全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 4) : 617 鶫 621
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 04-0617-05
农杆菌介导的 SeNHX1 基因转化月季愈伤组织的研究
刘会超1 , 刘孟刚1 , 郭丽娟2 , 贾文庆1
( 1. 河南科技学院园林学院 , 河南 新乡 453003 ; 2 . 河南科技学院新科学院 , 河南 新乡 453003)
关键词: 月季; 遗传转化; 农杆菌介导; SeNHX1 基因
中图分类号: S722.3 文献标识码: A
收稿日期 : 2009-09-10
基金项目 : 河南省基础与前沿研究项目 ( 082300430030 ) ; 创新人才工程项目 ( 2005126-49) ; 河南科技学院博士基金资助项目 ( HK05-
1226)
作者简介 : 刘会超 ( 1964— ) , 男 , 博士 , 副教授 , 主要从事观赏植物生物技术研究 . 通讯作者 : E-mail: liuhc918@ yahoo. com. cn
Studies on Agrobacterium-mediated Transformation
of Rose Callus with SeNHX1 Gene
LIU Hui-chao
1
, LIU Meng-gang
1
, GUO Li-juan
2
, JIA Wen-qing
1
( 1. School of Horticulture Landscape Architecture, He’nan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, He’nan, China;
2. Xinke College of He’nan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, He’nan, China)
Abstract: ‘Pink Peace’rose was used to study the optimum conditions for transferring the SeNHX1 gene into the
callus. The results showed that the optimal medium was MS + 2, 4-D 5. 0 mg·L- 1 + TDZ 0. 5 mg·L- 1. Agrobac-
terium tumefaciens-mediated transformation was able to take the target gene into callus and the blue spots were
found. The optimum conditions for the transient expression of gusA gene are as following: bacterium density of OD
was 0. 5, infection time was 20 min, culture time was 3 days. Adding 100 μmol· L - 1 AS, the frequency of
transient expression of GUS gene was the highest, which reached about 85% in present study.
Key words: Rosa chinensis; genetic transformation; Agrobacterium-mediated; SeNHX1 gene
月季( Rosa chinensis Jacq. ) 原产于我国, 是我国
十大名花之一 [ 1] 。月季的种植种类和数量居观赏花
卉之首 [ 2 - 3 ] 。目前我国有大量的盐碱地和次生盐渍
化土壤, 急需培育抗盐植物新品种, 以开发利用盐碱
地。现在利用基因工程技术, 已经对小麦 ( Triticum
aestivum Linn. )
[ 4 ] 、水稻 ( Oryza sativa L. ) [ 5 ] 、烟草
( Nicotiana tabacum L. )
[ 6] 、丹参 ( Salvia miltiorrhiza
