全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"$#$#)$ #)-
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!!文章编号!$##$($)*+""#$%##$(##)$(#-
欧美杨新型溃疡病病株与健株干部树皮中
真$细菌优势种群分析
李!永$!"! 朴春根"! 贺!伟$!! 郭利民%! 常聚普%!
谢守江%! 郭民伟"! 林乐民)
"$,北京林业大学!北京!$###+%% ",中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所!北京!$###*$%
%,濮阳市林科所!河南 濮阳!)-###% ),中国林业科学研究院林业研究所!北京!$###*$#
收稿日期$ "#$"(#%(#$
基金项目$ 林业公益性行业科研专项""#$$#)#-)#%中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所院所基金"2作者简介$ 李!永"$*+,#!男!山东泰安人!助研!主要从事林木病害及菌种保藏V
!
通讯作者V
摘要!为探讨感染欧美杨新型溃疡病的中林 )& 杨植株干部病斑中真&细菌优势种类!本研究对河南省濮阳市中林 )&
杨健株&病株染病组织的可培养真菌&细菌优势种群进行了分析 结果表明$健康树皮样品分离真菌优势种群均为
,H&$#4(#0( (H&$#4(&(!染病株样品优势种群均为 !2%(#02L%"H(40!而且其菌株数量占所分离菌株总数的百分比均在
+-0以上%而在健康株 % 个处理中分离的细菌优势种群种类不同!仅 N0)#"J()&$#02L在健株 % 个处理树皮样品中均
有分布!但染病株 % 个处理树皮样品中的细菌优势种群均为 9"4%6(H$( ;2$#)04(!其菌株数量占所分离菌株总数的百
分比均在 &0以上 以上结果表明$中林 )& 杨发病以后!!F%"H(40和 9F;2$#)04( 分别变成了真菌和细菌的优势
种群
关键词!欧美杨%溃疡病%$&; @=/<%优势种群
中图分类号!;$+,+ 文献标识码!<
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QFCJ>@3C9?Q>AD>?FG9B@>>B>3P9BIQFQP3@S3@: ?3KQP>?3@>JDG>@>C9V!F%"H(403CJ 9F;2$#)04( S>A3K>9B>Q@>QFC(
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;,( <).:$@"G2H2%a$2#"(L$#0)(4(%A3C:>@JD?>3?>%$&; @=/<% JFKDC3C9QFQEP39DFC
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
我国天然林资源保护工程实施后!为解决我国
木材原材料的短缺现状!"##" 年 月国务院批准速
生丰产用材林基地建设工程为六大林业重点工程之
一正式实施 目前!我国杨树人工林总面积已达
## 多万 BK"!超过了其他国家杨树人工林面积的总
和!因此!杨树人工林保护对我国经济建设和生态环
境保护具有重要意义
欧美杨"@"G2H2%a$2#(L$#0)(4( "bFJ># 8EDCD(
>@#溃疡病是我国欧美杨"特别是中林 )& 和 $##上
新发生的病害!"##- 年 - 月!在河南濮阳首次观察
到在 & 年生 $# 杨树伤流溃疡病!主要症状为树皮
开裂&流汁液&韧皮部局部坏死等症状 目前!该病
害已在我国河南&山东&天津三省市部分地区大面积
发生和危害!对我国杨树人工林造成了重大威胁
据菏泽市林业局统计!"## 年菏泽市有 % 万 BK" 杨
树发生该病害 "##* 年!贺伟等*$+研究发现!在欧
美杨溃疡病病斑分离物中!镰刀菌属 "!2%(#02L
PDC:V#真菌占优势!以离体枝条水培接种和盆栽苗
木活体接种的方法进行的致病性试验表明!茄镰孢
菌"!2%(#02L%"H(40"53@9V# ;3AAV#具有致病性!认
为我国欧美杨溃疡病的病原菌为茄镰孢"!F%"H(1
40#!但未开展田间试验 本研究对欧美杨中林 )&
病树病斑和无症树树皮样品的可培养真菌&细菌进
行了分离和鉴定及优势种群分析!研究结果将为欧
美杨溃疡病病害发展过程中微生物动态变化以及病
害发展过程中真菌&细菌协同致病互作研究奠定
基础
$!材料与方法
=V=>样品的采集
样品采集地点位于河南省濮阳市清丰县杨树人
工林"$$-[#-\]!%-[-%\/# "##* 年 + 月!选择症状
典型的病株及周围无症树"树龄 - & 3#随机 % 点
采样!每点采集染病株 % 株!采集发病部位距地面 $
$,- K病树病斑树皮作为染病样品!长宽为 $#
$" AKa- & AK 健康样品采集部位和方式与发
病树相同"高度相同胸径部位#!用无菌袋包装!采
集的样品置于 ) ^保藏!并尽快进行真菌和细菌的
分离
=V?>真菌的分离培养及计数
染病和健康样品各 * 个!每个样品切取大小为
#,- #,& AKa$ $," AK"样品厚度约 #,% #,)
AK#的长方形组织块作为分离样品"共 * 个组织块!
