全 文 ：林业科学研究 ２０１２，２５（２）：１４４ １４９
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１２）０２０１４４０６
平榛 ＣｈＷＲＫＹ２转录因子的克隆及在低温
胁迫下的表达分析
赵天田，王贵禧，梁丽松，马庆华，陈 新
（林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所，北京 １０００９１）
收稿日期：２０１１１２２７
基金项目：国家“十一五”科技支撑计划“高产优质大枣、榛子新品种选育”（２００６ＢＡＤ０１Ａ１７０１）；国家林业局“９４８”项目“榛子特异性状
育种材料及微繁技术引进”（２００８２０４２０８）
作者简介：赵天田（１９８４—），男，博士，主要从事榛子抗逆基因方面的研究，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｔｉａｎ１９８４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者： 王贵禧，研究员，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｇｘ０１１４＠１２６．ｃｏｍ
摘要：根据平榛花芽转录本高通量测序的结果，采用ＲＡＣＥＰＣＲ技术克隆到一个全长６７５ｂｐ，编码１７９个氨基酸的
平榛ＷＲＫＹ基因，命名为ＣｈＷＲＫＹ２。ＣｈＷＲＫＹ２蛋白序列中只含有一个 ＷＲＫＹ结构域，锌指结构为 ＣＸ４ＣＸ２３Ｈ
Ｘ１Ｈ，属于ＷＲＫＹ家族第Ⅱ类成员。对ＣｈＷＲＫＹ２基因进行实时荧光定量ＰＣＲ表达分析，结果表明：平榛雌花芽中
ＣｈＷＲＫＹ２在１２月份的表达量最高，随后表达量逐渐下降。４℃低温胁迫处理根蘖苗４ｈ后，叶片中ＣｈＷＲＫＹ２的表
达量快速升高，并在８ｈ达到最大表达量。此外，ＣｈＷＲＫＹ２在不同器官中的表达具有差异性，雄花序中表达量最高，
其次是雌花芽，树皮（韧皮部）中表达量最低。
关键词：平榛；ＷＲＫＹ基因；克隆；序列分析；实时荧光定量ＰＣＲ
中国分类号：Ｓ７１８．４６ 文献标识码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｈＷＲＫＹ２ｆｒｏｍＣｏｒｙｌｕｓｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌａ
ｕｎｄｅｒＬｏｗＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＳｔｒｅｓｓ
ＺＨＡＯＴｉａｎｔｉａｎ，ＷＡＮＧＧｕｉｘｉ，ＬＩＡＮＧＬｉｓｏｎｇ，ＭＡＱｉｎｇｈｕａ，ＣＨＥＮＸｉｎ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｅｅＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｈａｚｅｌｎｕｔｂｕｄｓ，ａ６７５ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔ，ＣｈＷＲＫＹ２，
ｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｄａｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｏｆ１７９ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈＲＡＣＥＰＣＲ．Ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｉｓｐｒｏｔｅｉｎｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｒｏｕｐｏｆＷＲＫＹｆａｍｉｌｙａｎｄｔｈｅｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｓＣＸ４ＣＸ２３Ｈ
