全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (1) : 21～28
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0120021208
树木溃疡病重要病原葡萄座腔菌属、种
及其无性型研究
王金利 1 , 贺　伟 23 , 秦国夫 3 , 陶万强 1 , 赵　俊 4 , 田淑敏 4
(1. 北京市林业保护站 ,北京　100029; 2. 北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室 ,北京　100083;
3. 辽宁省鞍山市政府 ,辽宁 鞍山　114002; 4. 国家林业局森林病虫害防治总站 ,辽宁 沈阳　110034)
摘要 :本实验在我国的多种树木上采集了 56个溃疡病标本 ,采用形态学方法和分子生物学方法 ( ISSR技术 )研究病
原菌。通过徒手切片和石腊切片观察 ,供试病原菌有性型为 B otryosphaeria dothidea;无性型特征与国外所报道的七
叶树壳梭孢 ( Fusicoccum aescu li)一致。根据 ISSR技术得到的系统树显示 ,供试菌株与国外提供的 F. aesculi (有性
阶段为 B. dothidea)菌株以 100%相似性聚为一类。因此 ,实验采集的树木溃疡病菌是 B. dothidea,其无性型不是
D oth iorella gregaria,而是 F. aescu li,故应使用 F. aesculi作为 B. doth idea的无性型名称。此外 ,通过国内的 B. do2
th idea和国外已发表的 B. ribis的特征对照 ,发现二者确实不同 : B. ribis的分生孢子宽度大于 8. 0μm, L /D值的平
均值小于 2. 6;而本实验测量的 B. dothidea的分生孢子宽度在 6. 2～7. 6μm之间 , L /D值的平均值在 2. 9～3. 6之
间 ; ISSR所得系统树也显示二者属于不同的种。所以 B. doth idea和 B. ribis是两个不同的种 ,而不是同物异名。
关键词 :葡萄座腔菌 ;小穴壳属 ;壳梭孢属 ;无性型 ;同物异名
中图分类号 : S718. 81 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006207218
基金项目 : 国家自然科学基金 (项目编号 : 39970617)
作者简介 : 王金利 (1978—) ,男 ,河北唐山人 ,工程师 ,从事森林病理研究及林业保护工作.3 通讯作者.
Study on the Anam orph and Spec ies of B otryosphaeria,
the Im portan t Pa thogen of Tree’s Canker
WANG J in2li1 , HE W ei2 , Q IN Guo2fu3 , TAO W an2qiang1 , ZHAO Jun4 , TIAN Shu2m in4
(1. BeijingMunicipal Forestry Protection Station, Beijing 100029, China; 2. The Key Laboratory for Silviculture and Conservation ofMinistry of Education,
Beijing Forestry University, Beijing　100083, China; 3. Anshan Municipal Government of L iaoning Province, Anshan　114002, L iaoning, China;
4. General Station of Forest PestManagement, State Forestry Adm inistration, Shenyang 110034, L iaoning, China)
Abstract: The authors collected canker specimens on many trees in China and isolated the pathogen and inoculated
Popu lus ×beijingensis in order to confirm pathogenicity. The morphologic method and ISSR technique were app lied
to analyze the phylogeny, and the result was compared to foreign’s. According to the morphologic character of conid2
iophore, The species collected was B otryosphaeria doth idea , whose morphological character of anamorph accorded
with Fusicoccum aescu li reported by foreign countries. According to the dendrogram generated by UPGMA cluster a2
nalysis of the ISSR fingerp rints from the cuthors’isolates and F. aescu li come from foreign countries, both were clas2
sified to one cluster by sim ilarity 100%. So the authors concluded that the pathogen of canker collected was B. do2
th idea , which anamorph was not D oth iorella grega ria, but F. aescu li, and F. aescu li could be used as anamorph of
B. doth idea. Moreover, B. ribis was not obtained in the experiment, but it was different from B. doth idea in Chi2
na, according to the character of B. ribis was republished abroad. The conidialwidth of B. ribis was over 8. 0μm ,
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
but the conidialwidth of B. doth idea was 6. 2～7. 6 μm. The ratio of conidial length and width of B. doth idea was
over 2. 9, but B. ribis was below 2. 6. It could be concluded that B. ribis and B. doth idea were different species
from the dendrogram generated by UPGMA cluster analysis of the ISSR fingerp rints. So, B. ribis and B. doth idea
were different species, not synonym.
Key words: B otryosphaeria; D oth iorella gregaria; Fucicoccum aescu li; anamorph; synonym
葡萄座腔菌属 (B otryosphaeria Ces. & De Not. )
真菌是世界范围广布的一类病原菌 ,在我国分布于
东北、华北、西北和江淮等广大区域 ,它们引起的多
种树木溃疡病是目前我国重大生物灾害之一 ,受到
广泛的关注 [ 1 ]。但迄今为止 ,引起我国树木溃疡病
的葡萄座腔菌属病菌的种类仍有不同的称谓 ,病菌
的无性型与国际上不一致 ,需要加以研究。
葡萄座腔菌属病菌种类及其无性型的关系 ,是
一个颇为繁难的问题。由于葡萄座腔菌属真菌的有
性阶段在自然条件下很少出现 ,所以本属真菌多数
情况下只能根据无性型的特征进行分类和鉴定 ,而
本属真菌无性型的种间特征很相似 ,不容易把有性
型和无性型正确地对应起来。
Cesati和 De Notaris[ 2 ]在建立 B otryosphaeria属
时 ,描述了模式标本 B. doth idea。 Saccardo[ 3 ]首次
将 B. doth idea的无性型鉴定为 Fusicoccum aescu li
Corda,但由于 Corda[ 4 ]建立新属 Fusicoccum 时没有
指明模式标本 F. aescu li的存放地点 ,致使后来者
无法验证模式标本 ,从而对 Saccardo鉴定的 F.
