全 文 ：林业科学研究!"#$"!"%"&#$%-$ %-&
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!!文章编号!$##$)$&*+""#$"##&)#%-$)#&
F 个桉树无性系愈伤诱导和分化
裘珍飞$$ 曾炳山$$ 李湘阳$$ 刘!英$$ 查志刚"
"$,中国林业科学研究院热带林业研究所!广东 广州!%$#%"# ",安徽黄山市森林病虫防治检疫站!安徽 黄山!"&%####
收稿日期$ "#$$)#()$(
基金项目$ .+(-/项目.白桦&桉树等分子育种与品种创制/""#$$66$##"#"#研究内容
作者简介$ 裘珍飞"$*((%#!女!浙江嵊洲人!高级实验师,从事热带林木组织培养和生物技术研究,e7;2O$]YB%#"o$(-,D?7
关键词!桉树愈伤诱导再生率
中图分类号!."-,$ 文献标识码!6
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!($ :%#+)$ F<)(CKA&<%D;OL423ELD/2?3@0H030@;/2?3 @;/0
!!桉树"F<)(CKA&<%>uXv@2/,#是世界三大树种之
一!随着生物技术的发展!桉树转基因研究正以前所
未有的速度发展!而不同的种&无性系胚性愈伤诱导
的难易和植株再生能力的强弱直接影响转基因工程
实施的进程( 尾巨桉"F@<#"A*KC( .,F,GO;T0mF@
H#(0B/%_,X2O0ia;2E03# 无性系 X`-""*&巨尾桉
"F@H#(0B/%mF@<#"A*KC(# 无性系 C>*&巨桉 "F@
H#(0B/%_,X2O0ia;2E03# 无性系 eH% 和尾赤桉
"F@<#"A*KC(mF@)(D(CB
产!高效!适应性广!为社会创造了巨大的经济效益(
经过长期的生产实践!同时也反映出各无性系的缺
点和不足!如 X`"#$)" 易感枝瘿姬小蜂!eH%&C>* 和
X`-""* 抗寒性有待提高( 桉树用作纸浆材!需要降
低木质素!增加纤维素含量!这些问题急需通过转基
因的技术实现解决( 愈伤组织再生技术的突破是开
展转基因实践的重要环节( 关于桉树愈伤再生!国
内外已有较多成功的研究( 欧阳权等+$,以改良X8
"&&)`$,# 7H->
\$
8
\$
8蔗糖 &# H-
>
\$为诱导培养基!改良 X8(G6#," 7H->\$ 8
h66#,% 7H->
\$为分化培养基!获得雷林 $ 号胚状
体再生芽石大兴等+",以改良 X8"&&)`$,# 7H-
>
\$
8(G6$,# 7H->
\$
8h66#,% 7H->
\$获得巨
桉下胚轴 +[的愈伤再生谭德冠等+-,以改良 X8
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
(G6#,% 7H->
\$
8h66#,% 7H->
\$获得刚果 $ 号
"F,$"6G># %&[再生宛淑艳等+&,以 a. 8K66"#
7H->
\$
8h66#,% 7H->
\$获得尾叶桉"F@<#"1
A*KC( .,F,GO;T0#&-[的再生巴西 >L24等+%,以 a.
8F`Y#,&& 7H->
\$培养基诱导愈伤!以 .Z8(G6
$,$- 7H->
\$
8h66#,#* 7H->
\$为分化培养基获
得巨尾桉子叶 %#[以上的再生!美国a,a,.L11;2;J
等+(,以G% 7H->\$ 8G6#,% 7H->\$ 8h66- 7H
->
\$培养基诱导愈伤!以修改 _Z8G6#,% 7H-
>
\$
8ZnZ%## 7H->
\$
8$#[椰乳获得细叶桉"F@
&$#$&/)"#0/%.72/J,#愈伤再生( 以上研究主要集中在
基本培养基和外源激素的筛选上!而影响桉树愈伤
再生的因素还有基因型&外植体类型&培养条件等多
种因素!本试验在筛选基本培养基和外源激素的基
础上+ \*, !进一步深入研究愈伤诱导时间对愈伤再
生率的影响!为提高再生率!实施转基因研究打下良
好基础(
$!材料和方法
;<;=试验材料
材料选自中国林业科学研究院热带林业研究所
组培室大规模生产的 X`-""*&C>*&eH% 和 X`"#$)"
无性系组培苗!生根培养 "# E!茎段和叶片的选取依
从范春节等+,试验结果!叶片选取从顶端数第 " -
片叶!切去叶尖!保留叶柄!茎段选取中上部节间!切
除带腋芽的节(
;<>=试验方法
$,",$!基本培养基和培养条件!生根培养基为 $:
" a. 86GF$ 号 $ 7H->\$!愈伤诱导培养基为改良
a. 8F`Y#,#& 7H->
\$
8KG6#,$ 7H->
\$
!愈伤分
化培养基为改良a. 8( G6#," 7H->\$!所有培养
基添加蔗糖 -# H->\$!卡拉胶 ,# H->\$( 试验培
养温度""% r"# c!光照强度 " %## Oi!光照时间 $#
J-E
\$
(
$,","!试验材料培养和生长状况比较!选取生长
状态相似!高 $,# $,% D7的 & 个无性系增殖苗单
芽接入生根培养基上!每无性系接种 (# 瓶!每瓶接
种 "# 株( 生根培养 "# E!每无性系随机抽取 ( 瓶!