Ｘ１Ｈ．ＴｈｅＣｈＷＲＫＹ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈａｚｅｌｎｕｔｂｕｄｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｕｎｄｅｒｎａｔｕｒａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｄｉｓｐｌａｙｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎＤｅｃｅｍｂｅｒａｎｄｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＣｈＷＲＫＹ２ｉｎｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｒａｐｉｄｌｙａｎｄ
ｈｉｇｈｌｙｉｎｄｕｃｅｄｗｈｅｎｓｕｃｋｅｒｓｗｅｒｅｅｘｐｏｓｅｄｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｏｆ４℃，ＣｈＷＲＫＹ２ｗｅｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄａｔ８ｈｒｅａｃｈｉｎｇａ
ｐｅａｋ．ｔｈｅｓｐａｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣｈＷＲＫＹ２ｗａｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｍａｌｅ
ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｈａｎｔｈａｔｉｎｂｕｄａｎｄｂａｒｋｔｉｓｓｕｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｏｒｙｌｕｓｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌａＦｉｓｃｈ．；ＷＲＫＹｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ
植物转录因子的研究已经成为现今植物基因功
能研究的一个重点，ＷＲＫＹ转录因子作为重要的一
个转录因子超家族，除了参与植物的生长发育及物
质代谢途径，在抗病毒、抗细菌等方面发挥重要的调
节作用外，还参与了应答环境信号刺激，如低温、高
盐、干旱等非生物胁迫逆境［１］。目前，在转录水平上
应用荧光定量ＰＣＲ、基因芯片、转录谱及表达谱等方
法分析不同物种中 ＷＲＫＹ转录因子在不同胁迫下
第２期 赵天田等：平榛ＣｈＷＲＫＹ２转录因子的克隆及在低温胁迫下的表达分析
的表达模式与功能已经成为当今研究的热点。
ＷＲＫＹ的第１个转录因子是１９９４年在甘薯（Ｉｍｐｏｅａ
ｂａｔａｔａｓＬ．）［２］上克隆得到的，随后在其它很多植物
中发现了 ＷＲＫＹ类转录因子。目前，ＷＲＫＹ基因
的研究主要集中在水稻、拟南芥、烟草等一些已经
完成测序的物种中［３］，在木本植物中 ＷＲＫＹ的研
究较少。迄今为止，已报道的与非生物胁迫相关的
ＷＲＫＹ转录因子主要有 １０个［４］。目前，平榛上
ＷＲＫＹ基因所介导的植物应答反应过程、逆境胁迫
下的反应凋控机制，尤其是低温胁迫下的调控机制
尚未见报道。
平榛为桦木科（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ）榛属（Ｃｏｒｙｌｕｓ）植物，
是世界四大坚果（榛子、核桃、扁桃、腰果）之一，具
有极高的营养价值和经济价值，全世界约有１６种，
我国作为重要的榛属植物资源国，原产８个种和２
个变种，其中平榛（ＣｏｒｙｌｕｓｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌａＦｉｓｃｈ．）是我
国特有的重要的榛属抗寒种质资源，可抗冬季 －４８
℃的极端低温，而国外种植较广泛的欧榛（Ｃ．ａｖｅｌ
ｌａｎａＬ．）以及我国东北、华北地区大面积发展的平
欧杂交榛（Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌａＦｉｓｃｈ．×Ｃｏｒｙｌｕｓａｖｅｌａｎａ
Ｌ．）的抗寒能力较差，低温以及霜冻等会造成花芽
枯死、雄花序抽干、枝条枯梢等现象［５－６］，从而影响