aescu li持有疑问 ,所以 Petrak[ 5 ]将 B. doth idea的无
性型鉴定为 D oth iorella Sacc. ; Shear et a l. [ 6 ]将 B.
ribis的无性型命名为 D oth iorella g rega ria Sacc. 。但
Sutton[ 7 ]认为 ,虽然 Saccardo没有看到 Corda的模
式标本 ,但是 Saccardo的描述和绘图与 Corda的绘
图极其相似 ,表明 Saccardo的鉴定是正确的 ,指出
B. doth idea和 B. ribis的无性型都是 F. aescu li。
此后 , M aas & Uecker[ 8 ] 、Pennycook et a l. [ 9 ] 、Mor2
gan et a l. [ 10 ] 、Rayachhetry et a l. [ 11 ]和 Phillip s et
a l. [ 12 ]分别对 B. doth idea的无性型进行了详细研
究 ,结果一致同意 Sutton的结论 ,否定了 D oth iorella
g rega ria。此外 , Crous和 Palm [ 13 ]重新检查 D oth io2
rella Sacc. 属的模式标本 ,认为 D oth iorella与 D iplo2
d ia Sacc. 是同物异名 ;而且 D oth iorella属名存在歧
义 [ 14 ] ,未被 Sutton承认 [ 7 ] 。因此 ,国际上目前只承
认 B. doth idea与 F. aescu li的对应关系。此外 , B.
ribis和 B. doth idea. 被许多学者认为是同物异
名 [ 8 ] ,也有一些作者把二者看作两个独立的种 ,但
新近的研究表明 B otryosphaeria doth idea和 B otryo2
sphaeria ribis是不同的种 [ 15 ] , B. ribis的无性型为
Fusicoccum sp.
在我国 , B. doth idea[ 16～18 ]和 B. ribis[ 19, 20 ]分别
被作为杨树溃疡病病菌有性型的名称 ,而以 D oth i2
orella g rega ria作为其无性型的名称 ;在果树上 ,使
用 B. ribis作为桃树流胶病病原菌的名称 ,无性型
为 D. g rega ria[ 21 ] ;有的学者则将 B. doth idea和 B.
ribis视为同物异名 ,无性型为 D oth iorella g rega r2
ia[ 18, 20, 22, 23 ] 。张星耀等 [ 24, 25 ]用 28 s rDNA - RFLP和
RAPD方法分析了葡萄座腔菌属及相关属的菌株 ,
结果表明 :所有供试菌株都能扩增出稳定一致的
28S rDNA条带 , 6种内切酶不能区分葡萄座腔菌
属内部的 28 s rDNA 差异。鉴于国内外对 B. do2
th idea的无性型的名称有不同的称谓 ,本文作者在
国内多种树木上采集了由葡萄座腔菌属真菌引起
的溃疡病标本 ,进行病原菌的分离培养 ,并向美国
威斯康星大学 Glen R. Stanosz教授索要了 4个菌
株 ,利用常规形态特征鉴定和分子生物学方法 ( IS2
SR, Inter2simp le sequence repeats) [ 26 ] ,从形态和分
子两方面把收集到的国内外菌株进行了对比 ,以澄
清我国由葡萄座腔菌属真菌引起的树木溃疡病的
病菌种类及其无性型的种类和名称 ,这对于树木溃
疡病菌的系统学、病害流行学研究及病害防治都有
重要意义。
1　材料和方法
1. 1 标本采集和菌株分离
本试验共采集了 6个省 (市 ) 13个地区的 16个
树种 (阔叶树 11个属和针叶树 2个属 )的 56个溃疡
病标本 (其中 33个标本用于本实验研究 )。将所有
标本进行分离培养 ( PDA培养基 ) ,得到目标菌株。
1. 2 致病性测定
北京杨是一个易感染溃疡病的树种 ,选取北京
杨做接种对象 ,目的是检测所有分离菌株是否有致
病性 ,亦可获得分生孢子器 ,用做形态鉴定。选取不
同寄主、不同地点的有代表性的菌株 (表 1) ;选取直
22
第 1期 王金利等 :树木溃疡病重要病原葡萄座腔菌属、种及其无性型研究
径约 2 cm的北京杨 2年生枝条 ,截成长 40 cm,在其
上打孔接种。每个菌株接种 3个枝条 ,每个枝条接
种 3个点。接种后放入 25 ℃培养箱中保湿培养 ,每
天进行观察。
表 1　实验所选用菌株
标本 /菌株号 用途 真菌名称 寄主 采集地点
942128 a, c B. ribis M elaleuca quinquenervia Florida, USA
9725 a, c B. doth idea 苹果 M alus sp. W isconsin, USA
97288 a, c Fusicocuum luteum 中华猕猴桃 A ctinidia chinensis Planch. New Zealand
96229 a, c B. parva 苹果 M alus sp. New Zealand
990721 a, c 北京杨 Populus ×beijingensis W. Y. H su 北京昌平马池口
9908 a, c 富士苹果 M alus pum ila M ill. 北京十三陵
991021 a, c 中林杨 Populus n igra L. ×P. sinonii Carr. . 北京昌平马池口
000122 a, c 合欢 A lbizia julibrissin Durazz 河南
0004 a, c 彰武小钻 Populus ×xiaozhuanica W. Y. H su et L iang cv.‘Zhangwu‘ 辽宁阜新
0104 a, c 毛白杨 P. tom entosa Carr. 河南修武
