全 文 ：收稿日期 : 2004202203
基金项目 : 科技部基础性工作专项子课题“亚热带珍贵经济树种资源收集、保存和利用”和亚热带林木培育实验室
基金课题“难繁阔叶树种组织培养技术的研究”
作者简介 : 苏梦云 (1942 —) ,女 ,福建莆田人 ,研究员.
林业科学研究　2004 ,17 (6) :757～762
Forest Research
　　文章编号 :100121498 (2004) 0620757206
乐东拟单性木兰茎段愈伤组织诱导
与褐变控制的研究
苏梦云 , 姜景民
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400)
摘要 :利用乐东拟单性木兰成龄树嫩枝茎段作外植体 ,研究了控制褐变和组织培养的技术。试验结果
表明 ,抗氧化剂控制褐变的效果比吸附剂好 ,以抗坏血酸最好 ,其次是巯乙醇和二硫苏糖醇。在培养基
中分别加入抗坏血酸 (10 mg L - 1) 、巯茎乙醇 (1 mL·L - 1 )和二硫苏糖醇 (115 mg·L - 1 )使外植体的褐变率
分别比对照降低 67 %、53 %和 33 %。在接种前 ,将外植体在 4 ℃下冷处理 2 h ,能使外植体的褐变率从对
照的 35 %降低为 25 %。1Π2MS和 WPM均是较合适的基本培养基。外植体在 BA 115 mg·L - 1 + NAA 012
mg·L - 1 + 2 ,42D 110 mg·L - 1的激素组合下 ,能诱导出较多的愈伤组织 ;在 WPM + BA 115 mg·L - 1 + KT 015
mg·L - 1 + NAA 012 mg·L - 1 + 2 ,42D 012 mg·L - 1的培养基上 ,能产生较多的不定芽和愈伤组织 ;WPM + BA
115 mg·L - 1 + KT 015 mg·L - 1 + NAA 012 mg·L - 1 + IAA 1 mg·L - 1的培养基适合于芽增殖 ;在 1Π2 MS + NAA
013 mg·L - 1 + IBA 012 mg·L - 1的培养基上 ,添加 15 g·L - 1活性炭有利于生根。
关键词 :乐东拟单性木兰 ;茎段 ;组织培养 ;褐变控制
中图分类号 :S72213 + 7 　　　文献标识码 :A
木兰科 (Magnoliaceae)植物以花大、美丽、清香著称于世 ,是世界著名的观赏园林绿化植物。
我国是木兰科树种资源最丰富的国家。全世界共有 15 属 250 余种 ,其中我国自然分布有 11
属 130 多种。由于不少种类分布狭窄 ,采种困难等原因 ,致使该科植物的繁殖研究滞后 ,其中
30 多种被列为国家珍稀濒危植物[1 ] 。加强木兰科植物的保护和扩繁 ,特别是无性繁殖的研究
受到广泛关注[2 ] 。由于常规无性繁殖方法 (扦插、嫁接等) 难度大 ,成活率低 ,研究组织培养快
繁技术已受到高度重视 ,但是木兰科树种在生长旺盛季节含较多的酚类化合物[3 ] ,此时取外植
体组培极易产生褐变 ,严重影响组织培养的成功率 ,所以至今只有含笑属 ( Michelia L. ) [4 ,5 ] 、木
兰属 ( Magnolia L. ) [6～10 ] 、和鹅掌楸属 (Liriodendron L. ) [11～13 ]几个树种有报道。
乐东拟单性木兰 ( Plarakmeria lotongensis (Chun et C. Tsoong) Law)是木兰科拟单性木兰属的
重要常绿乔木 ,是我国的特有种。树形美观 ,叶革质 ,狭椭圆形 ,叶面暗绿色 ,叶背淡绿色 ,树干
高大、笔直 ,材质优良 ,纹理细密 ,是优良的用材和绿化树种[14 ] 。本文以乐东拟单性木兰成龄
树 (18 年生)为试材 ,研究组织培养和控制褐变的技术 ,通过诱导丛生芽与植株再生的方法 ,以
期为乐东拟单性木兰的快速繁殖提供一条有效途径 ,为木兰科其它树种的快繁提供参考。
1 　材料与方法
111 　外植体及培养基
选取本所成龄 (18 年生)的乐东拟单性木兰 ,分别在 4 —5 月份采取嫩枝 ,用洗洁精清洗 ,用流
水冲洗 1 h ,沥干 ,切成长 1 cm左右的茎段 ,每一个茎段带 1 腋芽 ,先后用体积百分数 75 %的乙醇
处理 10 s ,1 g·L - 1的氯化汞 10 min 灭菌 ,无菌水冲洗 4 次 ,吸干 ,接种到培养基上。以 MS ,1Π2 MS
和 WPM为基本培养基。添加 3 种生长调节剂 ,即BA(质量浓度设 015、110、115 mg·L - 1 ) ,NAA (质
量浓度设 0、012、015 mg·L - 1 ) ,2 ,42D(质量浓度设 0、110、210 mg·L - 1 ) ,以 4 因素 3 水平进行正交设