坚果的产量造成经济损失。本研究选择平榛花芽为
实验材料，通过 ＲＡＣＥ克隆技术克隆得到一个平榛
ＷＲＫＹ基因，通过对克隆得到的基因在自然条件下
（秋天冬天春天）的表达特性进行了分析，并在人
工可控温度的光照培养箱中模拟低温胁迫条件，研
究平榛ＷＲＫＹ基因响应低温信号的作用机制，以便
为今后采用基因工程手段以及分子标记辅助育种方
法培育榛子抗寒新品种提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料及处理
在河北木兰围场国有林场（１１６°３２′ １１８°１４′
Ｅ，４１°３５′ ４２°４０′Ｎ）成片的平榛林中，选择同一棵
母株上萌发的基因型一致的平榛为实验材料。
１．１．１ 用于自然寒冷条件下 ＷＲＫＹ表达模式研究
的材料 分别于 ２０１０年 １１月 １日、１２月 １日和
２０１１年１月１日、２月１日、３月１日取雌花芽，取材
后立即投入液氮冻干，随后保存于 －８０℃冰箱。研
究自然条件下平榛ＷＲＫＹ基因的季节表达。在较为
寒冷的１月份分别取雌花芽、雄花序、树皮（韧皮
部），用于检测ＷＲＫＹ基因在平榛不同组织器官中的
表达情况。
１．１．２ 用于人工控制的低温胁迫条件下 ＷＲＫＹ表
达模式研究的材料 参照 Ｒｉｎｎｅ等［７］的方法，研究
在人工低温胁迫处理下 ＷＲＫＹ基因的表达情况，将
基因型一致的平榛根蘖苗培育苗龄３个月后，放入
光照培养箱中进行适应（光照强度 １００μｍｏｌ·
ｍ－２·ｓ－１，光照时间１６ｈ／８ｈ，湿度８０％ ９０％，昼
夜温度分别为２５、２１℃），随后进行４℃低温胁迫处
理，分别在处理０、２、４、８、２４ｈ时采集叶位相同的叶
片（完全展开的第４ ５片叶）［８］，用于研究 ＷＲＫＹ
基因在人工低温胁迫处理下的表达模式。
１．２ 方法
１．２．１ ＣｈＷＲＫＹ２基因的克隆与序列分析 选择寒
冬（１月份）平榛的雌花芽为材料，提取 ＲＮＡ，使用
ＳｏｌｅｘａＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ测序技术对转录本进行测序。分
析测序结果，从中筛选得到几个类似 ＷＲＫＹ基因的
片段，通过ＮＣＢＩ上的Ｂｌａｓｔ比对结果进行分析，选择
一条编号为Ｕｎｉｇｅｎｅ９２６２的可能与响应低温有关的
基因片段进行研究。平榛总 ＲＮＡ提取采用 ＣＴＡＢ
法［９］，利用ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ试剂盒进行反转录得到
第一链，然后用于基因的 ＲＡＣＥ克隆。根据筛选到
的基因片段用 Ｐｒｉｍｅｒ５设计扩增３’方向的引物 Ｐ１
和５’方向的引物Ｐ２（表１），根据ＲＡＣＥ试剂盒中的
说明书采用 ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ程序进行 ｃＤＮＡ扩增，
ＰＣＲ产物采用天根的凝胶回收试剂盒回收，连接
ｐＭＤ１９ＴＶｅｃｔｏｒ并转化感受态细胞，蓝白斑筛选阳
性克隆，经过菌落 ＰＣＲ检测正确后，送北京华大生
物技术公司进行测序。
利用 ＤＮＡＭＡＮ（６．０ＤＥＭＯ）软件对 ５’和 ３’
ＲＡＣＥ结果进行拼接，得到全长ｃＤＮＡ序列。测序结
果在ＧｅｎＢａｎｋ网站上进行在线 Ｂｌａｓｔ分析，用 ＮＣＢＩ
提供的 ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ找到开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）及其编码的氨基酸序列。克隆得到基
因编码的蛋白分子量、理论等电点及保守结构域等
预测通过软件 ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）
进行。采用ＤＮＡＭＡＮ软件进行多重序列比对，使用
Ｍｅｇａ４软件进行系统进化树分析。亚细胞定位预测
分析使用在线软件 ＷｏｌｆＰｓｏｒｔ（ｈｔｐ：／／ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ．
ｏｒｇ／）进行。
１．２．２ 荧光定量ＰＣＲ表达分析 提取不同处理材