0213 a, b, c 北京杨 北京林业大学
0233 a 柳树 Salix sp. 北京大东流苗圃
0234 a 柳树 北京大东流苗圃
0250 a, b, c 槐树 Sophora japonica L inn. 北京大东流苗圃
0252 a, b, c 核桃 Juglans regia L inn. 河北滦县
0253 a, c 苹果 M alus pum ila M ill. 北京海淀区东北旺
0221 b, c 北京杨 北京怀柔区渤海镇
0233 b, c 柳树 北京大东流苗圃
0234 b, c 柳树 北京大东流苗圃
0235 b, c 柳树 北京大东流苗圃
0240 b, c 欧美杨 107杨 P. ×euram ericana (Dode) Guineir cv.‘Neva’ 北京大东流苗圃
0241 b 北京杨 北京大东流苗圃
0243 b 核桃 北京林业大学
0246 b, c 杨树 Populus sp. 江苏新沂
000222 c 毛白杨 辽宁沈阳
0107 c 雪松 Cedrus diodara (Roxb. ) G. Don 山西长治
020223 c 毛白杨 辽宁沈阳
0209 c 北京杨 北京海淀区清华园
0227 c 核桃 北京怀柔区
0239 c 海棠 M. spectabilis (A it) Borkh. 北京大东流苗圃
0245 c 核桃 北京林业大学
0251 c 板栗 Castanea m ollissim a B lume 北京怀柔
0254 c 柳树 北京海淀区东王庄
　　注 : a:致病性测定所选用的菌株 ,其中 ,菌株 942128、9725、97288和 96229均由美国威斯康星大学的 Glen R. Stanosz教授提供。接种、培养等
试验均在室内严格控制条件下进行 ,接种发病检查后的枝条及时销毁 ; b:用于致病菌形态鉴定的标本 ; c:用于 ISSR分析的菌株。
1. 3 形态观察和鉴定
1. 3. 1 材料 　选取有典型子座的标本进行形态观
察和鉴定 (表 1)。
1. 3. 2 徒手切片观察 　采用徒手切片法观察野外
采集标本、室内 PDA培养和人工接种发病枝条上产
生的子实体特征。在油镜 (目镜 100 ×)下随机测量
50个孢子 ,典型切片进行拍照。
1. 3. 3 石蜡切片观察 [ 27 ] 　在徒手切片的基础上 ,
制做石蜡切片 ,观察形态特征。选取新鲜的有典型
症状的病斑 ,切成约 4 mm ×3 mm的块状 ,用福尔马
林 /醋酸 /酒精固定液 ( FAA )固定 18 h以上 ,然后制
作石蜡切片。选取典型的切片进行显微观察和
拍照。
1. 4 ISSR技术
1. 4. 1 菌株选择 　选择不同寄主不同地点的有代
表性的菌株 ,用于 ISSR分析。实验所选菌株见表 1。
1. 4. 2 DNA提取
1. 4. 2. 1 　菌丝培养 　使用灭菌的 cellophone膜
(121 ℃, 30 m in)培养菌丝。在接种前 ,取一张膜覆
盖在培养皿中的培养基表面 ,然后将所选菌株接种
到膜上 , 25 ℃下培养。菌丝可以透过膜吸收营养
而在膜上面生长 ,菌丝容易收集。生长 3～4 d后 ,
在 cellophone膜上生长一层菌丝 ,用镊子和刀片将
32
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
这层菌丝掀起 , 50 ℃下干燥后保存备用。
1. 4. 2. 2 DNA 提取方法 　在 Yao Y. 2J et a l. [ 28 ]
的提取方法基础上加以改进 ,用于本实验的 DNA
提取。取约 20 mg干菌丝 ,加液氮研磨成粉末 ,移
至 1. 5 mL eppendorf管中 ,加 65 ℃预热的 CTAB
提取液 ( 2% CTAB , 1. 4 mol· L - 1 NaCl, 100 mmol
· L - 1 Tris2HCl, 10 mmol· L - 1 EDTA ) 700 μL,放
入 65 ℃水浴锅中温浴 40 m in,期间摇晃几次 ,使
其充分裂解。从水浴锅中取出后 ,加入等体积的
酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25∶24∶1) ,摇晃 10 m in,离心 10
m in ( 12 000 rpm·m in - 1 ) ,取上清液 ,转入另外一
个管中 ,再加入等体积的酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25∶24
∶1)抽提一次 ;取上清 ,加等体积的氯仿 /异戊醇抽
提 2次 ;取上清液 ,加入 2 /3体积的 - 20 ℃的异
丙醇沉淀 DNA ,放入 - 20 ℃下 15～30 m in。取出
后离心 8 m in ( 10 000 rpm·m in - 1 ) ,弃掉液体 ,加
入 - 20 ℃下的 70%酒精洗涤沉淀 2次 ,晾干 ,加
100μL TE溶液 (10 mmol·L - 1 Tris2HCl, 1 mmol·
L - 1 EDTA , pH值 8. 0,含 RNAase A 10μg·mL )溶
解 DNA , 37 ℃水浴 1 h去除 RNA , - 20 ℃下保
存备用。
1. 4. 3　引物筛选和反应条件优化 根据 Hantula
et a l. 及 Zhou Shiguo et a l. [ 29～33 ]所用 ISSR引物的
结果 ,从中选取 8个效果较好的引物 ,通过上海基
康生物公司合成 (表 2)。
表 2　 ISSR引物及退火温度
引物序列 退火温度 /℃ 参考文献
5′DDBa (CCA) 5 49 Hantula, et al. [29 ]
5′(CAG) 5 64 Zhou Shiguo, et al. [30 ]
5′HYH ( GTG) 5 64 Zhou Shiguo, et al.
