全 文 ：收稿日期 : 2004203210
基金项目 : 中国科学院资助项目 ( Kscx22sw2108)
作者简介 : 索志立 (1964 —) ,男 ,博士 ,主要从事植物遗传育种学、园艺植物学以及系统与进化植物学研究.
林业科学研究　2004 ,17 (6) :700～705
Forest Research
　　文章编号 :100121498 (2004) 0620700206
杨山牡丹和牡丹种间杂交后代的
DNA 分子证据
索志立1 , 周世良2 , 张会金1 , 张治明1
(11 中国科学院植物研究所 ,北京　100093 ; 21 中国科学院植物研究所系统与进化植物学开放实验室 ,北京　100093)
摘要 :以杨山牡丹作母本 ,分别以牡丹品种‘赵粉’( Paeonia suffruticosa Andr. cv.‘Zhao Fen’)和‘紫二乔’
( P1 suffruticosa cv.‘Zi Er Qiao’)作父本 ,进行人工杂交 ,获得了杂交后代。利用 DNA ISSR 标记技术构
建的亲子代 DNA 指纹图谱显示 ,在杂交后代中检测到了分别来自双亲的特征带。建立起来的专用于
牡丹研究的 ISSR 标记技术方法可以用于牡丹杂交种的苗期快速鉴定。
关键词 :杨山牡丹 ;牡丹 ;杂交 ; ISSR 标记 ;DNA 指纹图谱 ;品种鉴定
中图分类号 :S68211 　　　文献标识码 :A
杨山牡丹 ( Paeonia ostii T1Hong et J1X1Zhang) 由洪涛等[1 ] 于 1992 年首次发表 ,为芍药科
(Paeoniaceae)芍药属 ( Paeonia L1)牡丹组 (Section Moutan DC) 革质花盘亚组 (Subsect1 Vaginatae
F1 C1 Stern)的落叶亚灌木 ,是中国栽培牡丹品种的近缘野生种之一[1～16 ] 。中国牡丹的起源和
演化一直是研究的热点[4～16 ] 。邹喻苹等[4 ]利用随机引物扩增 DNA 多态性 (RAPD) 标记的分析
结果显示杨山牡丹与紫斑牡丹 ( P1 rockii (S1G1Haw et L1A1Lauener) T1Hong et J1J1Li) 、卵叶牡
丹( P1 qiui Y1L1Pei et Hong) 、四川牡丹 ( P1 decomposita Hand12Mazz1) 、延安牡丹 ( P1 yananensis
T1Hong et M1R1Li)以及矮牡丹 ( P1 jishanensis T1Hong et W1Z1Zhao) 亲缘关系较近 ,推测这几个
野生种同步于革质花盘亚组 ,可能都参与了中国栽培牡丹品种的起源[4 ,8 ,10 ,12～14 ,16 ] 。花粉形态
特征也支持杨山牡丹是中国牡丹栽培品种的主要起源种之一[15 ,16 ] 。利用 RAPD 分子标记技术
对牡丹组野生种和品种的研究规模都相对较小 ,虽然揭示了一些规律 ,但多数研究仍局限于实
验条件及研究方法的探索阶段[17～23 ] 。微卫星序列为短串联重复 DNA 序列 ,是几个碱基对 (一
般为 1～5 个)的一个重复片段 ,如 (CA) n 、( GAG) n 、( GACA) n 等 ,称为简单重复序列 (Simple Se2
quence Repeats ,简称 SSR) 。在真核生物的整个基因组中广泛存在。根据微卫星序列设计引
物 ,直接 PCR 扩增微卫星位点之间的区域 ,检测遗传多态性的分子标记技术称为 ISSR ( Inter2
simple sequence repeat) 标记技术。ISSR 标记是继 RAPD 标记之后出现的一种新的 DNA 分子标
记 ,具有稳定性较好的特点。近年来 ,在国际上已广泛应用于物种及栽培品种的起源、演化、亲
缘关系以及分子标记辅助育种等方面的研究[20 ,24 ] 。笔者以杨山牡丹作母本 ,以牡丹品种‘赵
粉’( P. suff ruticosa Andr. cv.‘Zhao Fen’) 和‘紫二乔’( P. suff ruticosa cv.‘Zi Er Qiao’) 作父本
( ♂) ,进行人工杂交 ,并利用 ISSR 标记技术对亲子代进行鉴定 ,目的在于 : (1) 为杨山牡丹起源
