全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林业科学研究　2009, 22 (5) : 740～743
Forest R esearch
　　文章编号 : 100121498 (2009) 0520740204
TDZ对巨尾桉 ( GL9)胚性愈伤组织诱导和再生的影响
裘珍飞 , 曾炳山 , 李湘阳 , 刘 　英
(中国林业科学研究院热带林业研究所 ,广东 广州　510520)
关键词 : TDZ;巨尾桉 GL9;愈伤诱导率 ;再生率
中图分类号 : S792. 39 文献标识码 : A
收稿日期 : 2008210220
基金项目 : 国家林业局 948项目“桉树转基因技术及抗病育种基因质粒引进”(200624270) ;科研院所基本科研费项目“桉树转基因技术
及转基因育种研究”(2007223)
作者简介 : 裘珍飞 (1966—) ,女 ,浙江嵊州人 ,高级实验师 ,从事热带林木组织培养和生物技术研究.
Em broyogen ic Ca llus Induction and Plan t Regenera tion of
C lones GL9 of Euca lyptus grandis ×E. u rophylla
Q IU Zhen2fei, ZENG B ing2shan, L I X iang2yang, L IU Ying
(Research Institute of Trop ical Foresty, CAF, Guangzhou　510520, Guangdong, China)
Abstract: The embryogenic callus induction and shoot regeneration were studied systematically in elite clone GL9 of
Euca lyptus cultivated widely in south China. W e investigated TDZ 0. 02 - 0. 05 mg ·L - 1 was the p roper
concentration. The callus induction rate was 92. 9% —100%. W hen TDZ concentration was higher than 0. 1 mg·
L - 1 , the axillary bud germ ination was comp letely inhibited. TDZ 0. 02 mg·L - 1 with combinations of CoCl2 0. 125
mg·L - 1 could induct the embryogenic callus. The direct regeneration rate was 13. 39% ±1. 03% , and with
combinations of NAA 0. 1mg·L - 1 could not differentiate directly from callus, but higher regeneration rate (20. 2%
±13. 3% ) could be obtained by transferring callus onto regeneration medium. The size of callus can increase to
1. 4 fold of its original size in the first subculture in modified MS + TDZ 0. 02 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1
medium and the average number of deep2p ink2coloured masses of embryogenic cells on each callus was 8. 4. In the
second and third subculture, callus stopped growing further and the number of masses of embryogenic cells
decreased gradually. Regeneration system could lay a good foundation for further transformation research.
Key words: TDZ; Euca lyptus grand is ×E. urophylla GL9; callus initiation rate; regeneration rate
　　TDZ(苯基噻二唑脲 )是近 20～30年被逐渐应
用到组织培养中的一种新型植物生长调节剂 ,具有
