全 文 ：林业科学研究 2005, 18(2) : 183~ 186
Forest Research
文章编号: 100121498(2005) 0220183204
抗生素对山茶愈伤组织诱导和生长的影响
范正琪, 李纪元, 田 敏
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江 富阳 311400)
摘要:研究了卡那霉素、潮霉素对浙江红山茶、大花红花油茶愈伤组织的生长及对攸县油茶幼苗叶片诱导愈伤的影
响,确定作为选择压力的卡那霉素质量浓度为 50~ 60 mg# L- 1, 潮霉素为 25~ 30 mg#L- 1。在 3种抑菌性抗生素中,
羧苄青霉素促进愈伤组织诱导,对愈伤组织的生长没有影响,头孢霉素则有抑制作用, 而羟氨苄青霉素轻微抑制愈
伤组织的生长,但对愈伤组织的诱导影响不大。考虑到抑菌效果,适于在转基因研究中使用的羧苄青霉素的抑菌质
量浓度为 250 mg#L- 1 ,羟氨苄青霉素为 125 mg# L- 1。
关键词:抗生素;山茶;愈伤组织
中图分类号: S72213+ 7 文献标识码: A
收稿日期: 2004206209
基金项目: 中国林业科学研究院亚热带林业研究所青年科技发展基金项目/ 农杆菌介导茶花转化受体系统的建立0 (C02202)
作者简介: 范正琪( 1976 ) ) ,女,浙江桐乡人,研究实习员,硕士.
Effect of Antibiotics on Induction and Growth of Camellia Callus
FAN Zheng2qi , LI Ji2yuan, TIAN Min
( Research Inst itute of Subtropical Forestry, CAF, Fuyang 311400, Zhejiang , China)
Abstract :The effect of the supplement of ant ibiotics on induction and growth of camellia callus was studied. Kannamycin and Hy2
gromycin were more sensitive to growth of callus of C. chekiangoleosa than that of C. magniflora . Growth of callus would be lim2
ited by Kannamycin at 50~ 60 mg#L- 1 and Hygromycin at 25~ 30 mg#L- 1 . The leaves of C. grijsii seeding could not induced
callus when Kannamycin and Hygromycin arrived the same concentration. Carbenicillin could accelerate induction of callus at cer2
tain degree but didnot affect the growth of callus. Amoxicillin inhibited slightly the growth of callus. Cefotaximes reduced both the
ratio. According to the effect of inhibitingAgrobacterium tumefaciens, concertration of Carbenicillin and Amoxicillin were 250 mg
#L- 1 and 125 mg#L- 1 respectively in the study of transformation.
Key words: antibiotics; Camellia ; callus
山茶(Camellia L. )为观赏性园林植物, 提高它
的观赏价值和抗逆性是今后山茶发展的目标。传统
的育种方法周期长, 而基因工程为加快育种进程提
供了新的手段。农杆菌介导法是植物遗传转化中较
为常用的一种方法, 在进行转化体的筛选时也常用
抗生素作为选择标记,卡那霉素、潮霉素是筛选转化
体常用的抗生素。此外,外植体与农杆菌共培养后