5′DHB (CGA) 5 61 Müller, et al. [31 ] ; Burgess, et al. [ 32 ]
5′BDB (ACA) 5 49 Hantula, et al[33 ]
5′BBB ( GAAA) 3 GAA 45 Hantula, et al.
5′HYH ( GT) 7 58 Zhou Shiguo, et al.
5′BBD (AAC) 5 45 Zhou Shiguo, et al.
　　注 : a: B代表碱基 C, G或 T; D代表碱基 A, G或 T; H代表碱基
A, C或 T; U代表碱基 A, C或 G
1. 4. 4　PCR扩增检测 　使用 ABM 22400PCR仪进
行 ISSR ( Inter simp le sequence repeats)扩增。按已
经优化的反应条件扩增所有 DNA ( Taq DNA 聚合
酶、dNTP由华美公司生产 ) ,用 1. 8%琼脂糖凝胶
(0. 5 ×TBE缓冲液 )检测 PCR产物 ,加样量为 8μL,
DNA片断大小用 2 kb Marker(华美生物公司 )标记 ,
3 V /cm ×3 h, EB染色 20 m in,紫外光检测。实验重
复两次。
1. 4. 5　 ISSR 结果统计分析 　根据 PCR 产物图
谱中 M arker的大小分别判读所扩增 DNA片段的
大小 ,标记基因位点 ,分别统计每个菌株各个位
点的特征 ,有带标记为 1 ,无带则标记为 0 ,得到
一个二进制矩阵 ,使用软件 N TSYSpc 2. 02 分析
矩阵 ,构建系统树。
2　结果与分析
2. 1　致病性测定结果
接种 9 d后 ,枝条开始发病。12 d时所有菌株
(包括美国的 4个菌株 )均导致发病 ,但发病程度有
比较显著的差别 ,其中从北京杨上分离的菌株 99072
1造成的病斑最宽 ,从苹果上分离的菌株 9908造成
的病斑最小。来自美国的 4个菌株也在北京杨枝条
上引起病斑。对照无病斑。
2. 2　形态观察和鉴定结果
野外采集的标本上的有性阶段很难看到 ,只
在个别标本中观察到少量的子囊 (图 1A ) ,子囊
双层壁 , 56. 8～81. 5 ×14. 8～22. 3 μm ,子囊孢
子半透明、薄壁、单细胞 , 20. 0～27. 5 ×7. 5～10
μm (图 1B ) 。
载孢体从单腔结构 (图 1C )到多腔的真子座
结构 ,在有些分生孢子器中可看到有瓶梗结构的
产孢细胞 (图 1D ) ;产孢细胞以全壁芽生方式产
生第一个分生孢子 ,后为内壁芽生 ,可连续产生
多个分生孢子 ,分生孢子梗基部分枝 ;分生孢子
无色透明、无隔 ,纺锤形或椭圆形 ,一部分分生孢
子基部截形 ,其它的分生孢子两端钝圆形 ,在萌
发前出现分隔 ,一般 1～3隔 ;在多数的分生孢子
器中均有小分生孢子 (图 1 E) 。产小分生孢子细
胞瓶梗形 ,多 1～3隔 ,幼嫩时小分生孢子与产分
生孢子细胞之间无隔 ,成熟时产生明显的分隔 ;
小分生孢子短棒状 ,两端钝圆、无色透明、无隔
(图 1 F) 。
大、小分生孢子可独立地产生于不同的子座中 ,
也可同时产生于同一子座内的不同的分生孢子器
中 ,有时还可在同一分生孢子器内发现大小两种分
生孢子。另外 ,在同一子实体中偶尔同时观察到子
囊孢子和分生孢子。
42
第 1期 王金利等 :树木溃疡病重要病原葡萄座腔菌属、种及其无性型研究
A 子囊腔和子囊　B 子囊及子囊孢子　C分生孢子器　D 大分生孢子和
分生孢子梗　E大分生孢子 (夹杂小分生孢子 ,箭头所指 ) 　F小分生孢子 ,其中 A、C为石蜡切片 (600 ×) ;
B、D、E、F为徒手切片 (B、E、F, 1 500 ×; D, 600 ×)
图 1　所采集标本的显微特征
2. 3　 ISSR实验结果
2. 3. 1　 ISSR反应条件的确定 　通过调整反应体系
中各成分的浓度 (主要是 Mg2 + 、模板 DNA浓度 )和
PCR温度循环条件 ,使扩增效果达到最佳。据 Han2
tula等 [ 29 ] , PCR扩增需要 95 ℃预变性 10 m in,而且
需要热启动。但经本实验研究和改进 ,不进行热启
动 ,用 95 ℃预变性 5 m in同样可以达到预定效果。
经过反复调整 ,最后确定反应体系 ( 25 μL )包括 :
灭菌去离子水 14. 3 μL; 2. 5 ×buffer 2. 5 μL (终浓
度为 1 ×) ; 25 mmol·L - 1 MgCl2 3μL (终浓度 3 mmol
·L - 1 ) ; 2. 5 mmol· L - 1 dNTP ( dAPT, dTTP, dCTP和
dGTP) 2μL (终浓度为 200 mmol·L - 1 ) ; Taq DNA聚
合酶 1U (华美公司 ) ; 25 mmol·L - 1引物 2μL (终浓
度为 2 mmol·L - 1 ) ;模板 DNA1μL (约 10μg) ,阳性
对照加 1μL灭菌去离子水。扩增反应循环为 :首轮
循环 95 ℃ ×5 m in变性 ,退火 1 m in, 72 ℃ ×1 m in
延伸 ;然后执行 30个循环 : 94 ℃ ×1 m in变性 ,合适
的温度退火 1 m in (见表 3) , 72 ℃ ×1 m in延伸 ;最
后 72 ℃延伸 7 m in,反应循环结束后 , 4 ℃下保存 ,
待凝胶电泳检查结果。
2. 3. 2 ISSR扩增结果 　选用 5′DDB ( CCA ) 5、5′
(CAG) 5、5′HYH ( GTG) 5和 5′DHB (CGA) 5 4个引物 ,
扩增所有供试菌株。电泳分析后 ,经凝胶成像系统