B. ) [ 7 ] 、火炬松 ( Pinus taeda Linn. ) [ 8 ] 等植物开展了
耐盐转基因的研究, 而关于月季耐盐基因遗传转化
研究则报道较少。SeNHX1 基因是从盐角草 ( Sali-
cornia europaea Linn. ) 中克隆获得的, 通过氨基酸序
列和同源性分析表明, SeNHX1 基因是液泡型 Na+ /
H
+ 反向运输蛋白基因 [ 9 ] 。Na+ /H + 反向运输蛋白
是一个跨膜蛋白, 具有 12 个跨膜区域, 利用质膜
H + -ATPase 或液泡膜 H + -ATPase 及 PPiase 泵 H + -
ATPase 产生的驱动力, 把细胞质中过多的 Na+ 阻隔
于液泡中, 以减少胞质中 Na+ 对细胞代谢产生的毒
性, 同时起到调节细胞渗透胁迫的作用 [ 10 - 11] 。本研
究通过农杆菌介导法将抗盐 SeNHX1 基因导入月
季, 希望得到耐盐的月季植株, 并为开展月季抗盐分
子育种提供技术上的支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验试材为‘粉和平’月季的幼嫩叶片, 取自河
南科技学院园林植物资源与生物技术实验室月季品
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
种资源圃。
1. 2 菌株和质粒
根癌农杆菌菌株 EHA105 由国家小麦中心提
供。转化所用载体 pBI121-Se( 图 1) 由中国科学院
植物研究所提供。pBI121-Se 含 CaMV35S 启动子调
控的 β-葡糖苷酸酶 ( GUS) 报告基因和抗卡那霉素
( Kan) 筛选的新霉素磷酸转移酶 ( NPTⅡ) 基因及抗
盐 SeNHX1 基因。( Genbank登录号: AY131235) 。
图 1 植物表达载体 pBI121-Se 的结构示意图
1. 3 方法
1. 3. 1 愈伤组织的获得 5 月 10 日, 在河南科技
学院园林植物资源与生物技术实验室月季品种资源
圃, 取月季顶生第 3 片嫩叶( 叶片边缘和背面均呈红
色) , 先用自来水冲洗 10 min, 然后经 0. 1% 多菌灵
和 40 万单位的青霉素混合溶液浸泡 10 min, 再用蒸
馏水冲洗 3 次, 无菌滤纸吸干表面水分后置于超净
工作台上用 75% 酒精消毒 30 s, 再用 5% 次氯酸钠
( 安替富民) 溶液浸泡 8 min, 无菌水冲洗 5 次。叶片
切成 0. 5 cm×0. 5 cm 小块用于接种。月季叶片愈
伤组织诱导以 MS为基本培养基, 添加不同浓度( 1、
3、5 mg·L - 1 ) 的 2, 4-D( 2, 4-二氯苯氧乙酸) 、TDZ
( ?苯隆 ) ( 0. 5、1. 0、2. 0 mg·L - 1 ) 等生长调节剂,
以上培养基均加蔗糖 30 g·L - 1 , 琼脂 5. 2 g·L - 1 ,
pH 值 5. 8。接种后每 5 d 观察 1 次, 愈伤组织的生
长量以测量愈伤直径的大小表示。
培养条件: 温度为 ( 22 ±1) ℃, 黑暗条件下培养
8 d。
1. 3. 2 农杆菌液的活化与工程菌液的制备 参照
王关林 [ 12] 的方法略有修改。将带有目的基因的中
间载体质粒 DNA 导入农杆菌, 并保存菌液。菌种在
加有 50 mg·L - 1 卡那霉素 ( Kan) 、50 mg·L - 1 利福
平( Rif) 的 LB 固体培养基上划线培养。转化实验前
挑取单菌落接种于加有 50 mg·L- 1卡那霉素和 50
mg·L - 1利福平的 LB 液体培养基中, 28 ℃、180 r·
min
- 1恒温摇床振荡培养过夜, 使菌液 OD 值调节到
合适值( 一般 OD600 =0. 2 鶫 0. 8) , 备用。
1. 3. 3 农杆菌介导遗传转化 将诱导 20 鶫 30 d 的
新鲜愈伤组织置于农杆菌菌液中浸泡 5 鶫 50 min
后, 取出并用无菌滤纸吸去表面多余菌液, 接入加有
AS( 乙酰丁香酮) ( 50 鶫 200 μmol·L - 1 ) 的培养基
中共培养, 在( 25 ±1) ℃、黑暗条件培养 2 鶫 5 d, 以
未侵染的外植体作为对照。每处理接 8 个板, 每板 5
个外植体。共培养后, 用无菌滤纸将外植体周围菌