中国栽培牡丹品种的途径的存在寻找 DNA 分子证据 ; (2) 为牡丹品种的苗期快速鉴定以及为
牡丹的种和种下水平的分类及系谱关系的研究探索新的 DNA 分子标记方法。
1 　材料与方法
111 　供试材料与杨山牡丹后代的获得
如表 1 所示 ,以中国科学院植物研究所北京植物园引自河南省内乡宝天曼的 15 年生以上
的杨山牡丹作母本 ( ♀) ,分别以 12 年生以上的牡丹品种‘赵粉’和‘紫二乔’作父本 ( ♂) ,春季
花蕾开放前套袋隔离 ,采集花粉 ,进行人工杂交 ,当年秋季获得杂交子代种子 ,随即播种育苗。
翌年春季 ,采集亲本及其子代的叶片 ,用硅胶快速干燥后备用。用于 ISSR 分析的样品有二个
杂交组合含共同的母本杨山牡丹。组合 Ⅰ包括杨山牡丹、‘赵粉’及其杂交子代 (杨山牡丹 ×
‘赵粉’) ;组合 Ⅱ包括杨山牡丹、‘紫二乔’及其杂交子代 (杨山牡丹 ב紫二乔’) 。
表 1 　供试材料
个体号
(杂交组合号) 植物名称 年龄Πa 主要特征 来源
1 ( Ⅰ)
　
‘赵粉’( ♂)
　
12～15
　
花粉色 ;皇冠型 ,有时呈荷花型、金环
型或托桂型
山东省菏泽
　
2 ( Ⅰ, Ⅱ) 杨山牡丹 ( ♀) 15～18 花白色 ;花瓣基部具浅紫晕、单瓣型 河南省内乡宝天曼
3 ( Ⅰ) 杨山牡丹ב赵粉’(F1 代) 1 幼苗 人工杂交
4 ( Ⅱ) ‘紫二乔’( ♂) 12～15 花复色 ;蔷薇型 山东省菏泽
5 ( Ⅱ) 杨山牡丹ב紫二乔’(F1 代) 1 幼苗 人工杂交
112 　DNA提取与引物筛选
采用 CTAB 法[25 ] 从叶片中提取总 DNA ,用 RNA 酶 ( RNase) 消化后 ,将总 DNA 溶于 TE
(1mmol·L - 1 Tris2HCl (pH810) ,011 mmol·L - 1 EDTA (pH810) )溶液中 ,标定浓度后备用。
从 70 个 ISSR 引物中筛选出能获得清晰条带、反应稳定的 5 个引物用于正式 PCR 扩增。
引物编号、序列和退火温度分别为 : (1) ISSR201 : (CA) 6 RG,50 ℃; (2) ISSR203 : (CT) 8 RC ,52 ℃;
(3) ISSR204 : (CT) 8 RG,52 ℃; (4) ISSR205 : (CTC) 4 RC ,48 ℃; (5) ISSR213 : (AGTG) 4 ,48 ℃。在引
物序列中 ,R = AΠG。
113 　ISSR2PCR实验
ISSR2PCR 扩增在 T2personal 48 型 PCR 仪中进行。25μL PCR 反应体系中 ,含 25 ng DNA 模
板 ,10 mmol·L - 1 Tris2HCl (pH813) ,50 mmol·L - 1 KCl ,210 mmol·L - 1 of MgCl2 ,1 mmol·L - 1 dNTP ,
012μmol·L - 1引物和 1 U Taq DNA 聚合酶。引物和 Taq 酶购自宝生物工程 (大连) 有限公司。
PCR 程序为 :94 ℃预变性 3 min ;94 ℃变性 40 s ,Ta (各 ISSR 引物的退火温度) 15 s ,72 ℃延伸
115 min ,38 个循环 ;最后 ,72 ℃延伸 8 min。PCR 产物用 20 g·kg - 1琼脂糖 (Promega 公司)凝胶在
TBE缓冲液中 3 V·cm - 1的电压下电泳 315 h ,溴化乙锭染色。用 BIO2RAD 公司的凝胶成像系
统摄影 ,如图 1 所示。
107第 6 期 索志立等 :杨山牡丹和牡丹种间杂交后代的 DNA 分子证据
　　A :ISSR201 引物 ;B : ISSR203 引物 ;C : ISSR204 引物。图中样品号 (泳道号)分别为 :1 ———‘赵粉’( ♂) ,2 ———杨山牡丹
( ♀) ,3 ———杨山牡丹ב赵粉’(F1 代) ,4 ———‘紫二乔’( ♂) ,5 ———杨山牡丹 ב紫二乔’( F1 代) 。M 为 100 bp Ladder
DNA 分子量标准。
图 1 　牡丹杂交后代及其亲本的 DNA ISSR 标记电泳结果