调查株高及顶端第 " - 片叶长和最宽处叶宽!其
余生根苗为提供叶片&茎段诱导愈伤之用(
$,",- !叶片!茎段愈伤诱导!分别切取 eH%&
X`"#$)"&C>* 和 X`-""* 叶片&茎段接入愈伤诱导
培养基!放入培养室诱导培养 $%&"#&"%&-#&-%&&#&
&% E!取出培养获得的愈伤组织块!用自来水漂洗表
面附着的培养基!滤纸吸干表面水分!称量愈伤组织
的质量(
$,",& !叶片!茎段愈伤分化培养!切取 eH%&
X`"#$)"&C>* 和 X`-""* 叶片&茎段接入愈伤诱导
培养基! 按 $%&"#&"%&-#&-%&&#&&% E 诱导培养时
间!分别把叶片&茎段愈伤材料转入分化培养基!每
处理分化培养 -# E后调查再生率(
再生率 5 产生芽的材料数:接种材料数 m
$## [(
;叶片&茎段愈伤诱导和分化试验每瓶培养基接
种 ( 个材料!每处理 % 瓶!共 -# 个材料!重复 - 次(
数据利用 .6.分析软件进行处理!文中百分率数据
分析时经过反正弦变换(
"!结果与分析
><;=参试材料的生长状况
&个无性系的苗木在生根培养基上都获得正常
的生长!发根时期集中于接种后% $# E!发根后苗木
进入快速生长期!"# E 时达到生长高峰!表现为苗杆
挺拔!叶片宽大&平展( &个无性系在株高和最宽处叶
宽无显著差异">#5#,"% 和 #,$&#!说明容易获得基
本一致的茎段材料!第 " - 片叶长存在显著差异
">#f#,##$#!叶长差异通过切割叶尖获得大小一致
的叶片材料( 试验用材为苗木中上部茎段和顶部第 "
-片叶!是植株中最长茎段和最宽叶片!这样选材
既有利于愈伤培养和再生!也十分利于接种操作(
><>=叶片$茎段愈伤诱导
& 个无性系叶片&茎段接种在相同的愈伤诱导
培养基上!获得 $##[的愈伤诱导率( 在诱导培养
$% E后!通过每 % E称量 $ 次愈伤质量!获得 & 个无
性系 # &% E的叶片&茎段愈伤生长量"图 $&"#( &
个无性系叶片愈伤的生长表现为$首先在叶柄和叶
尖切口形成愈伤!后在叶片内部产生愈伤!最后整叶
形成愈伤组织( 比较 & 个无性系叶片愈伤生长量$
$%&"# E时!无显著差异">#
$%E
5#,"$!>#
"#E
5#,%#!
说明在选材基本一致的前提下!叶片愈伤早期生长
无性系间差异不显著( "% E后愈伤生长分化为 " 种
类型!即eH%& X`"#$)" 增速较缓!C>* 和 X`-""* 增
速较快!到 &% E时! X`-""* 和C>* 的愈伤生长量显
著大于eH% 和 X`"#$)"">#
&%E
5#,### *#(
茎段愈伤生长表现为$首先两端切口逐渐膨大!