计试验 (L934 ) 。培养基含蔗糖 30 g·L - 1 、琼脂 715 g·L - 1 ,pH值 518 ,培养温度 25 ±1 ℃,每日照光
12 h ,光强度为 1 500～2 000 lx ,每个处理 10 瓶 ,每瓶接 4 个外植体 (约 015 cm×015 cm) 。
1. 2 　防褐化试验
分外植体处理、培养基加防氧化物质和培养条件 3 种。外植体处理 :在接种前作以下处
理 : (1)将采回的嫩枝用湿纱布包好在 4 ℃下分别冷藏 2 h 和 4 h 后 ,切成茎段 ,灭菌 ; (2) 将外
植体在灭菌前先在 1 g·L - 1的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP) 溶液中分别浸 1 h 和 2 h ; (3) 灭菌后的茎
段在 PVP 溶液中切割 ,接种 ; (4) 对照 (按常规处理) 。抗氧化试验 :在培养基中分别加入二硫
苏糖醇 (015 mg·L - 1 ) 、硫基乙醇 (1 mL·L - 1 ) ,抗坏血酸 (10 mg·L - 1 ) 、PVP (1 g·L - 1 ) 和活性炭
(115 g·L - 1 ) ,并设对照。培养条件试验 :培养条件分为 3 种 : (1) 对照 (在 25 ℃下 ,每天照光 12
h) ; (2)遮光处理 (在 25 ℃下遮光 15 d 后 ,转入光下) ; (3) 低温遮光处理 (在 15 ℃下遮光 15 d
后 ,转入 25 ℃光下) 。
1. 3 　生长调节剂组合试验
采用 4 种生长调节物质 :BA(质量浓度为 015、110、115 mg·L - 1 ) ,KT(质量浓度为 0、015、110
mg·L - 1 ) ,NAA(质量浓度为 0、012、015 mg·L - 1 ) ;2 ,42D(质量浓度为 0、012、015 mg·L - 1 ) ,进行正
交设计 (L9 34 ) 。以 WPM 为基本培养基 ,培养基中加入 10 mg·L - 1抗坏血酸。
2 　结果与分析
211 　基本培养基对茎段初代培养的影响
为了选择适合的培养基和生长调节剂的组合配比 ,按试验要求 ,将外植体分别接种在 9 类
培养基上 ,培养 40 d 统计外植体愈伤组织诱导和褐变情况 (表 1) 。从表 1 可见 ,BA 极差最大 ,
其次是 2 ,42D 和培养基 ,说明 BA 在诱导茎段愈伤组织形成的培养过程中是主导因素。3 种培
养基都可作为基本培养基 ,但以 1Π2MS 和 WPM 培养基较为为合适。根据分析 ,适合茎段初代
培养的最佳理论配方为 1Π2 MS(或 WPM) + BA 115 mg·L - 1 + NAA 012 mg·L - 1 + 2 ,42D 110 mg·
L - 1 。在初代培养中 ,外植体褐变的现象比较严重 ,对初代培养影响比较突出。
212 　几种防褐化措施对控制外植体褐变的作用
组织培养过程中的褐变是指外植体在切割时酚类化合物外溢 ,通过自动氧化或酶催化形
成褐色的醌类物质向培养基中扩散 ,使外植体褐变甚至死亡。为了寻求有效地控制褐变的方
法 ,分别从外植体处理、在培养基中加入防止酚氧化物质及培养条件 3 个方面 ,进行了比较试
验。培养基采用 WPM + BA 115 mg·L - 1 + NAA 012 mg·L - 1 + 2 ,42D 110 mg·L - 1培养 40 d 统计防
褐效果。
857 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 17 卷
表 1 　培养基及生长调节剂组合对初代培养的影响
处理 培养基
植物生长调节剂Π(mg·L - 1)
BA NAA 2 ,42D 褐变率Π% 愈伤组织诱导率 (X)Π% 数值转换X′= sin - 1 X
1 MS 015 0 0 4010 2010 26157
2 MS 110 012 110 3510 5010 45100
3 MS 115 015 210 4715 5215 46143
4 1Π2MS 015 012 210 2510 4215 40169
5 1Π2MS 110 015 0 2215 4510 42113
6 1Π2MS 115 0 110 3010 6010 50177
7 WPM 015 015 110 2010 3715 37176
8 WPM 110 0 210 2715 5010 45100
9 WPM 115 012 0 3510 5715 49131
T1 118100 105102 122134 118101 T = 383166
T2 133159 132113 135100 133153 T2 = 147 195100
T3 132107 146151 126132 132112