% 个样品混合后作为 $ 个处理!设 % 个处理#!然后
用自来水冲洗树皮!)0次氯酸钠消毒 ) KDC"超净工
作台中操作#!灭菌水冲洗 % 次")- ?#!然后放入灭
菌研钵中用无菌手术刀片切成 " KKa" KK小组织
块"&# 个组织块_处理#!每个处理随机选取 )# 个小
组织块放置于马丁氏,孟加拉红培养基平板中")
个组织块_皿!共 $# 皿#!染病和健康样品分别培养
%# 皿!"+ ^培养 - J 计数 计数根据菌落形态
颜色等特征进行初步归类!统计每处理")# 个组织
块上#各种菌长出数量!取 % 个重复菌株数量的平均
数作为菌株数量
=VA>细菌的分离培养及计数
细菌分离方法参照牟新涛等*" U%+ &陈华红等*)+
的方法并作了部分修改!分别称取健康和染病组织
各 $,# 6"长方形!大小为 #,- #,& AKa$ $,"
AK#!% 个组织块混合后作为 $ 个处理"% 6#!设 % 个
处理!用自来水冲洗后!放入 )0次氯酸钠中消毒 )
KDC"超净工作台中操作#!灭菌水冲洗 % 次")- ?-
次 U$#!然后放入灭菌研钵中用无菌手术刀片切成 "
KKa" KK小组织块!加入适量灭菌石英砂研细!将
研磨的组织及液体倒入 " KZ无菌水的三角瓶中!
摇床振荡 %# KDC 作为稀释用样液 健康样品以
$#
U$
$#
U%稀释用样液 $##
)
Z涂板!染病组织以稀
释度 $# U% $# U-的稀释液 $##
)
Z涂板!细菌采用牛
肉膏蛋白胨培养基涂板培养"每个稀释度!涂 % 皿!
每个处理 * 皿!% 个处理共计 " 皿#!%# ^倒置培养
" J后计数及纯化培养
细菌计数!根据菌落形态&大小&颜色等分辨菌
种种类!然后统计每个平板菌株数量!取 % 个重复菌
株数量的平均数作为菌株数量!菌种数量比例是指
该菌种数量占平板总菌株数量的百分比
=VD>Q-8提取
$V)V$!细菌b/<提取!参照王彦芹等*-+细菌基因
组b/<的提取方法并做了部分修改!取 " KZ过夜
培养的菌悬液!$# ### @-KDCU$离心 % KDC!弃上清%
加 "##
)
ZO]LEG>@"$# KKFP-Z
U$
O@D?! $ KKFP-
Z
U$
]bO加 "##
)
Z提取缓冲液""0 "K_T# 2O-Z
U$
/32P! QN值 ,-#&"##
)
Z% KFP-Z
U$
/32P!混
匀%液氮和 $## ^环境反复冻融 " 次%加等体积氯仿
s异戊醇"")s$#!混匀!) ^ & ### @-KDCU$!离心 $#
KDC抽提 " 次%取上清!加 $_$# 体积的 /3-Z
U$
QN值 -,"#!加 " 倍体积 U"# ^预冷的无水
")
第 $ 期 李!永等$欧美杨新型溃疡病病株与健株干部树皮中真&细菌优势种群分析
乙醇!) ^$" ### @-KDCU$离心 $- KDC%弃上清!风干
沉淀!加 $##
)
ZJJN
"
`溶解沉淀! U"# ^冻存
备用
$V)V"!真菌 b/<提取!采用液氮_沸水反复冻融
方法提取*&+ !从培养 % - J 的菌落边缘取 % KKa%
KK的菌丝块转入 "##
)
Zb/<提取液体中!经液
氮_沸水反复冻融 % 次!然后利用乙醇沉淀 b/U"# ^保存备用
=VE>50L扩增与序列测定
$&; @b/<扩增引物为细菌通用引物 "G_$)*"@!