"-%
第 & 期 裘珍飞等$& 个桉树无性系愈伤诱导和分化
形成黄色紧密型的愈伤小球!后逐渐长大形成块状
愈伤( 比较 & 个无性系茎段愈伤的生长量可得$$%&
"# E时!eH% 和 X`"#$)" 的生长量大于 X`-""* 和
C>*">#
$%E
5#,#-!>#
"#E
5#,#$#!"%&-#&-% E 时 eH%
和 X`"#$)" 愈伤生长量增速平缓! X`-""* 和 C>*
增速加快!致使 "% -% E时 & 个无性系愈伤生长量
的差异不显著!而 &#&&% E 时! X`-""* 和 C>* 愈伤
继续快速生长!显著大于 eH% 和 X`"#$)" 的生长量
">#
&#E
5#,##-!>#
&%E
5#,### (#(
愈伤生长与接种方式有关!叶片以背面接触培
养基!平坦放置在培养基表面愈伤生长较快!茎段也
以平行放置在培养基表面!切口容易生长愈伤!而插
入培养基的切口不容易生长愈伤(
图 $!& 个无性系叶片愈伤生长量 图 "!& 个无性系茎段愈伤生长量
>$% &% E不同诱导时间获得的愈伤转接入分
化培养基!-# E后调查分化率!结果"表 $#表明$愈
伤诱导时间不同对 & 个无性系叶片&茎段愈伤再生
率有显著影响( 叶片愈伤再生中$eH% 各诱导时间
都能获得一定的再生率!但以诱导 &% E 再生率最
高!达 #,#[ X`"#$)" 愈伤分化规律为在诱导 $%
"# E时愈伤再生率为 #!诱导 "% E以上的愈伤开
始分化!并随诱导时间增加!再生率提高!&% E 时
获得最高为 (-,-[的再生率C>* 愈伤分化规律
为诱导 $% "# E 的愈伤容易分化!再生率高达
%-g-[ ((,[!而诱导时间超过 "% E!愈伤完全
失去分化能力 X`-""* 只有在诱导 -# E 时获得
-g-[的少量分化!其它各时期再生率为 #( 茎段
愈伤再生中$eH% 除诱导 &# E 愈伤没有分化!其它
诱导时间都获得一定的再生率 X`"#$)" 以诱导
$% "# E再生率较低!"% E 以上的愈伤再生率提
高C>* 以诱导 $% E 获得的愈伤再生率最高!达
(-g-[!随着诱导时间增加!再生率降低!&% E 时
为 # X`-""* 茎段愈伤除在 $% E 诱导时间没有分
化外!其它都能获得少量分化!并以诱导 -# E 再生
率最高为 $(,[(
表 ;=F 个无性系不同愈伤诱导时间的再生率
诱导时间
:E
叶片愈伤再生率:[
eH% X`"#$)" C>* X`-""*
茎段愈伤再生率:[
eH% X`"#$)" C>* X`-""*
$% %-,-(1 #,#D %-,-1 #,#; -#,#; -,-1 (-,-; #,#1
"# &(,1D #,#D ((,; #,#; "*,"; -,-1 %#,#; $#,#;1
"% -(,D %(,; #,#D #,#; (,;1 --,-; -,-1 -,-;1
-# &(,1D -#,#1 #,#D -,-; "#,#; -#,#; (,1 $(,;
-% -(,D &(,; #,#D #,#; -,-;1 "(,; -,-1 -,-;1
&# &-,-1D (#,#; #,#D #,#; #,#1 "-,-; -,-1 -,-;1
&% #,#; (-,-; #,#D #,#; $(,; &#,#; #,#1 $#,#;1
!!注$表中数据为平均值同列数据后不同小写字母表示不同诱导时间下再生率的差异">#f#,#$#(
>
的最高再生率进行双因子方差分析!结果"表 "#表
明$& 个无性系间愈伤再生能力差异显著!而同一
无性系叶片和茎段间差异不显著( 总体上 & 个无
性系再生能力可划分为 - 个等级!其中eH% 最高再
生率达 #,#[!各诱导时间的愈伤都能分化!属容
易再生基因型!C>* 和 X`"#$)" 最高再生率分别
为((,[和 (-,-[!但对愈伤诱导时间有严格的
要求!属比较容易再生的基因型! X`-""* 最高再
生率为 $(,[!且叶片再生率多为 #!属难以再生
基因型( 比较相同无性系叶片&茎段愈伤再生能
--%
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
力!存在一定的规律性!即容易再生的无性系!叶
片愈伤再生率略高于茎段!难以再生的无性系!茎
段愈伤再生率高于叶片(
表 >=F 个无性系叶片$茎段再生率方差分析
变差来源 自由度 平方和 均方 !值 >#9!