X1 39133 35101 40178 39134
X2 44153 44104 45100 44151
X3 44102 48184 42111 44104
极差 5120 13183 4122 5117
　　注 :褐变率指褐变的外植体数占外植体总数的百分比 ;愈伤组织诱导率指形成愈伤组织的外植体占总数的百分比。表 2
～5 同。
21211 　外植体处理对褐变的影响 　接种前外
植体防褐变预处理的试验结果见表 2。外植
体预冷处理有一定的降低褐变率的效果 ,使褐
变率从对照的 35 %降低为 25 %～2715 %。这
可能与低温可以降低多酚氧化酶活性和减少
酚类氧化有关[15 ] 。接种前在 PVP 溶液中切割
外植体能减轻褐变 ,主要是 PVP 能及时除去
外植体切割时分泌的酚类物质 ,防止氧化或酶
催化。外植体用 PVP 溶液浸泡处理没有防褐
化效果 ,这主要在浸泡处理后 ,切割外植体接
种时 ,切口仍有酚类物质外溢。
21212 　几种防酚氧化物质对外植体褐变的影
响 　在培养基中加入抗氧化剂能明显的防止
外植体褐变。在培养基中分别加入抗坏血酸
(10 mg·L - 1 ) 、巯基乙醇 (1 mL·L - 1 )和二硫苏糖
表 2 　不同处理对控制外植体褐变的效果比较
处理 褐变率Π% 愈伤组织诱导率Π%
冷藏
2 h 2510 7010
4 h 2715 7215
PVP 溶液浸泡
1 h 3510 6510
2 h 3215 6715
在 PVP 溶液中切割 2715 7010
对照 3510 6510
表 3 　几种防酚氧化物质对控制褐变的效果比较
处理 褐变率Π% 愈伤组织诱导率Π%
二硫苏糖醇 (015 mg·L - 1) 2510 7215
巯基乙醇 (1 mL·L - 1) 1715 8215
抗坏血酸 (10 mg·L - 1) 1215 8715
PVP(1 g·L - 1) 3215 7010
活性炭 (115 g·L - 1) 3510 6715
　　　对　照 3715 6215
醇 (015 mg·L - 1 ) ,外植体的褐变率从对照的 3715 %分别降低为 1215 %、1715 %和 25 % ,而且还
不同程度地提高了愈伤组织的诱导率 ,但吸附剂活性炭和 PVP 的防止外植体褐变效果不明显
(表 3) 。
21213 　培养条件对控制褐变的影响　不少研究者证明 ,较高的培养温度能加速外植体褐变 ,
而在弱光下培养有减缓外植体褐变的作用 ,但用不同树种试验所得的结果并不完全一致[16 ] 。
乐东拟单性木兰在含有 BA 115 mg·L - 1 + NAA 012 mg·L - 1 + 2 ,42D 110 mg·L - 1和 10 mg·L - 1抗
坏血酸的WPM基本培养基上 ,经低温遮光条件预处理后 ,培养40 d褐变率下降1Π3 ,而遮光处
957第 6 期 苏梦云等 :乐东拟单性木兰茎段愈伤组织诱导与褐变控制的研究
理没有效果 (表 4) 。低温遮光处理能降低褐
变率 ,这可能与低温可抑制酶活性、减少酚类
氧化的作用有关[15 ] ,而遮光处理没有明显效
果 ,说明乐东拟单性木兰的外植体褐变对光不
敏感。
表 4 　低温和遮光处理对褐变控制的效果
处理 褐变率Π% 愈伤组织诱导率Π%
对照 15 85
遮光处理 15 70
低温遮光处理 10 75
213 　不同生长调节剂对不定芽诱导和增殖的影响
为找出适当的生长调节剂组合 ,进行了该方面的组合试验。在 4 因素 3 水平的正交试验的 9
个组合中 ,以 WPM为基本培养基 (培养基中加入 10 mg·L - 1抗坏血酸) ,培养 60 d 进行统计。试
验结果见表 5 ,处理 9、6、5 的不定芽的诱导率较高 ;从极差来看 ,BA 的极差最大 ,其次是 KT ,说明
细胞分裂素是诱导不定芽的主要因素。较高质量浓度的BA 和 KT ,有利于愈伤组织形成不定芽。
添加适当的低质量浓度的 NAA 或 2 ,42D 可提高诱导不定芽的速率 ,而质量浓度较高有利于形成
新的愈伤组织。根据表 5 的试验结果分析可知 ,从愈伤组织诱导形成不定芽的最佳理论配方是 :
WPM + BA 115 mg·L - 1 + KT 015 mg·L - 1 + NAA 012 mg·L - 1 + 2 ,42D 012 mg·L - 1 。
表 5 　不同生长调节剂组合对不定芽诱导的影响
处理
BA KT NAA 2 ,42D
(mg·L - 1)
愈伤组织
诱导率Π% 不定芽①XΠ% 数值转换X′= sin - 1 X
1 015 0 0 0 2510 215 9110
2 015 015 012 012 7510 3215 34179
3 015 110 015 015 8715 1510 22179
4 110 0 012 015 8010 3010 33121