液吸干, 转接到分化培养基上: MS + 1. 0 mg·L - 1 6-
BA ( 6-苄氨基?呤) + 0. 01 mg·L - 1 NAA( 萘乙酸)
+ 0. 1 mg·L - 1 GA3 ( 赤霉素 ) 上并添加 200 mg·
L - 1 ( Cef) 头孢霉素, 观察叶片外植体再生情况。
1. 3. 4 GUS基因瞬间表达的检测 共培养 2 鶫 5 d
后, 对愈伤组织进行 GUS检测, 检测方法按 Rueb[ 13 ]
的方法稍作修改。组织化学染色液的组成为: 0. 5
mg· mL - 1 X-gluc ( 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡 萄糖
苷) 、50 μL· mL - 1 Triton X-100、200 μL·mL - 1 甲
醇、500 μL·mL - 1 磷酸缓冲液 ( pH 7. 0) [ 1 4] 。分别
共培养 2、3、4、5 d 后, 取不同处理的外植体, 无菌水
冲洗 3 次, 无菌滤纸吸干, 放入 1. 5 mL的离心管中,
并加入 GUS 反应液, 37 ℃水浴保温过夜, 反应后
70% 的酒精脱色, GUS 基因表达呈阳性者可在肉眼
下观察到蓝色反应, 然后 统计 GUS 基因瞬间表
达率。
GUS基因瞬间表达率 = ( 有蓝色反应的外植体
数 /总外植体数) ×100%
1. 3. 5 转化条件的优化 本试验设置 4 个因素来
研究外界因子对遗传转化的影响: A、侵染时间 ( 5、
20、35、50 min) ; B、共培养培养基中 AS 浓度( 0、50、
100、150、200 μmol· L - 1 ) ; C、菌液浓度 ( OD600 =
0. 2、0. 5、0. 8) ; D、共培养时间 ( 2、3、4、5 d) 。试验
设 3 次重复。
1. 3. 6 数据分析 采用 Microsoft Excel 软件处理数
据和作图, 采用 DPS统计软件中的 Duncan新复极差
法对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同激素对愈伤组织诱导的影响
月季叶片的愈伤组织最早是在叶脉处产生的,
叶片接入诱导培养基后( 图 2 a) , 经 6 d 培养叶片开
816
第 4 期 刘会超等: 农杆菌介导的 SeNHX1 基因转化月季愈伤组织的研究
始向近轴面方向卷曲 ( 图 2 b) , 约 10 d 后大部分叶
片边缘开始出现膨大, 第 14 天左右叶缘有米粒大乳
白色愈伤组织, 之后在叶片边缘产生带状或块状的
愈伤组织( 图 2 c) 。
图 2 月季叶片愈伤组织生长过程及根癌农杆菌侵染后 GUS 基因瞬时表达情况
从表 1 可以看出: 2, 4-D 3. 0 mg· L - 1 + TDZ
0. 5 mg·L - 1和 2, 4-D 5. 0 mg·L - 1 + TDZ 0. 5 mg·
L- 1培养基的月季叶片愈伤组织诱导率最高, 分别为
99. 25、98. 30% , 极显著高于其他培养基的诱导率;
单独添加 2, 4-D 的培养基能够诱导出叶片愈伤组
织, 颜色呈乳白色, 且长势比 2, 4-D 与 TDZ 共同作
用的效果好, 生长量达到了‘+ + + ’, 但是其诱导
率较低( <75% ) , 而仅添加细胞分裂素( 如 TDZ) 的
培养基则很难诱导出愈伤组织; 从试验结果看, 2, 4-
D 与 TDZ 共同作用的情况下, 则易形成愈伤组织, 颜
色为浅黄色, 较为致密, 且诱导率均比较高。
表 1 不同培养条件对月季叶片愈伤组织诱导的影响
激素配比 诱导率 / % 愈伤组织颜色 生长量
2 , 4-D 1 . 0 mg·L - 1 46 . 90 ±4. 38Ef 乳白 +
2 , 4-D 3 . 0 mg·L - 1 69 . 50 ±1. 56CDd 乳白 + + +
2 , 4-D 5 . 0 mg·L - 1 74 . 25 ±1. 65BCc 乳白 + + +
TDZ 0. 5 mg· L - 1 0 . 00 ±0. 00Fg - - - -
TDZ 1. 0 mg· L - 1 4 . 20 ±1. 98Fg 乳白 +
TDZ 2. 0 mg· L - 1 0 . 00 ±0. 00Fg - - - -
2 , 4-D 1 . 0 mg·L - 1 + TDZ 0. 5 mg· L - 1 80 . 60 ±0. 42Bb 浅黄 + +