很强的细胞分裂素活性 ,它的活性是 62BA的 50倍、
Zip的 1 000倍 [ 1 ] ,许多难以再生的植物应用 TDZ可
获得体细胞胚和再生植株 [ 2 ]。Tibok[ 3 ]认为 :在尾叶
桉 ( Euca lyptus u rophy lla S. T. B lake)胚轴再生芽中 ,
62BA诱导只通过器官发生再生 ,而 TDZ诱导不仅通
过器官发生途径再生 ,而且还获得心型结构的体胚
再生。在国外桉树愈伤组织诱导和植株再生的研究
报道中 ,应用 TDZ诱导尾叶桉、巨尾桉 ( E. grand is
W. H ill ex Maiden ×E. urophylla S. T. B lake)和蓝桉
( E. g lobu les Labill. )胚轴和子叶愈伤 ,其适合浓度
为 0. 01～0. 5 mg·L - 1 [ 3 - 5 ] ,取得较好效果。在国内
桉树的再生研究中 ,卜朝阳 [ 6 ]应用 TDZ在 0. 5 mg·
L - 1水平上获得愈伤再生。作者在开展桉树组培苗
茎段愈伤组织诱导和植株再生的研究中 ,应用 TDZ
获得了稳定的胚性愈伤和再生植株 ,为进一步开展
优良无性系的转基因研究奠定基础。
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第 5期 裘珍飞等 : TDZ对巨尾桉 ( GL9)胚性愈伤组织诱导和再生的影响
1　材料与方法
1. 1　材料
试验材料为本实验室大规模生产的巨尾桉
( GL9)组培生根苗 ,生根培养 25～30 d,苗高 2～3
cm。组培生根苗具有较长的茎间节段 ,便于获得茎
段愈伤。
TDZ为 Sigma公司生产的 0. 25 mg装产品 ,用 1
mL二甲基亚砜溶解后 ,用 1 mol氢氧化钾稀碱液定
容 ,配成 100 mg·L - 1母液备用 ; 2, 42D、62BA 和
NAA为上海伯奥产品。
基本培养基采用欧阳权等 [ 7 ]在桉树组培育苗中研
制的改良 H,改良 H在刚果 12桉愈伤诱导和再生中获
得较好效果 [8 ] ;再生培养基为改良 H + 62BA 0. 2 mg·
L - 1 ;所有培养基中蔗糖 30 g·L - 1 ,琼脂 7. 5 g·L - 1。
培养室温度 (25 ±2) ℃,光照强度 2 500 lx,光照时
间 10 h·d - 1。
1. 2　试验设计
1. 2. 1 　TDZ最适浓度试验 　配制改良 H + TDZ
(0. 001、0. 005、0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 1、0. 5
mg·L - 1 ) 9个浓度梯度培养基 ,以改良 H + 62BA 0. 2
mg·L - 1培养基为对照。切除生根苗顶芽 ,取中上部
单芽茎段 (长 1. 0～1. 5 cm,带 1个腋芽 ) ,直立插入培
养基中 ,培养 30 d,观察切口愈伤形成和腋芽萌发情
况 ,统计愈伤诱导率、愈伤大小和腋芽萌发率。
1. 2. 2　TDZ和不同物质组合使用效果试验 　改良
H + TDZ 0. 02 mg·L - 1组合 2, 42D (0. 01、0. 1 mg·
L - 1 )、NAA ( 0. 01、0. 1 mg·L - 1 )、62BA ( 0. 01、0. 1
mg·L - 1 )和 CoCl2 (氯化钴 , 0. 025、0. 125 mg·L - 1 )
共 8个处理培养基。切除生根苗顶芽 ,取中上部单
芽茎段 (长 1. 0～1. 5 cm,带 1个腋芽 ) ,直立插入培
养基中 ,培养 30 d,调查愈伤大小和再生率。切取茎
段基部切口长出的愈伤组织 (不含腋芽茎段 ) ,接入
再生培养基 ,培养 30 d,调查再生率。
1. 2. 3　TDZ多代培养对愈伤再生的影响 　取生根
苗中上部单芽茎段接种在改良 H + TDZ 0. 02 mg·
L - 1 +NAA 0. 1 mg·L - 1的愈伤诱导培养基中 ,培养
20 d,切取茎段基部切口长出的愈伤组织 (不含腋芽
茎段 )接入相同的培养基 ,继代 3次 ,转接周期 20 d,
观察愈伤组织生长和愈伤表面发生的变化。
1. 3　试验重复
所有试验的每个处理重复 6瓶 ,每瓶接种 6个
材料。由于实际操作中存在一定的污染 ,因此每个
处理比试验设计多 2瓶 ,以保证每个试验数据的完
整性 ,如果没有污染 ,则多余的瓶数不作统计。
1. 4　试验观察和调查
茎段愈伤以茎段基部切口能观察到球状突起 ,
即生长出直径大于 2 mm的愈伤计数 ,诱导率为生
长愈伤茎段和接种茎段数的百分比。愈伤再生以愈
伤表面生长出大于 2 mm的芽计数 ,再生率为再生
愈伤与接种愈伤数的百分比。
1. 5　统计与分析
数据利用 SAS分析软件进行处理 ,文中百分率
数据分析时经过正弦平方根转换。
2　结果与分析
2. 1　不同浓度 TD Z对愈伤组织诱导和腋芽生长的
影响