拍照得到图谱。
表 3　 ISSR引物的合适程度
引物序列 a 退火温度 /℃ 适用程度 b
5′DDB (CCA) 5 49 + + +
5′(CAG) 5 64 + + +
5′HYH ( GTG) 5 64 + + +
5′DHB (CGA) 5 61 + + +
5′BDB (ACA) 5 49 + + +
5′BBB ( GAAA) 3 GAA 45 +
5′HYH ( GT) 7 58 + +
5′BBD (AAC) 5 45 + +
　　注 : a: B代表碱基 C, G或 T; D代表碱基 A, G或 T; H代表碱基
A, C或 T; U代表碱基 A, C或 G　b: + + +代表适用于所有菌株 ; +
+代表适用于大部分菌株 ; +代表仅适用于部分菌株
2. 3. 3　生成系统树 (见图 2) 　从图中可以看出 , Ⅰ
组的 7个菌株 ,包括美国威斯康星大学提供的菌株
9725 (无性型 F. aescu li,有性型 B. doth idea ) ,以
92%的相似性聚在一起 ; Ⅱ组的 7个菌株以 89. 5%
的相似性聚在一起 ; Ⅲ组的 9个菌株以 93. 5%的相
似性聚在一起 ; 0239和 0246分别以 83%和 78%的
相似性与 I组聚在一起 ; Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与菌株 0239、0246
又以 70%的相似性聚在一起 ,构成 B. doth idea组 ;
而 942128 (B. ribis)、97288 ( F. lu tuem )和 96229 (B.
parva)则分别独立成一个分枝 ,所有的菌株以 62%
的相似性聚在一起。从图中可得知本属的 4个种的
亲缘关系 : B. doth idea与 B. ribis的关系较近 ,与 B.
parva的关系最远 ;而且 B. doth idea与 B. ribis的关
52
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
系并不是种内关系 ,已经上升到种间关系 , B. ribis、
B. lu tea ( F. lu tuem )、B. parva同 B. doth idea的关
系均为种间关系 ,这样就进一步证明了 B. doth idea
和 B. ribis为种间关系 ,并非同物异名。菌株 0253
是从苹果轮纹病的病斑中分离而来 ,在图 2中以
96%的相似性与菌株 0234和 0104 (B. doth idea )聚
在一起 ,而苹果轮纹病的病原菌在国内近年来被认
为是 B. berengeriana[ 34～36 ] , 而 Sutton[ 7 ] 将 B. do2
th idea和 B. berengeriana看作同物异名。上述 ISSR
实验的结果支持了 Sutton的观点。
图 2　UPGMA分析 ISSR指纹所得到的葡萄座腔菌属及其相关属的系统树 (标尺的值代表相似性 )
3　结论与讨论
3. 1　结论
本实验观察到的病原菌有性型的特征 :子囊双
层壁 , 56. 8～81. 5 ×14. 8～22. 3μm,子囊孢子半透
明、薄壁、单细胞 , 20. 0～27. 5 ×7. 5～10μm。向玉
英 [ 18 ]所报道的杨树溃疡病菌 B otryoshaeria doth idea
(认为无性型是 D. gregaria )的测量值 ( 49. 0～68. 0
×11. 0～21. 3; 15. 0～17. 4 ×7～11. 0)。 Phillip s et
a l. 描述 B. doth idea (无性型为 Fusicoccum aescu li) :
子囊埋于寄主表皮下 ,子囊双囊壁 , 92～132 ×16～
24μm ,子囊孢子薄壁 ,透明 ,单细胞 , 15～28 ×6～12
μm; Pennycook & Samuels测量 B. doth idea (无性型
为 Fusicoccum aescu li)的子囊孢子为 22. 8 ×9. 3μm。
据此可以看出 ,本实验所观察到病原菌的有性型为
B otryoshpaeria doth idea。
根据本实验所观察到的无性阶段的特征 ,对比
参考文献中 B otryosphaeria doth idea的无性型的特征
(表 4和表 5) ,实验所观察的寄主组织病斑标本和
培养基上的葡萄座腔菌属的无性型特征与 Penny2
cook & Samuels, Maas & Uecker, Phillip s & Lucas报
道的 B. doth idea的无性型 Fusicoccum aescu li Corda
的特征相近。因此 ,从形态特征和分子证据 ( ISSR
系统树 )两方面均可判定 ,本实验所采集的树木溃疡
病病原菌 B. doth idea的无性型为 Fusicoccum aescu2
li。所以 ,我国的 B. doth idea无性型也应为七叶树
壳梭孢 Fusicoccum aescu li。
经过许多人的研究 ,现在 Fusicoccum 属的特征
主要有 :载孢体有不同类型 ,从单室的分生孢子器型
到复杂的多室的真子座结构 [ 10 ] ;产分生孢子细胞瓶
梗形 ,向顶层出 ,第一个分生孢子以全壁芽生方式产
生 ,分生孢子薄壁、透明、无隔、纺锤形 ,有绝对截形
的基部 [ 9 ] ,在同一位置增生导致环周加厚或向顶层
出产生环痕 , 老的产分生孢子细胞是内壁芽生
的 [ 14 ] ;分生孢子大小变化较大 (表 4)。
62
第 1期 王金利等 :树木溃疡病重要病原葡萄座腔菌属、种及其无性型研究