114 　数据分析
长度为 200～1 200 bp 之间的清晰而稳定的 ISSR2PCR 扩增片段用于统计分析 ,用 Quantity
One 软件 (Version 41211)计算扩增片段的分子量。各个样品在同一位点上有扩增片段时记为
1 ,无扩增片段时记为 0 ,构建 0 ,1 矩阵。根据 0 ,1 矩阵生成各个体的 DNA 指纹图谱。计算 Nei
氏遗传距离。利用 PAUP 3 410b10 软件 ,采用邻接法进行聚类分析。
2 　结果与分析
211 　ISSR2PCR扩增结果
利用 DNA 分子标记对亲子代关系的鉴定通常需要在杂交后代中检测到如下证据 : (1) 与
双亲共同具有的位点 (或扩增带) ; (2)分别与亲本之一共同具有的位点 (或扩增带) ;如果满足
这样的条件则表明两个亲本之间发生了遗传重组[26 ,27 ] 。
在本研究中 ,如 DNA 指纹图谱 (表 2)所示 ,在杂交组合 Ⅰ中共检测到 40 个位点 ,其中双亲
与子代的共有位点为 25 个 ,子代与父本 (‘赵粉’) 的共有位点有 3 个 (编号分别为 : IS0421007、
IS042885 和 IS042785) ,子代与母本 (杨山牡丹) 的共有位点有 6 个 (编号分别为 : IS012600、IS032
688、IS032400、IS052920、IS132815 和 IS132692) 。在组合 Ⅱ中共检测到 43 个位点 ,其中双亲与子
代的共有位点为 24 个 ,子代与父本 (‘紫二乔’)的共有位点有 4 个 (编号分别为 : IS032742、IS042
885、IS1321142 和 IS132590) ,子代与母本 (杨山牡丹) 的共有位点有 5 个 (编号分别为 : IS012655、
IS032688、IS132900、IS132815 和 IS132692) 。
207 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 17 卷
表 2 　利用 5 个 ISSR引物获得的杂交后代及其亲本的 DNA指纹图谱的比较
212 　遗传距离及聚类分析
如表 3 所示 ,在杂交组合 Ⅰ中 ,F1 代与其母本间的遗传距离为 01086 ,与其父本间的遗传
距离为 01147 ;在组合 Ⅱ中 ,F1 代与其母本间的遗传距离为 01139 ,与其父本间的遗传距离为
01211。相对于父本而言 ,两个组合中的 F1 代在遗传上与母本较近。在图 2 中 ,两个半同胞子
代首先与其母本杨山牡丹聚类在一起。两个牡丹品种 (‘赵粉’和‘紫二乔’) 之间的遗传距离
(01194)略大于其与杨山牡丹之间的遗传距离 (01176 和 01188) ,这暗示品种间的遗传分化较
大、品种遗传背景较复杂。
表 3 　杨山牡丹后代及其亲本之间的 Nei 氏遗传距离矩阵
个体号
(杂交组合号)
名　　称 1 2 3 4 5
1 ( Ⅰ) ‘赵粉’( ♂) 01000
2 ( Ⅰ, Ⅱ) 杨山牡丹 ( ♀) 01176 01000
3 ( Ⅰ) 杨山牡丹ב赵粉’(F1 代) 01147 01086 01000
4 ( Ⅱ) ‘紫二乔’( ♂) 01194 01188 01246 01000
5 ( Ⅱ) 杨山牡丹ב紫二乔’(F1 代) 01286 01139 01139 01211 01000
3 　讨论与结论
分子生物学技术的发展已经能够直接利用 DNA 所含的信息研究植物品种遗传资源评价
307第 6 期 索志立等 :杨山牡丹和牡丹种间杂交后代的 DNA 分子证据
分支上的数字是 1 000 次重复抽样检测的自展 (bootstrap)值
图 2 　杂交后代与其亲本之间遗传关系的邻接树
和品种分类[4 ,17～29 ] 。在牡丹的研究方面 ,
Sang 等[28 ,29 ]用核基因 ITS、叶绿体基因 mat K、
psbA2trnH 和 trnL2trnF 间隔区序列数据揭示
了芍药属牡丹组的 5 个物种的系统关系。然
而 ,上述基因序列在牡丹组物种间的分化已
经很小 ,在品种水平上没有分辨率。本研究
结果表明 DNA 指纹技术 (如 ISSR 标记技术)