料的总 ＲＮＡ，反转录合成 ｃＤＮＡ第一链作为实时荧
光定量ＰＣＲ的模板。根据荧光定量 ＰＣＲ引物设计
原则设计一对特异引物 ＷＲＫＹＱＲＦ和 ＷＲＫＹＱＲＲ
５４１
林 业 科 学 研 究 第２５卷
（表１）。以本课题组前期比较筛选后低温胁迫下稳
定性较好的 Ａｃｔｉｎ基因（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ
ＨＱ６７７５６９）为内参，设计其特异引物 ＡｃｔｉｎＦ和 Ａｃ
ｔｉｎＲ（表１），扩增片段为１０１ｂｐ，进行实时荧光定量
ＰＣＲ表达分析。参考周琳等［１０］的方法，并参照荧光
定量试剂盒 ＳＹＢＲＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＰＣＲＫｉｔ的说明
书，反应在ＡＢＩ７５００实时定量 ＰＣＲ仪上进行。荧光
定量ＰＣＲ扩增体系为：ｃＤＮＡ模板２μＬ，特异引物
（１０μｍｏｌ）和５０×ＲＯＸＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅＩ各０．４μＬ，２
×ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ１０μＬ，加 ＲＮａｓｅｆｒｅｅ至２０
μＬ。试验结果利用 ＣＦＸＭａｎａｇｅｒＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ软件分
析实验数据。
表１ ＣｈＷＲＫＹ２克隆以及实时荧光定量表达分析引物
引物 所使用引物序列 引物作用
Ｐ１ ５′ＧＣＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＧＡＡＡＣＴＧＡＴＧＣ３′ ３′末端扩增
Ｐ２ ５′ＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＣＣＣＣＡＣＡＡＡＧ３′ ５′末端扩增
ＷＲＫＹＱＲＦ ５′ＡＴＧＴＣＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴ３′ 荧光检测ＣｈＷＲＫＹ２的表达
ＷＲＫＹＱＲＲ ５′ＴＴＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＣＣＣＣＡＣ３′
ＡｃｔｉｎＦ ５′ＴＧＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣ３′ 扩增内标，１０１ｂｐ
ＡｃｔｉｎＲ ５′ＣＴＧＡＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＡ３′
２ 结果与分析
２．１ 平榛ＣｈＷＲＫＹ２全长克隆及序列分析
以平榛花芽的 ｃＤＮＡ为模板，根据平榛雌花芽
转录本高通量测序结果中筛选得到的 Ｕｎｉｇｅｎｅ９２６２
片段设计３′端特异引物，通过 ＲＡＣＥＰＣＲ扩增、产
物回收后，得到长度为３５０ｂｐ的３′末端（图１ａ）。５′
ＲＡＣＥ引物是根据３′ＲＡＣＥ扩增得到的片段设计的，
得到的片段长度为４５１ｂｐ（图１ｂ）。所扩增得到的
３′ＲＡＣＥ和５′ＲＡＣＥ片段与转录谱库中的所筛选的
响应低温胁迫相关的 Ｕｎｉｇｅｎｅ片段有共同重叠的区
域，这表明克隆所得到的是筛选基因的３′端与５′端。
利用ＲＴＰＣＲ，获得１条６７５ｂｐ的序列，通过 ＮＣＢＩ
上的 Ｂｌａｓｔ对比发现，获得的序列与 ＷＲＫＹ基因同
源，暂命名为 ＣｈＷＲＫＹ２。利用 ＮＣＢＩ提供的 ＯＲＦ
Ｆｉｎｄｅｒ和在线软件ＰｒｏｔＰａｒａｍ进行分析发现，该序列
包含１个５３７ｂｐ的开放阅读框，编码１７９个氨基酸，
分子量为２０．４ｋＤ，理论等电点（ｐＩ）为９．７７。生物信
息学分析如图 ２所示：克隆的 ＣｈＷＲＫＹ２含有 １个
ＷＲＫＹ区域（图中斜体部分），１个Ｃ２Ｈ２锌指结构域
（ＣＸ４ＣＸ２３ＨＸ１Ｈ，用虚下划线表示部分），属于
ＷＲＫＹ家族的第Ⅱ类［１５］。应用 ＷｏｌｆＰｓｏｒｔ软件对
ＣｈＷＲＫＹ２基因进行亚细胞定位分析，发现 ＣｈＷＲＫＹ２
定位于细胞核，预测的数据如下：ｋｕｓｅｄｆｏｒｋＮＮｉｓ：１４
ｑｕｅｒｙＰｒｏｔｅｉｎｄｅｔａｉｌｓｎｕｃｌ：１２．０，ｃｈｌｏ：１．０