表 4　已报道的 B otryosphaeria doth idea的无性型特征
名称 载孢体 产孢方式和特征 分生孢子 /μm 参考文献
Fusicoccum aesculi 真子座 全壁芽生 ,瓶梗 20. 0～26. 0 ×5. 0～6. 0 Pennycook & Samuels[ 9 ]
未命名 分生孢子器 全壁芽生 ,瓶梗 (16. 5～) 18. 4 (～20) ×(6. 3～) 6. 9 (～8) Maas & Uecker [ 8 ]
未命名 真子座 全壁芽生 ,瓶梗 15. 0～22. 5 ×4. 5～7. 5 Phillip s & Lucas[ 12 ]
F. aesculi 分生孢子器或真子座初为全壁芽生后为内壁芽生 ,环痕 18. 0～25. 0 (～30) ×4. 0～4. 5 (～5. 0) Crous & Palm [ 13 ]
D othiorella gregaria 分生孢子器 19. 4～29. 1 ×5. 0～7. 0 向玉英 [ 18 ]
E. aeseuli 分生孢子器到真子座 全壁芽生 ,后内壁芽生 ,瓶梗 (大小见表 5) 本研究结果
表 5　采自中国树木溃疡病标本分生孢子的测量值
标本号 来源 分生孢子类型 分生孢子大小 (长 ×宽 ) /μm 长宽比 (L /D)
0213 北京杨 大 (14. 5～) 20. 5 (～26. 0) ×(4. 0～) 7. 0 (～8. 0) (2. 1～) 3. 1 (～5. 1)
0221 北京杨 小 (1. 9～) 3. 0 (～4. 6) ×(0. 8～) 1. 0 (～1. 2) (1. 8～) 3. 0 (～5. 0)
0233～0235 柳树 大 (20. 0～) 24. 7 (～32. 5) ×(6. 0～) 7. 6 (～10. 0) (2. 2～) 3. 3 (～5. 0)
小 (3. 0～) 4. 1 (～5. 0) ×(1. 8～) 2. 2 (～2. 5) (1. 7～) 1. 9 (～2. 0)
0240 欧美杨 小 (1. 8～) 2. 9 (～4. 1) ×(0. 7～) 1. 0 (～1. 3) (1. 8～) 2. 9 (～4. 4)
0241 北京杨 大 (19. 0～) 21. 6 (～25. 0) ×(5. 5～) 7. 0 (～7. 5) (2. 7～) 2. 9 (～4. 4)
小 (2. 2～) 3. 4 (～4. 8) ×(0. 9～) 1. 2 (～1. 5) (1. 8～) 2. 9 (～4. 8)
0243 核桃 大 (19. 6～) 23. 5 (～31. 0) ×(4. 0～) 6. 2 (～7. 9) (2. 9～) 3. 8 (～5. 7)
0246 杨树 大 (11. 9～) 21. 5 (～28. 9) ×(4. 9～) 7. 0 (～10. 0) (2. 7～) 3. 1 (～4. 4)
0250 槐树 小 (3. 0～) 4. 0 (～5. 8) ×(0. 9～) 1. 1 (～1. 5) (2. 5～) 3. 0 (～3. 7)
0252 核桃 大 (17. 3～) 22. 5 (～29. 1) ×(4. 2～) 6. 4 (～8. 0) (2. 2～) 3. 6 (～55)
此外 ,虽然本实验没有分离到 B. ribis,但通过
国内的 B. doth idea和国外已发表的 B. ribis的特
征 [ 37 ]对照 ,发现二者确实不同 : B. ribis的分生孢子
宽度大于 8. 0μm, L /D值的平均值小于 2. 6[ 38 ] ;而
本实验测量的 B. doth idea的分生孢子宽度在 6. 2～
7. 6μm之间 , L /D值的平均值在 2. 9～3. 6之间 ;从
ISSR的结果也可以进一步证明二者属于不同的种。
所以 B otryoshpaeria doth idea和 B otryoshpaeria ribis是
两个不同的种 ,而不是同物异名。
3. 2　讨论
我国幅员辽阔 ,树种资源丰富 ,气候差异较大 ,
葡萄座腔菌属的种类应该相对比较丰富 ,本实验分
离的 53个菌株都是葡萄座腔菌 (B. doth idea) ,需进
一步扩大标本采集范围 ,确定我国是否有 B. ribis以
及更全面地掌握我国葡萄座腔菌属病原菌种类和分
布情况。
大分生孢子的特征在葡萄座腔菌属及相关属的
分类中倍受关注 ,而小孢子的特征没有被充分利用。
一些作者在观察标本时曾发现小分生孢子 [ 9～12 ] ,但
都未用于本属真菌的分类 ; Rayachhetry et a l. [ 11 ]报
道小分生孢子不萌发 ,与本实验结果一致 , Phillip s et
a l. [ 12 ]报道 B otryosphaeria popu li除了有大分生孢子
外 ,还有一种 4～5. 5 ×2μm的小分生孢子 ,被认为
是精子 ,但没有说明是否能萌发 ; Sandra Denman et
a l. [ 39 ]报道 Fusicoccum proteae中除了有 (20～) 22～
25 (～30) ×(4. 5～) 5～6μm的大分生孢子 ,有褐
色、厚壁、无隔、多疣和滴状斑点 ,近圆柱形或窄椭圆
形的 (7～) 8～11 (～14) ×2. 5～3. 5μm的小分生
孢子以外 ,还有一种大小 5～7 ×1. 5～2μm,透明、
光滑、无隔、棒状 ,有圆形末端的孢子 ,被认为是精
子。鉴于对小分生孢子的了解较少 ,小分生孢子的
形成过程及其在生活史中的作用还有待于进一步
研究。
苹果轮纹病的病原是 B. berengeriana de Not. f.
