｐｌａｎｔｐｒｏｄｕｃ
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ｓｔｅｍｓｗｅｒｅｃｕｔｏｆｆｆｏｒｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｓｅｃａｌｕｓｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｆｏｒｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｉｃｅｓｏｆｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．
Ｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｅｓｔｒｅａｔｅｄａｔｔｈｅｌｏｗｅｓｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｗａｓｈｉｇｈｅｒｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ
ＤＥＳ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ０．４％ＤＥＳ（１０℃，２ｈ）ｆｏｒｃａｌｕｓｈａｄｔｈｅｂｅｓｔｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ（１８．６％），ｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｌｙｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈｅ６．６％ｏｆｔｈｅＣＫ．Ｆｏｕｒｔｅｅｎｐｌａｎｔｌｅｔｓｏｆｔｈｅ１ｓｔｃｈｉｌｉｎｇｉｎｊｕｒｙｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｏｓｅ
ｔｈａｔｓｕｒｖｉｖｅｄｔｈｅ２ｓｔｅｐｉｎｖｉｔｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＬＨｙｐａｆｔｅｒｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｕｒｖｉ
ｖｉｎｇｐｌａｎｔｌｅｔｓｆｒｏｍｔｈｅＣＫ．Ｔｈｅ１ｓｔｃｈｉｌｉｎｇｉｎｊｕｒｙｐｌａｎｔｌｅｔｓｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｂｅｔｔｅｒｃｏｌｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｈａｎｔｈｏｓｅ
ｆｒｏｍｔｈｅＣＫ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犛狋狔犾狅狊犪狀狋犺犲狊；ＤＥＳ；Ｌｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ；ｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｉｃｅｓｏｆｃｏｌｄ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
７６２第１９卷第１期 草业学报２０１０年