全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 6) : 850 855
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 06-0850-06
运用 AFLP 技术分析筇竹种群遗传多样性
茹广欣1 , 袁金玲2, 张 朵1, 2, 郭广平2
( 1. 河南农业大学林学院林学系 , 河南 郑州 450002; 2. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 , 浙江 富阳 311400)
摘要: 利用 AFLP分子标记技术对筇竹 2 个种群的遗传多样性进行了分析, 筛选出 10 对多态性和清晰度较高的引物
组合, 共获得 680 个 AFLP 位点, 其中多态性位点 662 个, 平均多态性检出率为 97. 20% , 并用 PopGen32 软件对 AFLP
多态性数据进行分析, 结果表明, 供试 2 个筇竹种群均具有丰富的遗传多样性, 多态位点百分率分别为 89. 86% 和
91. 95% , 等位基因数分别为 1. 898 6 和 1. 919 5, 有效等位基因数分别为 1. 585 0 和 1. 568 3, 种群内遗传多样性为
0.332 1, 种群水平平均 Nei’s 遗传多样性为 0. 394 9, Shannon 信息指数为 0. 575 4, 基因流为 2. 900 9, 遗传一致度为
0.821 9, 遗传距离平均值为 0.196 1。并根据遗传距离进行了 UPGMA 聚类分析。
关键词: 筇竹; 遗传多样性; AFLP
中图分类号: S795. 9 文献标识码: A
收稿日期 : 2010-05-16
基金项目 : 中国林科院亚热带林业研究所基本科研业务费项目 ( 6807 ) ; “十一五”林业科技支撑计划专题 ( 2006BAD19B0202 ) ; 国家林
业局重点项目 ( 2006-64)
作者简介 : 茹广欣 ( 1963— ) , 男 , 河南洛阳人 , 博士生导师 .
Analysis of Populations Genetic Diversity of Qiongzhuea tumidinoda
Using AFLP Markers
RU Guang-xin1 , YUAN Jin-ling2 , ZHANG Duo1, 2, GUO Guang-ping2
( 1 . College of Forestry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China ;
2. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, Zhejiang, China)
Abstract: Amplified fragment length polymorphism( AFLP) was used to analyze the genetic diversity of 2 diferent popula-
tions of Qiongzhuea tumidnoda. Ten primer pairs with higher polymorphic were selected from EcoRI/MseI primers, Total of
680 loci of the Qiongzhuea tumidnoda genome were examined for molecular variation and 662 loci were polymorphic
( 97. 20% ) . PopGen32 data processing software gave out that the rate of polymorphism were 89. 86% and 91. 95% ; the
number of alleles were 1. 898 6 and 1. 919 5; the effective number of alleles were 1. 585 0 and 1. 568 3; the average genet-
ic identities within 6 populations was 0. 332 1; the average genetic identities within the 2 populations was 0. 394 9; Shan-
non information index was 0. 575 4. The genetic differentiation coefficient among the 2 populations was 0. 148 8. The gene
flow among the 2 populations was 2. 861 0. The average genetic identity was 0. 821 9 and the average genetic distance was
0. 196 1. The 2 populations were divided according to the UPGMA cluster analysis.