2 , 4-D 3 . 0 mg·L - 1 + TDZ 0. 5 mg· L - 1 99 . 25 ±1. 06Aa 浅黄 + +
2 , 4-D 5 . 0 mg·L - 1 + TDZ 0. 5 mg· L - 1 98 . 30 ±1. 53Aa 浅黄 + +
2 , 4-D 1 . 0 mg·L - 1 + TDZ 1. 0 mg· L - 1 64 . 01 ±0. 42De 浅黄 + +
2 , 4-D 3 . 0 mg·L - 1 + TDZ 1. 0 mg· L - 1 95 . 40 ±1. 13Ab 浅黄 + +
2 , 4-D 5 . 0 mg·L - 1 + TDZ 1. 0 mg· L - 1 42 . 95 ±0. 35Ef 浅黄 + +
注 : 表中“- - ”表示未生长 , “+”表示生长一般 , “+ + ”表示生长较好 , “+ + +”表示生长最好 ; 不同大写字母表示差异极显著 , 不同小写
字母表示差异显著 , 相同大、小写字母表示差异不显著。
2.2 根癌农杆菌菌液浓度及感染时间对 GUS 基因
瞬时表达的影响
根癌农杆菌浓度及感染时间是影响遗传转化频
率的重要因子。本试验设置农杆菌菌液 OD600 值为
0. 2、0. 5、0. 8; 感染时间为 5、20、35、50 min 4 个梯
度, 共培养后检测 GUS基因的瞬时表达率。感染后
GUS的瞬时表达如图 3 及图 2d 所示, 感染时间为 20
min, 农杆菌 OD 值为 0. 5, GUS 瞬时表达率最高, 达
到 85. 7% ; 当感染时间过长( > 35 min) , 外植体容易
因农杆菌的毒害作用缺氧而导致变黑褐化, 甚至死
亡; 感染时间过短( 5 min) , 则在其共培养时愈伤组
织并没有完全与农杆菌接触, 致使 DNA 转移不充
分, GUS瞬时表达率较低。
图 3 农杆菌菌液浓度、感染时间对 GUS瞬时表达率的影响
916
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
2.3 共培养对 GUS基因瞬时表达的影响
共培养时间设置 0、1、2、3、4、5 d 6 个梯度, 培养
后检测 GUS 基因的瞬时表达率。共培养后进行染
色瞬间表达。由表 2 可知: 第 2 天瞬时表达率为
48. 39% , 第 3 天达到最大值( 76. 67% ) 。综合研究
结果可知, 愈伤组织最佳共培养的天数为 3 d。
表 2 不同共培养天数对 GUS 瞬时表达率的影响
共培养天数
/ d
GUS 染色数
/个
有蓝点的
外植体数 /个
表达率 /% 染色状态
0 30 0 0. 00 - -
1 31 7 22. 58 +
2 31 15 48. 39 + +
3 30 23 76. 67 + + +
4 33 18 54. 55 + +
5 32 13 40. 63 + +
注 : 表中“- - ”表示没有蓝点 , “+ ”表示蓝点大小一般 , “+ + ”
表示蓝点大小较好 , “+ + +”表示蓝点大小最好。
2.4 添加乙酰丁香酮( AS) 对转化的影响
AS 能够激活 vir 区基因和诱导该基因高效表
达, 提高根癌农杆菌对宿主的表达率和敏感性, 促进
Ti 质粒向宿主细胞核中转移。图 4 表明: 共培养的
培养基中添加 AS 对保证 T - DNA 的转移非常必要,
没添加 AS的表达率仅为 3. 13% ; 当加入 50 μmol·
L- 1 AS时, GUS 瞬间表达率达到 35. 48% ; 浓度达到
200 μmol·L - 1时, GUS瞬间表达率显著提高, 达到
83. 87% 。
图 4 添加不同浓度的 AS对 GUS瞬时表达率的影响
3 结论与讨论
在诱导月季叶片愈伤组织时, 添加不同植物生
长调节剂组合对愈伤组织诱导率有明显提高, 生长
素( 2, 4-D) 能够很好的促进愈伤组织的产生和生
长, 而细胞分裂素( TDZ) 则对愈伤的诱导效果影响
较小, 仅添加 TDZ 的培养基中很难长出愈伤组织,
在生长素和细胞分裂素共同作用下则能够长出愈伤
组织, 且效果较好。愈伤组织先从叶脉处产生, 且产
生的时间比叶缘处要早, 这与朱登云 [ 15 ] 的结论相
同, 这可能是由于叶脉比较粗大, 在运输营养物质
时, 能得到更多的营养, 易于愈伤组织的形成。本实