表 1表明 : TDZ各浓度在愈伤诱导率、愈伤大小
和腋芽萌发率上都存在极显著的差异。当 TDZ浓
度为 0. 02～0. 05 mg·L - 1时 ,获得直径大于 4. 89
mm的愈伤 ,且诱导率大于 92. 9% ;当 TDZ浓度过低
( < 0. 02 mg·L - 1 )或过高 ( > 0. 05 mg·L - 1 )时 ,愈
伤直径和诱导率都存在下降的趋势 :当 TDZ < 0. 02
mg·L - 1时 ,切口难以产生愈伤 ,而当 TDZ > 0. 05 mg
·L - 1时 ,表现为全茎段膨大。腋芽萌发率随着 TDZ
浓度的增加而下降 ,当 TDZ浓度大于 0. 1 mg·L - 1
时 ,腋芽生长完全受到抑制。在对照的再生培养基
中 ,愈伤不生长 ,而腋芽萌发率为 100% ,与最低浓
度的 TDZ(0. 001 mg·L - 1 )存在极显著差异。从腋
芽萌发的状态看 , TDZ培养基腋芽萌发较 62BA培养
基慢 ,且萌出的腋芽细弱 ,这表明 TDZ不利于桉树
腋芽的萌发和生长 ,在再生和增殖上最好还是选用
62BA等其它激素较好 ,这与巴西 Luis等 [ 5 ]的研究结
果一致。
表 1　TD Z浓度对愈伤诱导和腋芽萌发的影响
试验号 TDZ浓度 /(mg·L - 1 )
愈伤诱导
率 / %
愈伤直径 /
mm
腋芽萌发
率 /%
对照 0. 000 0. 0 d — 100. 0 a
1 0. 001 46. 4 c 2. 61 c 66. 7 b
2 0. 005 44. 7 c 2. 33 c 63. 0 b
3 0. 010 68. 3 bc 3. 09 c 53. 2 bc
4 0. 020 96. 4 a 5. 14 a 33. 9 cd
5 0. 030 100. 0 a 4. 89 a 17. 9 de
6 0. 040 100. 0 a 5. 30 a 8. 8 ef
7 0. 050 92. 9 ab 5. 10 a 3. 6 fg
8 0. 100 65. 6 bc 4. 45 ab 0. 0 g
9 0. 500 67. 4 bc 3. 39 bc 0. 0 g
　　注 :表中数据为平均值 ±标准误 (下同 ) ;同列中不同字母表示
差异极显著 ( P = 0. 01)。
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
2. 2　TD Z和不同物质组合使用对愈伤诱导和再生
的影响
TDZ具有细胞分裂素的作用 ,又具有生长素的
作用。Tibok[ 3 ]认为 ,在尾叶桉中 TDZ只有与 NAA
配合使用才能发挥作用 ,在苜蓿中使用 TDZ促进乙
烯的形成 ,使愈伤组织变绿变硬 ,丧失体胚发生能
力 ,而加入 CoCl2 可恢复愈伤组织的体胚发生 [ 9 ]。
表 2表明 : TDZ与不同的物质及浓度组合使用 ,愈伤
大小、再生方式和再生率存在很大差异 ,其中 , 3、5、
6、8号培养基可获得 2条途径的再生 ,即在诱导培
养基上直接获得愈伤再生芽 (直接再生 )和把获得
的愈伤材料 (图版 2)转接到再生培养基后分化出芽
(间接再生 )。直接再生多为单芽或双芽 (图版 1) ,
间接再生表现为愈伤多点出芽 ,最多可达 30个 ·
块 - 1愈伤 (图版 3)。TDZ与高浓度 CoCl2 (0. 125 mg
·L - 1 )组合使用效果最好 ,直接再生率达 13. 39% ,
间接再生率达 16. 5% ,说明 CoCl2 在桉树愈伤再生
中也具有解除 TDZ的再生抑止和恢复胚性的意义 ,
但 TDZ与低浓度的 CoCl2 (0. 025 mg·L - 1 )组合使
用再生效果不明显。TDZ与 62BA组合使用 ,能产生
少量再生 ,且以低浓度 62BA为好。表 2中 , 1、2、4、7
号培养基 ,不能获得直接再生 ;但 TDZ与高浓度的
NNA (0. 1mg·L - 1 )组合使用 ,间接再生率最高 ,平
均达 20. 2% ,且愈伤生长最大 ,达 5. 32 mm。TDZ和
低浓度的 2, 42D ( 0. 01 mg·L - 1 )组合使用时 ,有少
量间接再生 ,但 TDZ和高浓度的 2, 42D ( 0. 1 mg·
L - 1 )组合使用时 ,不能再生。由此可见 ,最佳胚性愈
伤诱导培养基为 :改良 H + TDZ 0. 02 mg·L - 1 +
NAA 0. 1 mg·L - 1。
表 2　 TD Z0. 02 m g·L - 1和不同物质配合使用对桉树愈伤组织诱导和再生影响
培养基编号 组合物质及浓度 / (mg·L - 1 ) 愈伤直径 /mm 直接再生率 /% 间接再生率 /%
1 TDZ 0. 02 + 2, 4 - D 0. 01 4. 62 ±0. 67 bc 0. 00 ±0. 00 b 13. 0 ±11. 8 bc
2 TDZ 0. 02 + 2, 4 - D 0. 10 4. 26 ±0. 65 bc 0. 00 ±0. 00 b 0. 0 ±0. 00 d