5 110 015 015 0 6510 5010 45100
6 110 110 0 012 8010 5215 46143
7 115 0 015 012 8010 3215 34176
8 115 015 0 015 9010 4715 43157
9 115 110 012 0 8715 5510 47187
T1 66168 77107 99110 101197 T = 417141
T2 124164 123136 115187 115198 T2 = 174 231111
T3 126120 117109 102155 99157
X1 22123 25169 33103 33199
X2 41155 41112 38162 38166
X3 42107 39103 34118 33119
极差 23119 15143 5159 5147
　　注 : ①指增殖不定芽的外植体数占外植体总数的百分比。
不定芽的增殖 :将初代培养所得的不定芽
切割成单芽后 ,接种到含有不同生长调节剂的
WPM培养基上 ,培养 50 d 后统计增殖结果。
结果显示 ,在加入 IAA 的培养基上 ,芽丛生长
较好 ,以 BA 115 mg·L - 1 + KT 015 mg·L - 1 +
NAA 012 mg·L - 1 + IAA 1 mg·L - 1 的组合较为
合适 ,增殖倍数为 411 倍 (表 6) 。 表 6 　生长调节剂对不定芽增殖的影响生长调节剂组合及其质量浓度Π(mg·L - 1) 不定芽Π% 增殖倍数BA 115 + KT 015 + NAA 012 5510 318BA 115 + KT 015 + NAA 012 + 2 ,42D 012 5215 316BA 115 + KT 015 + NAA 012 + IAA 015 5715 319BA 115 + KT 015 + NAA 012 + IAA 110 6010 411BA 115 + KT 015 + NAA 012 + IAA 115 5510 317
214 　根诱导培养
将继代培养的不定芽长至 215 cm 左右时 ,进行根诱导培养。培养基为 3 种 : (1) 1Π2 MS +
067 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 17 卷
NAA 015 mg·L - 1 ; (2) 1Π2 MS + IBA 015 mg·L - 1 ; (3) 1Π2 MS + NAA 013 mg·L - 1 + IBA 012 mg·L - 1 ,
每种培养基均加入 15 g·L - 1的活性炭。结果表明 ,以 1Π2 MS + NAA 013 mg·L - 1 + IBA 012 mg·
L - 1的效果较好 , 培养 40 d ,开始生根。
3 　小结与讨论
木本植物的组织培养比草本植物困难得多 ,主要是木本植物含有较多的酚类化合物。在
外植体切割时 ,酚类化合物溢出并氧化成褐色醌类物质 ,使外植体褐变 ,甚至造成死亡[16 ] 。特
别是在生长旺盛季节酚类化合物含量增加 ,多酚氧化酶活性明显提高 ,极易产生褐变[3 ] 。所以
不少研究指出 ,能否有效地控制褐变是植物组织培养能否成功的关键[17 ,18 ] 。根据已报道的木
兰科植物组织培养资料看 ,都存在着不同程度的褐变现象。一般采取加入抗氧化剂[13 ] 或活性
炭[5 ] ,或采取及时转接[9 ]等措施控制褐变 ,但在乐东拟单性木兰的组织培养中 ,外植体的褐变
现象比较突出 ,即使及时转接 ,还会产生褐变 ,所以作者认为用乐东拟单性木兰茎段 ,特别是用
成龄树嫩枝的茎段作外植体进行组织培养能有效地控制褐变。本文通过对外植体进行冷处理
和接种后先在 15 ℃培养 15 d ,可使褐变率明显降低 ,这与冷处理可降低酶活性有关。在培养
基中加入抗氧化剂 ,有明显的防褐化效果 ,以加入抗坏血酸的效果最佳 ,这与杂交鹅掌楸 (Liri2
odendron chinense (Hemsl . ) Sarg. ×L . tulipifera L. ) ) 中的结果相同[13 ] 。吸附剂可吸附外植体分
泌的酚类物质 ,防止其氧化从而减少褐变[19 ] ,但在培养基中分别加入活性炭和 PVP ,对乐东拟
单性木兰组培的防褐化效果不太明显 ,这可能是不同树种间及外植体取材上存在的差异。在
愈伤组织继代培养时 ,加 012 mg·L - 1 2 ,42D 有利于增殖 ,这与深山含笑 ( Michelia maudiae Dunn)
相同[5 ] 。在不定芽增殖培养时 ,加入 1 mg·L - 1 IAA 有利于丛芽生长。