扩增条件及体系详见文献*+ .O; 扩增应用真菌
通用引物.O;$_.O;)!引物序列及扩增程序详见文献
*++ 72=扩增产物直接送北京博迈德科技发展有
限公司!经公司切胶纯化后用 % %#rZb/<测序仪
测序
=V">菌种鉴定
$V&V$!细菌鉴定!利用网络鉴定工具 ]YO3WFC
;>@T>@T>@?DFC "V$ 对分离细菌菌株进行种类鉴定
"B9Q$__$)V)V"$"V%-$+#+#_#!以 $&; @=/<基因
序列数据比对结果为细菌鉴定依据!$&; @=/<基因
序列与模式菌种的相似性大于 *0!即视为与该模
式菌种同种!小于 *0视为不同种**+
$V&V"!真菌鉴定!用形态特征和 .O; 序列分析相
结合的方法!根据真菌的菌丝&有性或无性孢子&产
孢结构等形态特征!参照.真菌鉴定手册/ *$#+鉴定到
属%然后分别利用/2L.LP3?9工具和]5LZH3?93工
具进行序列分析比对!验证形态特征鉴定结果的可
靠性!菌株 .O; 序列与参比序列相似性大于 *0视
为相同的种!而相似性在 *-0 *&,*0视为相同
的属*$$+
"!结果与分析
?V=>菌种分离
本研究根据真菌&细菌菌落形态&颜色等特征对
每个处理培养的真菌&细菌不同种类进行了分离和
纯化 本研究分离纯化细菌菌株 *) 株!其中!染病
株 % 个处理分离细菌菌株 )& 株!处理
!
&
"
&
#
分离
细菌菌株数量分别为 $&&$%&$ 株%% 个健康株 % 个
处理分离细菌菌株 )+ 株!处理
!
&
"
&
#
分离细菌菌
株数量分别为 $*&$-&$) 株 分离纯化真菌菌株 &&
株!其中!染病株 % 个处理分离真菌菌株 ") 株!处理
!
&
"
&
#
分离真菌菌株数量分别为 +&*& 株%% 个
健康株样品分离真菌菌株 )" 株!处理
!
&
"
&
#
分离
真菌菌株分别为 $%&$&$" 株
?V?>真菌优势种群及种类异同
健康株 % 个处理"* 个树皮样品#分离的真菌优
势种 群 均 为 链 格 孢 ",H&$#4(#0( (H&$#4(&( "H@V#
4>D??PV#!其菌株数量分别占所分离菌株总数的
)",+0&)#V#0&%,-0!但非优势种群的真菌种类及
其数量并不相同!仅!F%"H(40在 %个健株树皮上均有
分布 染病株的真菌种类较为单一!仅有 $ " 种!*
个病株 %个重复"* 个样品#的真菌优势种群均为!F
%"H(40!而且其菌株数量均占所分离菌株总数 +-0以
上!%个处理分别为 +-,0&$##0&*),0 真菌优势
种群详细结果见表 $
表 =>真菌种类及优势种群
处理
健康株
拉丁学名 基因序列号 相似性_0 比例_0
染病株
拉丁学名 基因序列号 相似性_0 比例_0
!