验得到的诱导愈伤组织最佳培养基为: MS + 2, 4-D
3. 0 mg·L - 1 + TDZ 0. 5 mg·L - 1。
在优化月季遗传转化试验中, 有诸多因素( 农杆
菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间、添加 AS 量等)
影响表达率的高低, 这些因素主要通过影响农杆菌
对植物细胞的附着、植物细胞释放的信号分子诱导
Vir 区基因的表达, T - DNA 的转移和在植物核基因
组上的整合、表达等方面, 其中共培养的时间控制则
更为关键, 主要是由于农杆菌附着、T-DNA 的转移及
整合都在共培养时期内完成 [ 12 ] , 直接影响着目的基
因 整 合 及 转 化 细 胞 的 数 量, 从 而 影 响 转 化 效
率 [ 1 6 - 17 ] 。本试验结果表明, 共培养 3 d 的效果最
好, 这与 Aswath[ 18 ] 和王关林等 [ 1 9] 的研究结果相同。
乙酰丁香酮可以激活 vir 区基因和诱导该基因
高效表达, 提高根癌农杆菌对宿主的表达率和敏感
性, 促进 Ti 质粒向宿主细胞核中转移, 达到提高遗
传表达率的目的。试验结果显示: AS是遗传转化所
必 须的, 这 与 James 等 [ 20 ] 对 苹果 ( Malus pumila
Mill. ) 愈伤组织研究的结果相似, 但是 AS 浓度的提
高会导致农杆菌过量生长影响愈伤组织的正常生
长。本试验中 AS 浓度在 100 鶫 150 μmol·L - 1 时,
对表达率的影响并不明显。因此, 添加 100 μmol·
L - 1 AS 能获得较好的转化效果和愈伤组织生长
情况。
本研究结果表明: 农杆菌侵染法可以使目的基
因转入受体, GUS 染色呈阳性, 得到蓝色斑点, 但是
斑点颜色的深浅不一, 可能是目的基因受体细胞的
表达量存在差异。由于月季愈伤组织中的酚类物质
比较多, 很容易被氧化成醌类物质, 导致愈伤组织发
生褐化, 掩盖 GUS 染色的蓝色斑点, 添加一些抗氧
化剂( 如活性炭、PVP 等) 是否对愈伤组织生长、芽
分化以及表达率有影响, 如何既能防止褐化、又有效
的提高表达率以解决月季遗传转化研究的关键问
题, 还有待于进一步的研究。
参考文献:
[ 1 ] 陈有明 . 园林树木学 [ M] , 北京 : 中国林业出版社 , 1990
[ 2 ] Schneider J H M, Jacob J J S′, van Pol P A, et al. Rosa multiflora
‘Ludiek?a rootstock with resistant features to the root lesion nematode
Pratylenchus vulnus[ J] . Scientia Horticulturae, 1995, 63: 37 - 45
[ 3 ] 刘会超 , 郭丽娟 , 贾文庆 . 月季组织培养研究进展 [ J] . 河南科技
026
第 4 期 刘会超等: 农杆菌介导的 SeNHX1 基因转化月季愈伤组织的研究
学院学报 : 自然科学版 , 2007 , 35( 3 ) : 45 - 48
[ 4] 郭北海 , 张艳敏 , 李洪杰 , 等 . 甜菜碱醛脱氢酶 ( BADH) 基因转化
小麦及其表达 [ J] . 植物学报 , 2000, 42( 3) : 279 - 283
[ 5] 李南羿 , 郭泽建 . 转录因子 OPBP1 和 OsiWRKY 基因的超表达提
高水稻的耐盐及抗病能力 [ J] . 中国水稻科学 , 2006, 20 ( 1 ) : 13
- 18
[ 6] Tarczynski M C, Jensen R G, Bohnert H J. Stress protection of trans-
genic tobacco by production of the osmolyte mannitol[ J] . Science,
1993 , 259: 508 - 510
[ 7] HAN Li-Min, YU Jia-Ning, JU Wen-Feng. Salt and drought tolerance
of transgenic Salvia miltiorrhiza Bunge with the TaLEA1 gene[ J] .
Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2007, 33( 2) : 109
- 114
[ 8] TANG Wei. Regeneration of transgenic loblolly pine expressing genes
for salt tolerance[ J] . Journal of Forestry Research, 2002 , 13 ( 1) : 1 -
6
[ 9] 吕慧颖 . 盐生植物盐角草、番杏 N +a /H + 逆向转运蛋白基因克隆
及特性研究 [ D] . 哈尔滨 : 东北农业大学 , 2003
[ 10] 王 劲 , 杜世章 , 刘君蓉 . 植物耐盐机制中的 N+a /H + 逆向转运
蛋白 [ J] . 绵阳师范学院学报 , 2006 , 25( 2 ) : 47 - 50
[ 11] 杨小玲 , 季 静 , 王 罡 , 等 . SeNHX1 与 GFP 融合基因在酵母
中表达及其耐盐性表现 [ J] . 华北农学报 , 2008 , 23( 4 ) : 60 - 64
[ 12] 王关林 , 方宏筠 . 植物基因工程 [ M] . 北京 : 科学出版社 , 2002
[ 13 ] Rueb S, Hensgens L A M. Improved histochemical staining for β-D-
glucuronidase activity in monocotyledonous plants[ J] . Rice Genet-
ics Newslette, 1989, 6: 168 - 169
[ 14] 李永春 . 利用 Cry1Ac 和 CpTI 双价基因及组织特异启动子增强
转基因水稻对螟虫的抗性 [ D] . 杭州 : 浙江大学 , 2002
[ 15] 朱登云 , 田慧琴 , 李浚明 . 杜仲叶片和叶柄愈伤组织的诱导和植
株再生 [ J] . 植物研究 , 2001, 21( 2) : 206 - 209
[ 16] 郝贵霞 , 朱 祯 , 朱之悌 . 毛白杨遗传转化系统优化的研究 [ J] .
植物学报 , 1999, 41( 9) : 936 - 940
[ 17] Lin Y J, Zhang Q. Optimizing the tissue culture conditions for high
efficiency transformation of indica rice[ J] . Plant Cell Rep, 2005,
23: 540 - 547
[ 18] Aswath C R, Mo S Y, Kim S H, et al. IbMADS4 regulates the
vegetative shoot development in transgenic chrysanthemum( Den-
drathema grandiflora ( Ramat. ) Kitamura) [ J] . Plant Seience,
2004, 166( 4) : 847 - 854
[ 19] 王关林 , 刘彦乱 , 郭韶华 , 等 . 雪花莲凝集素基因转化菊花及转
基因植株 的抗 蚜性 研究 [ J] . 遗传 学 报 , 2004, 31 ( 12 ) : 1434
- 1438
[ 20] James D J, Uratsu S, Cheng J S, et al. Acetosyringone and os-
moprotectants like betaine or proline synergistically enhance
Agrobacterium-mediated transformation of apple [ J] . Plant Cell
Rep, 1993, 12 ( 10 ) : 559 - 563
126