Key words: Qiongzhuea tumidnoda; genetic diversity; AFLP
筇竹( Qiongzhuea tumidnoda Hsueh et Yi) 是我
国特有的禾本科竹亚科植物, 为国务院公布的第 1
批《中国珍稀濒危保护植物目录》中仅列入的 2 个二
类保护竹种之一 [ 1] 。其天然分布于我国金沙江下游
的云南省昭通地区 l1 个县 ( 市 ) 和四川省雷波、叙
永、筠连、马边等县海拔 1 800 2 300 m 的高山山
区, 呈纯林生长或与阔叶林混生, 总面积约 23 000
hm
2
, 对我国西南高海拔地区的水土保持、生态环境
维护具有重要的作用 [ 2 - 4 ] 。由于长期掠夺式的采笋
伐竹, 导致筇竹种群退化。目前有关筇竹的研究较
第 6 期 茹广欣等: 运用 AFLP技术分析筇竹种群遗传多样性
少, 主要集中在生长规律、开花结实特性、竹笋成分
以及引种育苗等方面, 对于筇竹属内遗传多样性的
研究未见报道, 这对该竹种的保护和利用造成了很
大的困难。AFLP 标记是一种 DNA 指纹分析技术,
在树木的数量性状定位、种质资源鉴定、遗传连锁图
谱构建、种群遗传结构及多样性研究、演化和亲缘关
系研究等方面有着广泛的应用 [ 5] 。目前国内外关于
竹类植物 AFLP方面研究报道多集中在竹类植物属
间关系及系统分类方面, Loh 等 [ 6 ] 运用 AFLP技术,
对竹亚 科 中箣 竹属 ( Bambusa Schreb. ) 、麻 竹属
( Dendrocalamus Nees) 、巨竹属 ( Gigantochloa Kurz)
和条竹属 ( Thyrsostachys Gamble) 的 15 个竹种进行
了 AFLP分析, 并根据 AFLP 产生的特异性条带得到
了不同竹种之间的亲缘关系; Marulanda 等 [ 7] 利用
AFLP 技术分析了美国大型用材竹瓜多竹 ( Guadua
angustifolia Stkiata) 及其近缘属的遗传多样性, 发现
瓜多竹属( Guadua Kunth) 存在明显的遗传分化, 扩
增出的条带表现为多态性, 近缘属中也存在较高的
遗传多样性; 胖铁良等 [ 8] 利用 AFLP 分子标记对竹
类植物 6 个不同属的 35 个品种进行亲缘关系的分
析, 依据 AFLP 标记的聚类结果: 以遗传距离 0. 403
为分类界限, 35 个供试品种大致可以聚为两类。对
于筇竹属内遗传多样性的研究还是空白, 本文利用
AFLP 分子标记对珍稀保护竹种筇竹种群遗传结构
进行研究, 分析该物种珍稀或濒危的原因和进化潜
力, 为建立和保护筇竹核心种质资源提供可靠的依
据和对策。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
实验用材料采自浙江省富阳市中国林科院亚热
带林业研究所试验苗圃两年生实生筇竹苗, 竹苗用
云南省绥江县和四川省叙永县采取的两个种源的筇
竹种子培育得到 [ 4] 。云南绥江县位于 103°47′E,
28°21′N, 四川叙永位于 105°16′E, 27°55′N, 试验
苗圃地处 119°56′E, 30°05′N, 海拔 50 m。属中亚
热带东部季风气候区, 年降水量 1 300 1 500 mm,
最热月平均气温 28. 7 ℃, 最冷月平均气温 3. 6 ℃ ,
年均气温 16. 1 ℃ , 年均无霜期 230 天, 年平均相对
湿度 79% , 土壤为花岗岩发育的砂质山地黄壤。每
个种群随机采取 32 单株, 采取当年生新鲜叶片提取
DNA 备用。
1. 2 DNA 提取和检测
参照 Doyle 等经典的 CTAB 法 [ 9] 略加改变来提
取基因组 DNA 并进行纯化。具体方法: 取适量的筇
竹嫩叶叶片于研钵中, 加入适量 PVP、液氮研磨成粉
状, 转入 1. 5 mL 离心管中, 加入 0. 6 mL 65 ℃预热
的 CTAB 提取缓冲液( 0. 1 mol·L - 1 Tris, 0. 05 mol·
L
- 1
EDTA, 1. 5 mol·L - 1 NaCl, 2% CTAB) , 放入 65
℃水浴中加热 30 min, 期间不时晃动摇匀; 加入等体