,H&$#4(#0( (H&$#4(&( @$40)0H02L"I(H0)2L c/+-$#)V$ $## "+V& @$40)0H02L"I(H0)2L c/+-$#)V$ $## $)V%
!2%(#02L%"H(40 Hc*$)++&V$ ** $)V%
@*"L"G%0%)*0L"4(4&*0 Nl%"+#)&V$ ** $)V%
"
,H&$#4(#0( (H&$#4(&( @*"L"G%0%?QV ]H&##*&$V$ *+ ""V%
!2%(#02L%"H(40 Hc*$)++&V$ ** "$V#
@H$"%G"#(H$%?QV Nl*$)+)*V$ $## $&V
#
,H&$#4(#0( (H&$#4(&( !2%(#02L%"H(40 Hc*$)++&V$ ** "#V# T"&#?"%G*($#0( 6"&*06$( 8i**&+&V$ $## -V%
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@*"L"G%0%)*0L"4(4&*0 Nl%"+#)&V$ ** *V$
%)
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
?VA>细菌优势种群及种类异同
健康株 % 个处理"* 个样品#分离的细菌优势种
群种类不同!仅 N0)#"J()&$#02L属在健康株 % 个处理
中均有分布!处理
!
&
"
&
#
主要优势种群分别为 S(401
J()&$#L$H"40%gFFC&N0)#"J()&$#02L *"L040%O3:>EABD
3CJ N393CF和N0)#"J()&$#02LKH(E2L436>I3K3!优势种
群的菌株数量分别占所分离菌株总数的 &",$0&
%*,&0&%%,$0 染病株 % 个处理"* 个树皮样品#分
离的细菌优势种群均为 9"4%6(H$( ;2$#)04( L@3CJI" d
T#$44$#0( ;2$#)04("NDPJ>S@3CJ q;AB@F9B# N3ES>C#!而
且其菌株数占所分离菌株总数的百分比均在 &0以
上!%个处理分别为 +",0&&,*0&&*,+0 % 个处
理分离细菌非优势种类中仅有 " 种相同!如 3"#?4$1
J()&$#02LE(#0(J0H$"5tP>@!$*&$# 2FPDC?!$*+ 和 3F
KH(E$%)$4%L3@:?J3P>! $** 在染病株 % 个处理中均有
分布 健康株树皮样品与染病株样品分离细菌种类
差异较大!未分离到相同的物种"表 "#
表 ?>细菌种类及优势种群
处理
健康株
拉丁学名
基因
序列号
相似性
_0
比例
_0
染病株
拉丁学名
基因
序列号
相似性
_0
比例
_0
! S(40J()&$#L$H"40%25"$#)
O
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O
N0)#"J()&$#02LKH(E2Lg5$+(#*+
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O
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,)$&"J()&$#G"L"#2LZNO")-+
O
92&$0L"4(%L(#04( H=$%%#
O
]i"*-)-* *+V#) $V)
?VD>可培养的真菌$细菌种类
本研究分离的真菌菌株分属于 + 个属的 - 个种
和 ) 个未鉴定种!其中!染病株 % 个处理分离真菌 %
属 % 个种!处理.&
"
&
#
分离真菌种类分别为 " 个属
" 个种&$ 个属 $ 个种和 " 个属的 " 个种%而健康株 %
个处理分离 个属 个种和 ) 个未鉴定种
本研究分离细菌分属于 ") 个属的 "* 个种!其
中!染病株 % 个处理分离真菌 $$ 属 $" 种!处理 .&