模型 ( (%#,- *%#,$ +,"- #,### -
无性系间 - % #-#," $ ((, $&,% f#,### $
叶片&茎段间 $ "&, "&, ",$% #,$(
误差 $( $ +&(,( $$%,&
总计 "- + &*(,*
-!结论与讨论
基本培养基和激素的筛选决定能否诱导愈伤和
实现愈伤再生芽!愈伤诱导时间筛选能进一步优化
愈伤再生体系!提高愈伤再生率( 与前人的试验结
果相比! X`"#$)" 无性系叶片最佳诱导时间的再生
率从 &+,-[+,提高到 (-,-[!C>* 无性系最佳诱导
时间的再生率从 "#,"[+*,提高到 ((,[!eH% 无性
系最佳诱导时间的再生率达 #,#[!这为转基因研
究打下了良好的基础( X`-""* 无性系再生率较低!
这可能是由基因型决定!本实验室对其开展了多种
其它试验!未获得再生率更高突破!也可能还未找到
适合其愈伤再生的培养方法和条件!有待进一步
研究(
大部分研究者采用间接再生的方法建立桉树的
再生体系+$ \-!% \(!*, !即在诱导培养基上诱导愈伤!在
分化培养基上再生芽也有人采用直接再生+&!, !即
在诱导培养基上完成愈伤诱导和分化( 试验中也发
现部分在诱导培养基上愈伤再生出芽的现象!特别
是eH% 和 X`"#$)" 无性系!在愈伤诱导 &% E 时!有
$#[以上的直接再生率( 直接再生实验过程简单!
但再生出芽时间长且不够统一!对再生率随诱导时
间增加而降低的基因型不适合采用( 间接再生出芽
时间短且统一!再生率稳定性高!还可以通过在分化
培养基中添加耶乳+(, &氯化钴+*,等物质进一步提高
再生率(
C>* 叶片&茎段愈伤和 X`-""* 叶片愈伤生长
量随诱导时间增加快速增长!而再生率随诱导时间
增加快速下降!说明诱导时间超过 "% E 后快速生长
的愈伤为非胚性愈伤!非胚性愈伤的快速发展一方
面容易掩埋前期产生的胚性愈伤!另一方面可能是
较长时间的 F`Y诱导对 C>* 胚性愈伤产生不可逆
转的再生抑制+*, (
参考文献!
+$, 欧阳权!曾炼武!李洁汉,桉树组培育苗新技术+W,,广西科学!
$**&!$"-#$&* \%*
+", 石大兴!石轶松!王米力!等,巨桉下胚轴诱导不定芽与植株再
生的研究+W,,四川农业大学学报! "##"!"#"-#$$+& \$+
+-, 谭得冠!庄南生!黄华孙,刚果$" 号桉愈伤组织的诱导与再生植
株快繁体系的构建+W,,热带作物学报!"##%!"("-#$"& \"+
+&, 宛淑艳!陈文渊!何晓玲,尾叶桉茎段再生系统建立+W,,基因组
学与应用生物学!"#$#!"*"%#$*- \*&"
+%, >L24ZGM! 6E@2;30MaC! .2OP2;GIM,ZO;3/@0H030@;/2?3 A@?7
400EO23H0iUO;3/4?AF<)(CKA&<%H#(0B/%mF@<#"A*KC( +W,,ZO;3/
M0O! F244L0;3E d@H;3 MLO/L@0! $***! %($ $ \"-
+(, .L11;2;J aa!a23?DJ;. M,.J??/@0H030@;/2?3 A@?74/07;3E O0;A
D;OL4?AF<)(CKA&<%&$#$&/)"#0/%+W,,ZO;3/M0OI0U?@/4! $***!*$
-# \--
+, 范春节!曾炳山!裘珍飞!等,尾赤桉叶片及茎段的离体培养与
植株再生+W,,福建林学院学报!"##*!"*"$#$& \+
++, 范春节!曾炳山!裘珍飞!等,尾赤桉 X`"#$)" 遗传转化体系建
立的研究+W,,浙江林业科技!"##*!"*"&#$$% \"#
+*, 裘珍飞!曾炳山!李湘阳!等,F`Y对巨尾桉"C>*#胚性愈伤组织
诱导和再生的影响+W,,林业科学研究!"##*!"""%#$&# \&-
&-%