ａ为ＣｈＷＲＫＹ２３′ＲＡＣＥ扩增产物，ｂ为ＣｈＷＲＫＹ２５′ＲＡＣＥ扩增产物，Ｍ是ＤＮＡ标准分子量ＤＬ２０００。
图１ 平榛ＣｈＷＲＫＹ２基因的ＰＣＲ扩增电泳图
６４１
第２期 赵天田等：平榛ＣｈＷＲＫＹ２转录因子的克隆及在低温胁迫下的表达分析
起始密码子和终止密码子用下划线表示，ＷＲＫＹ保守域用斜体表示，锌指结构用虚下划线标出，
锌指结构的半胱氨酸和组氨酸用方框标出。
图２ ＣｈＷＲＫＹ２编码的氨基酸序列分析
２．２ ＣｈＷＲＫＹ２氨基酸序列同源性及系统进化发
育分析
将 ＣｈＷＲＫＹ２基因的氨基酸序列同其他物种
ＷＲＫＹ基因的氨基酸序列进行同源性分析。利用
ＤＮＡＭＡＮ软件对ＣｈＷＲＫＹ２基因的氨基酸序列及在
ＮＣＢＩ上选出的同源性较高的具有代表性的９条氨
基酸序列进行多重比对。结果发现：平榛与杨树
（ＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａＡＣＶ９２０２０）氨基酸序列的相似性
最高为６５％，亲缘关系最近，其次是蔷薇科的苹果
（ＭａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａＡＤＬ３６８５６）为 ５７％，与玉米（Ｚｅａ
ｍａｙｓＡＣＮ３４８７９）的相似性最低，仅为３３％；但是，如
图３所示：保守结构域以及特征序列同源性很高。
在多重比对的基础上，使用 Ｍｅｇａ４软件构建
ＣｈＷＲＫＹ２及上述９条氨基酸序列的系统进化树，以
研究ＣｈＷＲＫＹ２与其它植物 ＷＲＫＹ之间的进化关
系。从图４可以看出：平榛和杨树的关系较近，并与
蔷薇科的苹果聚到了一起；１年生草本植物大麦、小
麦、水稻位于一个分支，拟南芥、大豆以及玉米位于
另一个分类簇中；平榛与玉米的亲缘关系最远。
ＰｔＷＲＫＹ：杨树（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａ，ＡＣＶ９２０２０）；ＭｄＷＲＫＹ：苹果（Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ，ＡＤＬ３６８５６）；ＳｔＷＲＫＹ：马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ，ＢＡＣ２３０３１）；
ＨｖＷＲＫＹ：大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅ，ＡＢＩ１３３７８）；ＯｓＷＲＫＹ：水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ，ＡＢＡ９３８５５）；ＴａＷＲＫＹ小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ，ＡＢＮ４３１８４）；
ＧｍＷＲＫＹ：大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ，ＡＢＣ２６９１５）；ＡｔＷＲＫＹ：拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ，ＡＦ４２６２５１）；ＺｍＷＲＫＹ：玉米（Ｚｅａｍａｙｓ，ＡＣＮ３４８７９）；下同．
图３ ＣｈＷＲＫＹ２保守性区域和其它的ＷＲＫＹ蛋白的同源性分析（ＣｈＷＲＫＹ２保守性区域用黑色标出）
７４１
林 业 科 学 研 究 第２５卷
图４ 平榛ＣｈＷＲＫＹ２和其它植物ＷＲＫＹ蛋白的系统进化树分析
２．３ ｑＲＴＰＣＲ分析ＣｈＷＲＫＹ２基因的时空表达
以Ａｃｔｉｎ为内参，对平榛 ＣｈＷＲＫＹ２基因自然越
冬条件下在雌花芽中的表达情况和在４℃低温胁迫
条件下（０、２、４、８、２４ｈ）叶片中的表达模式进行了初
步的研究。如图５所示：在自然条件下１１月份雌花
芽中ＣｈＷＲＫＹ２基因已经高丰度表达，１２月份、次年
１月份ＣｈＷＲＫＹ２的表达量维持在较高的水平，２月
份表达量开始出现下降，３月份 ＣｈＷＲＫＹ２的表达量
降低明显，这可能与气温的升高有关。４℃人工低
温胁迫处理４ｈ后，叶片中ＣｈＷＲＫＹ２基因的表达量
迅速上升，处理８ｈ后达到最大的表达量（图５）。说
明ＣｈＷＲＫＹ２能够在低温胁迫的早期响应这一生理