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A Study on Techniques of Inducing Callus and Controlling
Browning of Stem Segments of Parakmeria lotongensis
SU Meng2yun , JIANG Jing2min
(Reseach Institute of Subtropical Forestry ,CAF ,Fuyang 　311400 ,Zhejiang ,China)
Abstract :Techniques of controlling browning and tissue culture on stem segments of young branches on mature
trees of Parakmeria lotongesis were researched. Results obtained showed that 1Π2 MS medium and WPM medium
were more suitable to tissue culture of Parakmeria lotongensis . A lot of callus were induced on WPM medium
containing BA 115 mg·L - 1 ,NAA 012 mg·L - 1 and 2 ,42D 110 mg·L - 1 . A large number of adventitious buds
and some calluses induced from calluses were observed on WPM medium supplemented with BA 115 mg·L- 1 ,
KT 015 mg·L - 1 ,NAA 012 mg·L - 1 and 2 ,42D 013 mg·L - 1 . The medium of WPM + BA 115 mg·L - 1 + KT
015 mg·L - 1 + NAA 012 mg·L - 1 + IAA 110 mg·L - 1 was fit to shoot proliferation. Plantlets rooted well on 1Π2
MS medium containing NAA 013 mg·L - 1 and IBA 0. 2 mg·L - 1 with 1. 5 percent active charcoal . The effects of
antioxidizer on controlling oxidative browning was better than that of adsorbent . There were difference among var2
ious antioxidizers on controlling browning. Their capacities of preventing browning were as follows :ascorbic acid
(vitamin C) > mecapto ethanol > dithiothreitol . Effects of polyvinylpyrrolidone ( PVP) and active charcoal on
preventing browning were not obvious. Oxidative browning rates of explants on WPM medium supplemented with
ascorbic acid (10 mg·L - 1) ,mecapto ethanol (1 mL·L - 1) and dithiothreitol (015 mg·L - 1) were 67 % ,53 %
and 33 % lower than that of without any antioxidizer in initial culture and subculture. The treatment that explants
were putfor 2 h at 4 ℃before inoculation favor the decreasing browning , esplants browning rate decreased from
35 % (CK) to 25 %.
Key word : Parakmeria lotongensis ;stem segment ;tissue culture ;controlling of browning
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