sp. piricola (Nose) Koganezawa et Sakuma,被认为是
苹果干腐病原 B. berengeriana de Not的专化型 ,二
者的中文学名经中国科学院微生物研究所郑儒永教
授拟名 ,干腐病原 B. berengeriana称贝伦格葡萄座
腔菌 ,轮纹病原 B. berengeriana f. sp. piricola称贝伦
格葡萄座腔菌梨生专化型 [ 35 ]。本实验中所分离的
来自苹果轮纹病的菌株 0253经 ISSR 分析 ,和 B.
doth idea紧密地聚在一起 ,说明二者应属于同一个
种。但由于本实验只分离了一个苹果轮纹病的菌
株 ,代表性不强 ,需要在以后的实验中进一步验证。
此外 ,作者已经得到国内葡萄座腔菌的无性型
为 Fusicoccum aescu li的 ITS序列证据 ,正在整理 ,待
发表中。
72
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
参考文献 :
[ 1 ] 张星耀 ,骆有庆. 中国森林重大生物灾害 [M ]. 北京 :中国林业出
版社 , 2003: 93～110
[ 2 ] Cesati V, De Notaris E G. Schema di classificazione degli sferiacei
italici aschigeri p iu o meno apparlenential genere Sphaeria nell antico
significato attribuitoglida Person. Commentario della Societa Crittoga2
mologica[M ]. Italiana, 1863, 1: 177～240
[ 3 ] Saccardo P A. Conspectus generum fungorum italiae inferiorum
nempe ad Sphaeropsideas, M elanconieas et Hyphom yceteas pertinen ti2
um , systemate sporologico dispositu[ J ]. M ichelia, 1880, 2: 1～38
[4 ] Corda A C I. Sturm’s Deutschlands Flora[M ], 1829, 3: 105～136
[5 ] Petrak F, Beitr¾ge zur Kenntnis der Pilzfora der südlichen Alpenl¾nder
und Norditaliens [J ]. AnnlsMycol, 1922, 20: 126～159
[6 ] Shear C L, Stevens N E, W ilcox M S. B otryosphaeria and Physalospora
on currant and app le [J ]. J Agriculture Research, 1924, 28: 589～598
[ 7 ] Sutton B C. Coelomycetes[M ]. Commonweaith Mycological Institu2
te, Surrey, 1980
[ 8 ] Maas J L, Uecker F A. B otryosphaeria dothidea cane canker of thorn2
less blackberry[ J ]. Plant D isease, 1984, 68: 720～726
[ 9 ] Pennycook S R, Samuels G J. B otryosphaeria and Fusicoccum spe2
cies associated with ripe fruit rot of A ctin idia deliciosa, kiwifruit in
New Zealand[ J ]. Mycotaxon, 1985, 24: 445～458
[ 10 ] Morgan J G,W hite J F. Notes on Coelomycetes II. Concerning the
Fusicoccum anamorph of B otryosphaeria ribis [ J ]. Mycotaxon,
1987, 30: 117～125
[ 11 ] RayachhetryM B, George M B, Roger S W , et al. Characteristics
of the Fusicoccum anamorph of B otryoshaeria ribis, a potential bio2
logical control agent for M elaleuca quinquenervia in South Florida
[ J ]. Mycologia. 1996, 88 (2) : 239～248
[ 12 ] Phillip s A J L, Lucas M T. The taxonom ic status of M acrophom a
flaccida andM acrophom a reniform is and their relationship to B otryo2
sphaeria doth idea [ J ]. Sydowia, 1997, 49 (2) : 150～159
[ 13 ] Crous P W , Palm M E. Reassessment of the anamorph genera B ot2
ryodiplodia, D othiorella and Fusicoccum [ J ]. Sydowia, 1999, 51
(2) : 167～175
[ 14 ] A insworth G. C. A insworth & B isby’sD ictionary of the Fungi (6 th
ed) [ M ]. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey,
England, 1961
[ 15 ] 王金利 ,秦国夫 ,贺 　伟 ,等. 葡萄座腔菌及其相关真菌的系统
学研究进展 [ J ]. 中国森林病虫 , 2003, 22 (3) : 32～36
[ 16 ] 向玉英. 杨树溃疡病 [A ]. 见 :中国林业科学研究院. 中国森林
病害 [M ]. 北京 :中国林业出版社 , 1984: 79～80
[ 17 ] 向玉英 ,花晓梅 ,赵经周 ,等. 杨树水泡型溃疡病的发生及病原
菌生物学特性的研究 [ J ]. 植物病理学报 , 1981, 11 (4) : 27～34
[ 18 ] 向玉英 ,花晓梅 ,赵经周. 杨树水泡型溃疡病病原菌鉴定 [ J ]. 微
生物学报 , 1979, 19 (1) : 57～63
[ 19 ] 周仲铭. 杨树溃疡病 [ A ]. 见 :袁嗣令. 中国乔、灌木病害 [M ].