积的氯仿∶异戊醇( 24∶1) 混合液, 混匀, 室温放置几
分钟; 4℃ 10 000 r·min - 1离心 10 min, 取上清液转
入新的 1. 5 mL 的离心管中; 加入 2 倍体积的冰冷的
无水乙醇, 混匀, 冷藏 2 h 或者过夜; 然后 4℃ 10 000
r·min - 1离心 10 min, 弃上清, 收集沉淀, 用 75% 乙
醇清洗 2 次, 沉淀自然风干后溶于 100 μL 1 ×TE
中; 加入 1 /2 体积的 1∶1 的酚仿, 混匀 2 3 min, 静
置 2 3 min 后再混匀, 8 000 10 000 r·min - 1离
心 5 10 min, 取上清, 加入氯仿, 8 000 10 000 r
·min - 1离心 5 min; 取上清, 加入二倍体积的预冷的
无水乙醇, 弃上清, 收集沉淀, 用 75% 乙醇清洗 2 次,
沉淀自然风干后溶于 1 ×TE 中, - 20 ℃保存备用。
通过测定紫外光吸收值来确定 DNA 浓度和纯度, 利
用 0. 8% 琼脂糖凝胶电泳检查 DNA 完整性。
1.3 AFLP 分析
1. 3. 1 酶切与连接 AFLP 实验过程参考胖铁良 [ 8 ]
等的方法略作修改, 酶切体系为: 600 ng DNA, 10U
EcoR I, 10U Mse I, 2 μL 10 ×T4 DNA 连接酶缓冲
液, ddH2 O 补充至 20 μL。在 37℃ 3 h, 65℃ 10 min
的条件下进行双酶切, 然后取 10 μL 酶切溶液, 加入
10 μL连接混合液: 1 μL 10 ×T4 DNA 连接酶缓冲
液, 20 μmol·L-1 Mse I 接头和 EcoR I 接头各 1. 25
μL, 3U T4-DNA 连接酶 0. 5 μL, ddH2 O 补充至 10
μL。在 PCR 上 16 ℃ 连接 10 h。
1. 3. 2 预扩增 预扩增时取连接产物 5 μL, E00
和 M00( 20 U·μL - 1 ) 各 0. 6 μL, 10 ×PCR buffer 2
μL, 2. 5 mmol·L - 1 dNTPs 2 μL, 5U Taq 酶 0. 2 μL,
用 ddH2O 补到 20 μL。预扩增 PCR 反应程序: 94 ℃
变性 2 min, 94 ℃ 变性 50 s, 55 ℃ 退火 50 s, 72 ℃
延伸 60 s, 共 30 个循环; 10 ℃ 保温。
1. 3. 3 选择性扩增与引物筛选 参考其他竹类
AFLP 分析的文献 [ 6 - 8、10 - 11 ] 中的引物组合选取部分
引物, 通过预备试验, 筛选出扩增产物稳定、重复性
好、多态性高且分辨能力强的引物对, 对所有供试个
体的基因组 DNA 预扩产物进行选择性扩增。取 3
μL 稀释 15 倍后的预扩增产物, 20 U·μL - 1 EcoR I
和 Mse I 选扩引物各 0. 6 μL, 10 ×PCR buffer 2 μL,
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林 业 科 学 研 究 第 23 卷
2. 5 mmol·L - 1 dNTPs 2 μL, 5U Taq 酶 0. 2 μL , 用
ddH2 O 补到 20 μL 进行选择性扩增。选择性扩增
PCR 程序: 94 ℃ 变性 30 s, 65 56 ℃( 每次循环降
低 0. 7 ℃) 退火 30 s, 72 ℃ 延伸 60 s, 共 13 个循环;
然后 94 ℃ 变性 30 s, 56 ℃ 退火 30 s, 72 ℃延伸 60
s, 共 20 个循环, 10 ℃保温。所有 PCR 反应均在
ABI-2720 型 PCR 扩增仪上进行。
所用 EcoR I 酶以及所用接头、引物购自上海英骏
生物工程技术服务有限公司, Mse I 酶、T4 DNA Ligase
酶购自 Promega公司。接头和引物序列详见表 1。
表 1 扩增引物名称与序列
EcoR 引物 引物序列 Mse 引物 引物序列