需要使用抗生素脱菌,以抑制农杆菌的进一步生长,
常使用的抗生素有羧苄青霉素、头孢霉素等。在植
物培养基中加入不同种类和浓度的抗生素会对外植
体的生长发育产生影响,因此,在进行目的基因的遗
传转化过程中, 对受体材料进行抗生素敏感性测定
是十分必要的,在一定程度上,它也是转化试验成功
与否的关键因素之一。
抗生素对植物离体培养的影响在很多植物上都
有报道[ 1~ 7] , 但在山茶中却从未有人研究。本文探
讨了抗生素对山茶愈伤组织诱导和生长的影响, 从
而为农杆菌介导的山茶遗传转化技术体系的建立提
供参考依据。
1 材料与方法
111 植物材料
以浙江红山茶 ( Camellia chekiangoleosa Hu)、大
花红花油茶( Camellia magniflora Chang)生长良好的
愈伤组织及攸县油茶( Camellia grijsii Hance)的无菌
苗叶片为供试材料。
112 农杆菌及所含质粒
农杆菌菌株为 EHA105, 含 pKUC质粒, 该质粒
T2DNA中插入了新霉素磷酸转移酶基因 nptÒ、潮霉
素磷酸转移酶基因 hpt、gus报告基因及 Bt抗虫基因
cry I Ac。
113 方法
( 1)选择性抗生素浓度试验:以MS为基本培养
基,在选择性抗生素的培养基中附加 2, 42D 0. 5 mg#
L- 1、62BA 1 mg#L- 1 ,同时加入各种浓度的卡那霉素、
潮霉素。每个处理接种 32个直径为 015 cm左右的
愈伤组织, 24个 015 cm见方的叶片切块。
( 2)抑菌性抗生素浓度试验:以MS为基本培养
基,在抑菌性培养基中附加 62BA 2 mg#L- 1、KT 013
mg#L- 1、IBA 013 mg#L- 1 ,同时加入各种浓度的羧苄
青霉素、头孢霉素、羟氨苄青霉素。每个处理接种
24个外植体。
( 3)抑菌性抗生素抑菌作用:挑取农杆菌单菌落
接种于 LB液体培养基中振荡( 28 e )过夜, 转移到
悬浮培养液中振荡培养至对数生长期, 感染攸县油
茶叶片后共培养 3 d, 移到含各浓度的羧苄青霉素、
头孢霉素、羟氨苄青霉素培养基上。
2 结果与分析
211 选择性抗生素对山茶愈伤组织生长的影响
本试验所用的农杆菌携带的质粒含有新霉素磷
酸转移酶基因 nptÒ和潮霉素磷酸转移酶基因 hpt ,
分别对卡那霉素和潮霉素具有抗性, 因此以卡那霉
素和潮霉素作为抗性选择标记。
实验材料采用浙江红山茶和大花红花油茶的愈
伤组织, 置于添加选择性抗生素的培养基上培养。
培养一段时间后,一些愈伤组织开始停止生长,并由
接触培养基的边缘区域慢慢向中间褐化, 一个月后
便可看出,抗生素浓度由低至高变化中愈伤组织的
存活率也随之降低。试验表明:在两个物种中,浙江
红山茶愈伤组织对抗生素的反应稍比大花红花油茶
强烈,而且抗生素临界致死浓度也略比大花红花油
茶低,由图 1、2可见, 卡那霉素和潮霉素对浙江红山
茶的致死质量浓度分别为 50、25 mg#L- 1 , 而对大花
红花油茶愈伤组织的致死质量浓度分别为 60、30 mg
#L- 1 ,因此抗生素对浙江红山茶的敏感性高于大花
红花油茶。
图 1 卡那霉素对山茶愈伤组织存活的影响
图 2 潮霉素对山茶愈伤组织存活的影响
从上面数字也可看出, 两种抗生素对愈伤组织
生长的影响存在着显著差异,作为选择标记时, 卡
那霉素的临界致死质量浓度远高于潮霉素, 相对本
实验采用的浙江红山茶和大花红花油茶两个山茶
物种而言, 卡那霉素的致死质量浓度分别为 50、60
mg#L- 1 , 而潮霉素的致死质量浓度只需 25、30 mg#
L- 1。
212 选择性抗生素对山茶叶片愈伤组织诱导的影响
本试验用攸县油茶的叶片切块为外植体,在添加
卡那霉素和潮霉素的培养基上培养, 1个月后观察结
果。实验发现,一些叶片切块逐渐失去绿色而白化,抗
生素的质量浓度越高,叶片白化的数量就越多,而且即
使没有白化的叶片在高质量浓度的抗生素环境下也失
去了再生愈伤组织的能力。从图 3中也可以看出潮霉
素在较低质量浓度( 15 mg#L- 1)时就可以达到选择目
的,而卡那霉素需达到较高质量浓度( 50 mg#L- 1)。
184 林 业 科 学 研 究 第 18 卷
图 3 选择性抗生素对攸县油茶出愈率的影响
213 抑菌性抗生素的抗菌作用
在植物基因转化中常用的抑制农杆菌生长的抗