在牡丹种和种下分类等级上非常有效。类
似的研究很多 ,例如 ,红莲型杂交稻 ( Oryza
sativa L1 ) (红莲 2 号 , HL2type hybrid rice
(Honglian22) )及其骨干亲本的 RAPD 分析也
显示杂种中出现了双亲均具有的标记[25 ] ,在
中国主栽的汕优杂交稻 ( Oryza sativa L1) (rice
hybrids :“Shanyou 63”、“Shanyou 64”和“Shanyouwan 3”) 中检测到双亲带型的 RAPD 标记互补
带[26 ] ,这相当于本研究中在杨山牡丹后代中检测到的分别与各亲本共同具有的位点。
综上所述 , ISSR 分子标记技术可以用于研究牡丹的种间、种内以及种下水平的分类和遗
传关系以及杂交种的鉴定。
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DNA Molecular Evidences of the Inter2specif ic Hybrids
between Paeonia ostii and P . suffruticosa Based on ISSR Markers
SUO Zhi2li1 , ZHOU Shi2liang2 , ZHANG Hui2jin1 , ZHANG Zhi2ming1
(11Institute of Botany ,Chinese Academy of Sciences ,Beijing 　100093 ,China ;
21Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany ,Institute of Botany ,Chinese Academy of Sciences ,Beijing 　100093 ,China)
Abstract : Paeonia ostii was believed to be one of the main progenitors of the Chinese tree peony cultivars ,and
hybridization was the most important pathway for incorporation of genetic composition of P. ostii . However ,no
experimental evidence had been reported till now. In this study , P. ostii was used as a maternal parent crossing
with other two Chinese tree peony cultivars which were used as paternal parents. The relationships between the F1
hybrids and their parents were analyzed by means of DNA fingerprinting based on ISSR ( Inter2simple sequence
repeats) markers ,and ISSR fragments typically inherited from both parents were detected in the genomes of the
F1 generation. This study also indicated that ISSR marker was suitable for identification of F1 hybrids in P. suf2
fruticosa at seedling stage.
Key words : Paeonia ostii ; P. suffruticosa ;crossing ; ISSR Marker ;DNA fingerprinting ;cultivar identification
507第 6 期 索志立等 :杨山牡丹和牡丹种间杂交后代的 DNA 分子证据