adaptor E1 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ adaptor M1 5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’
adaptor E2 3’-CTGACGCATGGTTAA-5 adaptor M2 3’-TACTCAGGACTCAT-5’
E-AAC 5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’ M-CAA 5’-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3’
E-ACA 5’-GACTGCGTACCAATTCACA-3’ M-CAC 5’-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3’
E-ACG 5’-GACTGCGTACCAATTCACG-3’ M-CAG 5’-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3’
E-CTA 5’-GACTGCGTACCAATTCCTA-3’ M-CAT 5’-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3’
M-GCG 5’-GATGAGTCCTGAGTAAGCG-3’
1. 3. 4 聚丙烯酰胺电泳 选择性扩增产物用 6%
变性聚丙烯酰胺胶 ( 厚度 0. 4 mm) 和 1 ×TBE 电泳
缓冲液电泳分离。电泳仪为 JY-ECP3000, 电泳槽为
JY-CX2B 型垂直电泳槽, 电泳仪和电泳槽均购自北
京君意东方电泳设备有限公司。预电泳 30 min 后
上样, 90 W 恒功率电泳约 2 h 后银染检测。
1. 4 数据分析
对扩增产物的电泳结果采用“1- 0”系统记录谱
带, 观察电泳图谱中同一位置上 DNA 带的有无, 有
带记为“1”, 无带记为“0”, 将统计结果输入计算机。
应用 POPGENE32 Version 1. 32 [ 12 - 13 ] 计算以下遗传
多样性各参数: 多态带数 ( AP) 、多态位点百分率
( P) 、Nei’s 基因多样性指数( H) 、Shannon 信息指数
( I) 、遗传分化系数 ( Gst) 和基因流 ( Nm) 、Nei’s 遗
传距离( D) 和遗传一致度( I) 等, 根据 Nei’s 遗传距
离, 利用 NTSYS-pc 2. 1 软件对种群进行 UPGMA 分
析 [ 14] , 生成聚类图。
2 结果与分析
2.1 AFLP 扩增片段的多态性
从所有引物组合中筛选出扩增产物稳定、重复
性好、多态性高且分辨能力强的 10 对引物组合 ( 表
2) 对筇竹 2 个种群的个体进行扩增, 共检测到大小
在 100 800bp 之间的 680 条 DNA 片段, 其中多态
性片段 662 条, 每个引物组合平均检测到多态性片
段 66. 2 条, 平均多态性比率为 97. 20% , 表明 10 对
引物组合具有较强的检测筇竹种群内及种群间遗传
变异的能力, 与李潞滨等 [ 1 2] 结论一致。筛选出的引
物组合扩增出条带的多态性比率均超过 90% , 其中
E-ACA/M-CAA 检测到的条带最多, 但是多态性却
不是最高的; E-AAC/M-CAC 检测到的条带多态性
最高, 多态性比率为 100% ( 图 1) 。
表 2 不同引物组合在筇竹种群中的多态位点比率
引物组合 多态带 ( AP) 总带数 多态性比率 / %
E-ACA /M-CAT 52 56 92. 86
E-ACA /M-CAA 87 88 98. 86
E-AAC /M-CAT 61 62 98. 39
E-ACG/M-CAC 54 55 98. 18
E-ACA /M-CAC 63 66 95. 45
E-ACA /M-CAG 51 53 96. 23
E-ACG/M-CAT 66 67 98. 51
E-ACG/M-CAG 80 83 96. 39
E-AAC /M-CAC 80 80 100. 00
E-ACG/M-CAA 68 70 97. 14
( 平均值 ) 66 . 2 68 97. 20