生素有羧苄青霉素、氨苄青霉素、头孢霉素等。由于
羟氨苄青霉素与氨苄青霉素具有相同的抗菌谱, 而
且药性更强,因此本实验采用羟氨苄青霉素代替氨
苄青霉素, 并与羧苄青霉素及头孢霉素进行比较。
感染外植体后, 不同抗生素及浓度对农杆菌的抑制
效果有所差异, 结果见表 1。
表 1 农杆菌在抑菌性抗生素培养基上的生长情况
抗生素 质量浓度P(mg#L- 1)
50 125 250 500
羧苄青霉素 + + - -
羟氨苄青霉素 + - - -
头孢霉素 - - - -
注: / + 0为农杆菌见生长; / - 0为农杆菌不见长。
从表 1中可看出, 头孢霉素的抑菌效果最好, 在
较低质量浓度( 50 mg#L- 1)下就可以完全抑制农杆
菌的生长,羧苄青霉素在 250 mg#L- 1以上时才发挥
作用,羟氨苄青霉素处于两者之间,其有效质量浓度
为125 mg#L- 1。
214 抑菌性抗生素对山茶愈伤组织生长的影响
在50~ 500 mg#L- 1的质量浓度范围内, 3种抑菌
性抗生素对大花红花油茶愈伤组织生长的影响呈现
了不同的变化。在添加各个质量浓度羧苄青霉素的
培养基上,大花红花油茶的愈伤组织都有不同程度
的生长,而羟氨苄青霉素对愈伤组织生长有轻微的
抑制作用,随质量浓度升高生长频率呈下降趋势, 头
孢霉素的抑制作用更明显, 在 500 mg#L- 1时则完全
抑制生长(图 4)。
以攸县油茶的叶片为材料时羧苄青霉素对其愈
伤组织的诱导有一定的促进作用,在 500 mg#L- 1时
可达 8715% ,羟氨苄青霉素基本不影响愈伤组织的
图 4 抑菌性抗生素对大花红花油茶愈伤组织生长的影响
诱导,而头孢霉素在 125 mg#L- 1时就有较强的抑制
作用,随浓度升高这种抑制作用则更明显(图 5)。
图 5 抑菌性抗生素对攸县油茶叶片生长的影响
3 小结与讨论
了解选择性抗生素对山茶愈伤组织诱导和生长
的最小抑制浓度, 有利于在转基因研究中采取恰当
的选择压力。本实验中浙江红山茶愈伤组织对选择
性抗生素的敏感性高于大花红花油茶愈伤组织, 而
且愈伤组织与叶片对抗生素的反应也有所差异, 因
此在转基因试验中, 应考虑到抗生素对山茶各物种
和外植体材料间的影响差异。
卡那霉素和潮霉素是遗传转化中常用的选择标
记,卡那霉素的临界致死质量浓度较高,一般在 50~
60 mg#L- 1之间, 作者常常采用略低于临界致死质量
浓度作为选择压力,若选择压力过大,不利于转化体
的生长。因此,在山茶遗传转化过程中卡那霉素所
用的质量浓度为 50 mg#L- 1 , 然而一些非转化体会逃
避选择而继续生长。本试验中潮霉素对所有山茶外
植体都比卡那霉素敏感,宜采用的质量浓度为 25 mg
#L
- 1
,但由于转基因中所用的质粒有一些不含有潮
霉素磷酸转移酶基因 hpt ,不能用潮霉素作为选择标
185第 2期 范正琪等:抗生素对山茶愈伤组织诱导和生长的影响
记,而且即使含有两个选择标记基因,在进行转基因
研究时需消耗大量的抗生素,潮霉素的成本远高于
卡那霉素,所以一般都以卡那霉素作为常用的选择
标记。
山茶外植体与农杆菌共培养后在表面及浅层组
织中共生有大量农杆菌, 为杀死和抑制农杆菌的继
续生长,以便外植体正常生长发育,必须进行抑菌培
养。本试验采用羧苄青霉素、羟氨苄青霉素、头孢霉
素作为抑菌性抗生素。在本试验中 3种抗生素都表
现出较好的抑菌效果, 相比之下头孢霉素在较低质
量浓度下就有较好的抑菌效果。
抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑制作用, 而且
对植物细胞也有一定的影响。由本试验可知, 随着
抗生素质量浓度的增加抑菌效果明显加强, 山茶愈
伤组织对 3种抑菌性抗生素表现出不同的反应:羧
苄青霉素没有影响, 羟氨苄青霉素有轻微的抑制作
用,而头孢霉素对愈伤组织有严重的伤害;而对攸县
油茶叶片诱导愈伤组织来说,羟氨苄青霉素影响不
大,羧苄青霉素和头孢霉素分别有促进和抑制作用。
综合考虑,认为在转基因实验中羧苄青霉素的可使
用质量浓度为 250 mg#L- 1 ,羟氨苄青霉素的可使用
质量浓度为125 mg#L- 1 ,但需谨慎使用头孢霉素。
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