过程。
图５ ＣｈＷＲＫＹ２基因在自然条件（雌花芽）以及低温４℃胁迫处理（叶片）不同时间下的表达模式
ＣｈＡｃｔｉｎ作为ｑＲＴＰＣＲ的内参基因。
图６ ＣｈＷＲＫＹ２在平榛不同组织中的表达
采用实时荧光定量ＰＣＲ的方法，用平榛的Ａｃｔｉｎ
基因为内参，对平榛不同组织器官中的ＣｈＷＲＫＹ２表
达情况进行分析，结果（图 ６）表明：在雄花序中，
ＣｈＷＲＫＹ２的表达量最高，其次为雌花芽，树皮（韧皮
部）中最低。虽然在平榛的雌花芽、树皮（韧皮部）
以及雄花序中都有ＣｈＷＲＫＹ２的表达，但不同组织器
官中表达量的差异表明 ＣｈＷＲＫＹ２在平榛中具有组
织表达特异性。
３ 结论与讨论
ＷＲＫＹ转录因子是通过接受外界逆境胁迫信
号、调控相关逆境基因表达，进而引起植物体内一系
列生理变化的一类转录因子，在植物逆境胁迫信号
传导过程中具有重要作用［２］；但是目前在平榛上
ＷＲＫＹ转录因子参与非生物胁迫的研究还未见报
道，大大限制了该类基因在榛属植物抗逆遗传改良
上的应用。本实验室利用华大的高通量测序技术对
平榛雌花芽冬季（１月份）的转录本进行了测序，并
筛选得到一个类似ＷＲＫＹ基因的片段。通过ＲＡＣＥ
ＰＣＲ方法成功克隆得到 ＷＲＫＹ的同源 基因
ＣｈＷＲＫＹ２，其编码的蛋白质含有ＷＲＫＹ家族保守的
ＷＲＫＹＧＱＫ区域，具有１个 Ｃ２Ｈ２锌指结构域，根据
Ｅｕｌｇｅｍ等［１１］的分类标准，属于 ＷＲＫＹ家族的第Ⅱ
类，目前发现的 ＷＲＫＹ蛋白大多数属于此类，较为
８４１
第２期 赵天田等：平榛ＣｈＷＲＫＹ２转录因子的克隆及在低温胁迫下的表达分析
保守。对 ＣｈＷＲＫＹ２氨基酸序列与其它植物的
ＷＲＫＹ氨基酸序列的多重比对发现，ＷＲＫＹＧＱＫ区
域保守性最强。构建的系统进化树中，平榛 ＷＲＫＹ
最先与杨树、苹果聚合，同源基因关系较近，与大豆、
拟南芥及玉米等草本植物同源基因关系较远。这表
明ＣｈＷＲＫＹ２的同源基因所编码的氨基酸序列在进
化过程中既具有较强的保守性，又存在着不同植物
间的差异［１２］。
对平榛根蘖苗进行４℃低温胁迫处理，在其它
条件都一致的情况下，胁迫处理４ｈ后 ＷＲＫＹ基因
的表达迅速上调，处理 ８ｈ后达到最大值，这表明
ＣｈＷＲＫＹ２是响应低温胁迫的转录因子，并且可能是
早期应答低温信号的分子。在自然条件下，温度较
低的１１月份、１２月份及次年１月份 ＣｈＷＲＫＹ２也具
有较高的表达量，但温度回升的２、３月份的表达量
逐渐降低。付乾堂等［１３］发现，拟南芥 ＡｔＷＲＫＹ２５与
ＡｔＷＲＫＹ２６在低温胁迫（４℃）和高温胁迫（４２℃）下
的反应是一致的；但 ＡｔＷＲＫＹ３３在低温胁迫下的表
达水平是先增加后降低，在４２℃高温胁迫下表达量
却随处理时间的延长而逐渐降低，说明 ＡｔＷＲＫＹ３３
在高温和低温处理后的表达模式是完全不同的，即
受高温的抑制而受低温的诱导。本研究中，
ＣｈＷＲＫＹ２在４℃下的表达趋势是和ＡｔＷＲＫＹ３３相一
致的，自然条件下２、３月份气温回升，ＣｈＷＲＫＹ２的
表达量下降，这也与 ＡｔＷＲＫＹ３３受高温抑制后的表
达情况相符合，因此，推测平榛 ＣｈＷＲＫＹ２也是一个
受低温诱导而受高温抑制的转录因子。ＣｈＷＲＫＹ２
在检测的３个不同组织中，雄花序中的表达量最高，
其次为花芽，最低表达部位为树皮（韧皮部），表明
ＣｈＷＲＫＹ２的空间表达具有特异性。平榛的雄花序
很少发生冻害，这也可能与ＣｈＷＲＫＹ２在雄花序中具
有较高的表达量有关。
根据 Ａｓａｉ［１４］和 Ｋｉｍ等［１５］的研究认为，ＷＲＫＹ
类转录因子是受丝裂原激活蛋白激酶的调节
（ＭＡＰＫ），通过植物体内的 ＭＡＰ激酶级联系统将外
界各种诱导因素的信号传递到细胞内并激活ＷＲＫＹ
转录因子的活性，ＷＲＫＹ再通过与功能基因或其它
转录因子启动子中的 Ｗｂｏｘ元件结合调节其表
达［１６］。目前，对于平榛中ＷＲＫＹ转录因子调控的下
游功能基因，以及ＷＲＫＹ类转录因子之间相互调控
方面的研究还没有报道，随着转录组学、酵母杂交、
烟草叶片双荧光等实验技术的的广泛应用，研究平
榛ＷＲＫＹ转录因子与相关功能基因的蛋白互作以
及揭示平榛中ＷＲＫＹ的调控机理将成为可能。
参考文献：
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