3 TDZ 0. 02 +NAA 0. 01 4. 45 ±0. 62 bc 5. 08 ±7. 05 ab 6. 3 ±12. 5 cd
4 TDZ 0. 02 +NAA 0. 10 5. 32 ±1. 32 a 0. 00 ±0. 00 b 20. 2 ±13. 3 a
5 TDZ 0. 02 + 6 - BA 0. 01 4. 06 ±0. 37 bc 10. 27 ±6. 90 ab 7. 1 ±8. 2 cd
6 TDZ 0. 02 + 6 - BA 0. 10 3. 83 ±0. 79 c 4. 72 ±6. 48 ab 4. 7 ±6. 5 cd
7 TDZ 0. 02 + CoCl2 0. 025 3. 88 ±0. 50 c 0. 00 ±0. 00 b 3. 1 ±6. 3 cd
8 TDZ 0. 02 + CoCl2 0. 125 4. 90 ±0. 94 ab 13. 39 ±1. 03 a 16. 5 ±5. 7 ab
　　注 :表中数据为平均值 ±标准误 ;同列中不同字母表示数据间差异显著 ( P = 0. 05)
图版 : 1愈伤直接再生出单芽 ; 2再生培养的愈伤材料 ; 3愈伤间接再生出多个芽 ;
4初代培养获得的愈伤 ; 5继代培养后的愈伤 ; 6红色的胚性细胞团再生出芽
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第 5期 裘珍飞等 : TDZ对巨尾桉 ( GL9)胚性愈伤组织诱导和再生的影响
2. 3　TD Z多代培养对愈伤生长和胚性的影响
单芽茎段接种在胚性愈伤诱导培养基 (改良 H
+ TDZ 0. 02 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1 )上 , 7～
10 d在切口形成愈伤组织 , 10～15 d为愈伤迅速增
长期 , 15～20 d为缓慢增长期 , 20 d后几乎停止生
长。作者以 20 d为继代周期 ,切取所得愈伤在相同
的培养基上进行连续 3代培养 ,结果见图 1。由图 1
可见 :诱导获得的初代愈伤 ,直径为 2. 67 mm,表面
呈黄绿色 (图版 4) ,在第 1代培养基上 , 10 d后表面
生长出红色颗粒状的胚性细胞团 (图版 5) , 20 d后
愈伤直径增长了 40. 4% ,每块愈伤中红色颗粒状胚
性细胞团的数量平均达 8. 4个。具有红色颗粒的愈
伤组织在再生培养时容易产生再生芽 (图版 6) ,这
与欧阳权等 [ 7 ]描述的胚性愈伤再生相似。经 2、3代
培养 ,愈伤直径没有明显生长 ,愈伤表面的红色胚性
细胞团的数量逐渐减少。这是因为在 2、3代培养
时 ,愈伤停止了生长 ,新的胚性细胞发生少 ,第 1代
的胚性细胞会慢慢老化 ,变成褐色而死亡 。
图 1　愈伤在相同培养基上继代生长
3　结论与讨论
(1) TDZ单独使用可诱导 GL9组培苗茎段获得
愈伤 ,最适浓度为 0. 02～0. 05 mg·L - 1 ,愈伤诱导率
在 92. 9%以上 ,愈伤直径最大达 5. 30 mm。徐华
松 [ 1 ]文中引用很多事例说明了 TDZ的高效性 ,本文
发现了 TDZ的精确性 , TDZ 0. 01 mg·L - 1和 TDZ
0. 02 mg·L - 1的愈伤诱导率和愈伤直径都达到了极
显著水平 ,因此使用 TDZ时尽可能选择低浓度 ,浓
度梯度的设计尽可能精确开展实验。
(2) TDZ的再生抑制性。TDZ对腋芽萌发具有
抑制作用 , TDZ浓度大于 0. 1 mg·L - 1时 ,腋芽生长
完全受到抑制 ,同时 TDZ也抑制愈伤再生。CoCl2
0. 125 mg·L - 1具有解除 TDZ的再生抑止和恢复胚
性的作用。本试验获得的最佳胚性愈伤诱导培养基
为 :改良 H + TDZ 0. 02 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·
L - 1 ,其间接再生率达 20. 2% ±13. 3%。 TDZ与
CoCl2、NAA组合能否进一步提高再生率需要继续
试验。
(3)胚性愈伤的诱导是植株再生的关键。本文
通过 TDZ的合理使用获得了胚性愈伤并实现胚性
愈伤的再生 ,获得最高达 30个芽 ·块 - 1愈伤的再生
植株。欧阳权等 [ 10 ]通过切片获得胚性愈伤的特征
为细胞小、质浓、核明显 ,外观特征为表面光滑、湿
润、呈深红色或淡红色、颗粒状、凹凸不平 ,这与本试
验再生的胚性愈伤高度一致 ;但本试验只有部分胚
性细胞团实现再生 ,这可能与使用材料是组培苗 ,诱
导的胚性愈伤发育和发展不完全 ,胚性细胞的活力
不强等原因有关。提高胚性愈伤的再生率是进一步
值得研究的问题。
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