北京 :科学出版社 , 1997: 2～95
[ 20 ] 李传道. 树木的溃疡病 [ J ]. 南京林产工业学院学报 , 1979 ( 1) :
22～35
[ 21 ] 陈祥照. 桃树流胶病的研究Ⅰ病原特性及发病规律 [ J ]. 植物病
理学报 , 1985, 15 (1) : 53～57
[22 ]张星耀.森林生物灾害控制的新世纪策略及其实施基础 [A ].见 :中
国林业科学院.面向 21世纪的林业———可持续发展全球战略下的
林业科学技术 [M ].北京 :中国林业科技出版社 , 1998: 341～345
[ 23 ] 唐明 ,陈辉 ,商鸿生. VA菌根真菌提高杨树抗溃疡病机制的研
究 [ J ]. 林业科学 , 2000, 36 (2) : 87～92
[ 24 ] 张星耀 ,赵士光 ,朴春根 ,等. 树木溃疡病原真菌类群分子遗传
多样性研究 I———小穴壳属、疡壳孢属、壳囊孢属、盾壳霉属分
类地位的分子证明 [ J ]. 林业科学 , 1999, 35 (3) : 34～40
[ 25 ] 张星耀 ,赵士光 ,吕全 ,等. 树木溃疡病原真菌类群分子遗传多
样性研究 II———B otryosphaeria属 28S rDNA2PCR2RFLP和 RAPD
解析 [ J ]. 林业科学 , 2000, 36 (2) : 75～81
[ 26 ] 王金利 ,贺伟 ,关玲. ISSR技术在菌物研究中的应用 [ A ]. 见 :
中国林学会. 首届中国林业学术大会论文集 [ C ]. 北京 :当代中
国出版社 , 2006: 45～48
[ 27 ] 方中达. 植病研究方法 [M ]. 北京 :农业出版社 , 1979
[ 28 ] Yao Y J, Pegler D N, Chase M W. App lication of ITS ( nrDNA )
sequences in the phylogenetic study of Tyrom yces sp. [ J ]. Mycolog2
ical Research, 1999, 103: 219～229
[ 29 ] Hantula J, MüllerM M. Variation within Gremm eniella abietina in Fin2
land and other countries as determined by Random AmplifiedMicrosat2
ellites (RAMS) [J ]. Mycological Reseach, 1997, 101 (2) : 169～175
[ 30 ] Zhou Shiguo, Sm ith D R, Stanosz G R, et al. D ifferentiation of B ot2
ryosphaeria species and related anamorphic fungi using Inter simp le
or short sequence repeat ( ISSR ) fingerp rinting [ J ]. Mycological
Research, 2001, 105 (8) : 919～926
[ 31 ] M ichaelM Müller, Jarkko Hantula. D iversity of Tiarosporella parca
in Finland, Norway and Switzerland [ J ]. Mycological Research,
1998, 102 (10) : 1 163～1 168
[ 32 ] Burgess T,W ingfieldM J, W ingfield B W. Simp le sequence repeats
markers distinguish among morphotypes of Sphaeropsis sapinea [ J ].
App lied and Environmental M icrobiology, 2001, 67 (1) : 354～362
[ 33 ] Hantula J, Maarit E, Kaitera J, et al. Genetic variation of the resin
top fungus in Finland as determ ined by Random Amp lified M icrosa2
tellites(RAMS) [ J ]. Eur J Path, 1998, 28: 361～372
[ 34 ] 陈策. 苹果果实轮纹病研究进展 [ J ]. 植物病理学报 , 1999, 29
(3) : 193～198
[ 35 ] 李美娜 ,王金友 ,周宗山 ,等. 苹果轮纹烂果病菌的侵染时期及
影响因素 [ J ]. 中国果树 , 2001, 5: 8～12
[36 ]赵白鸽 ,孔建 ,王文夕 ,等.枯草芽孢杆菌 B2903对苹果轮纹菌的抑菌
作用及其对病害的控制效果 [J ].植物病理学报 , 1997, 3: 213～214
[ 37 ] Grossenbacher J G. , Duggar B M. A contribution to the life history,
parasitism, and biology of B otryosphaeria ribis[ J ]. New York: Agri2
culture Experiment Station Technical Bulletin, 1911, 18: 114～188
[ 38 ] Sm ith D R, Stanosz G R. Molecular and morphological differentia2
tion of B otryosphaeria doth idea ( anamorph Fusicoccum aesculi) from
some other fungi with Fusicoccum anamorphs[ J ]. Mycologia, 2001,
93 (3) : 505～515
[ 39 ] Sandra Denman, Pedro W C. A taxonom ic reassessment of Phylla2
chora proteae, a leaf pathogen of P roteaceae [ J ]. Mycologia, 1999,
91 (3) : 510～516
82