"
&
#
分离细菌种类分别为 个属 个种&- 个属 &
个种和 ) 个属的 - 个种%而健康株 % 个处理分离 $%
个属 $ 个种!处理 .&
"
&
#
分离细菌种类分别为 -
个属 个种&) 个属 - 个种和 & 个属的 & 个种
%!讨论
中林 )& 健株和病株样品的细菌优势种群分析
结果表明$健株样品与病株样品分离的种类完全不
同!染病株样品优势种群均为 9F;2$#)04(!且 % 个处
理的菌株数分别占所分离菌株总数的为 +",0&
&,*0&&*,+0!而 3FE(#0(J0H$和 3FKH(E$%)$4%在 %
个染病株样品中均有分布 9F;2$#)04( 是引起欧洲
栎树">2$#)2%0H$IZV#树干溃疡和美国栎树">2$#)2%
?QV#果实病的病原菌*$" U$)+ 因此!推测 9F;2$#)04(
))
第 $ 期 李!永等$欧美杨新型溃疡病病株与健株干部树皮中真&细菌优势种群分析
在我国欧美杨溃疡病致病过程中可能起着重要作
用!很可能是该病害的病原菌之一!但需要进一步室
内和田间的生物学接种实验证实%而 3FE(#0(J0H$和
3FKH(E$%)$4%" 个菌种是奶酪表面常见的菌种!并在
奶酪制作过程中起重要作用!3FE(#0(J0H$能够发酵
蔗糖&果糖&甘露醇等产酸*$- U$&+ ! 在病原菌致病过
程中分解韧皮部糖醇类化合物!加速树皮组织的快
速腐烂!加重病害危害程度
贺伟等*$+研究发现!河南濮阳&山东菏泽等地的
欧美杨溃疡病病斑的分离物中! 镰刀菌属真菌占优
势!并通过离体枝条水培接种&盆栽苗接种和致病性
测定试验证明!我国欧美杨溃疡病的病原菌为茄镰
孢"!F%"H(40# 本研究中!中林 )& 杨健株和病株树
皮真菌优势种群分析结果显示$染病株样品的优势
种群均为!F%"H(40!而且其菌株数量占所分离菌株
总数的百分比均在 +-0以上!此结果与贺伟等*$+研
究结果相符!即镰刀菌属真菌占优势 健康株样品
分析结果显示$!F%"H(40在 % 个健康株样品上均有
分布!但并不是优势种群!说明 !F%"H(40是一种杨
树树皮的内生真菌!在条件允许的情况下!!F%"H(40
在树皮内迅速繁殖和致病 在染病样品中有 $ 个处
理分 离 到 葡 萄 座 腔 菌 "T"&#?"%G*($#0( 6"&*06$(
"5FE6V# 2>?Vqb>/F9V#!葡萄座腔菌是一种杨树
的弱致病菌!在树势弱时病菌才会造成杨树溃疡病!
因此!葡萄座腔菌可能与该病害的病原菌协同致病!
促进该病害的发生和危害
本研究阐明了欧美杨中林 )& 健株和病株树皮
组织主要真菌&细菌优势种群的种类!为明确病原菌
与其他主要伴生微生物之间的相互关系奠定了基
础!而 9F;2$#)04(和!F%"H(40在欧美杨溃疡病的致病
过程中所起的作用!需要按照严格的柯赫氏法则进
行室内和田间的生物学接种试验进一步证实
参考文献!
*$+ 贺!伟!任飞娟!郭利民!等V欧美杨溃疡病的病原鉴定*c+V林
业科学!"##*!)-"&#$$#) U$#*
*"+ 牟新涛!李!永!李强军!等V三峡库区云阳县三种类型马尾松
林微生物区系分析 .V林地土壤细菌&芽孢杆菌和真菌*c+V林
业科学研究!"#$#!"%")#$-&# U-&&
*%+ 牟新涛!李!永!李强军!等V三峡库区云阳县三种类型马尾松
林微生物区系分析 .V林地空气&叶面和树皮表面微生物区系V
*c+V林业科学研究!"#$#!"%"-#$&" U&*
*)+ 陈华红!杨!颖!姜!怡!等V植物内生放线菌的分离方法*c+V
微生物学通报!"##&!%%")#$$+" U$+-
*-+ 王彦芹!席琳乔V棉花根际促生菌基因组 b/<的提取及其鉴定
*c+V基因组学与应用生物学!"#$#!"*"-#$##- U$##+
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