图 1 绥江样品的 AFLP 扩增谱带
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第 6 期 茹广欣等: 运用 AFLP技术分析筇竹种群遗传多样性
2. 2 筇竹的遗传多样性
多态位点百分率、Nei?s 基因多样性指数、Shan-
non 信息指数是度量遗传多样性水平的常用指标。
从表 3 可以看出 , 10 对引物组合对叙永的材料扩
增出的条带多态性大于绥江材料的条带多态性、两
个种群的基因多样性分别为 0. 333 7 和 0. 331 8、
Shannon 信息指数分别为 0. 492 2 和 0. 494 3。叙
永种群的材料扩增出的条带百分率和 Shannon 信
息指数均比绥江种群的条带百分率和 Shannon 信
息指数大 , 但是叙永种源扩增出的有效基因位点比
绥江种源小 , Nei?s 基因多样性指 数也比绥 江种
群小。
表 3 筇竹种群遗传多样性
种群 样本大小 多态带 ( AP) 多态带百分率 ( P) / % na ne H I
绥江 32 612 89 . 86 1. 898 6 1. 585 0 0. 333 7 0 . 492 2
叙永 32 625 91 . 95 1. 919 5 1. 568 3 0. 331 8 0 . 494 3
种群间 32 618. 5 90 . 91 1. 909 1 1. 576 7 0. 332 7 0 . 493 2
种水平 64 662 97 . 20 1. 972 0 1. 704 5 0. 394 9 0 . 574 5
注 : na =观测等位基因数 ; ne = 有效等位基因数 [ Kimura and Crow ( 1964) ] ; H = Nei?s 基因多样性指数 ; I = Shannon?s 指数。
2. 3 筇竹种群遗传分化
筇竹种群总的遗传多样性指数( Ht) 为 0. 394 9,
种群间的遗传多样性( Dst ) 为 0. 062 2, 种群内遗传
多样性( Hs) 为 0. 332 7, 表明筇竹种群内遗传多样
性大于种群间遗传多样性; 也说明筇竹遗传分化主
要存在于种群内部。种群分化系数 ( Gst) 为 0. 157
2, 并根据 Nm= ( 1 - Gst ) /4Gst, 得出筇竹种群水平
上的基因流( Nm) 为 2. 900 9。
表 4 筇竹种群遗传分化
项目 Ht( 总体遗传多样性 ) Hs( 种群内遗传多样性 ) Dst( 种群间遗传多样性 ) Gst( 分化率 ) Nm( 基因流 )
平均值 0. 394 9 0. 332 7 0. 062 2 0. 157 1 2. 900 9
标准差 0. 013 2 0. 014 4
2. 4 筇竹种群关系与聚类分析
遗传距离和遗传一致度作为进一步评价筇竹种
群之间的遗传分化程度的依据。本实验利用 POP-
GEN32 软件计算了 Nei?s 遗传距离 ( D) 为 0. 196 1、
遗传一致度( I) 为 0. 821 9, Nei?s 相似系数是用来比
较种群或个体间相似程度的度量参数, 平均相似系
数越高, 说明相似程度越大, 遗传背景一致性越
强 [ 15] , 说明筇竹两个种群间遗传分化程度很小, 具
有高度的遗传一致性。
根据 Nei?s 遗传距离, 采用 UPGMA 法对筇竹
种群进行聚类分析结果如图 2 所示。由聚类图看
出绥江种源遗传一致性比叙永种源遗传一致性高。
绥江种源中的 3 号材料、叙永种源中 41、47 号材料
与该种源中其它材料遗传距离较远 , 但绥江种源的
遗传相似度明显高于叙永种源; 而在这 3 个材料之
外, 绥江种源和叙永种源的遗传距离在 0. 57 处, 明
显聚为两个种群, 也说明了两个种群间存在一定的
遗传差异; 并且聚类结果与计算的遗传多样性结果
一致。
3 结论与讨论
一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力既
取决于种内遗传变异的大小, 也有赖于种群的遗传
结构 [ 1 6] 。本研究结果表明, 10 对 AFLP 引物组合对
筇竹供试材料扩增出多态性位点 662 个, 每对引物
平均多态性位点 66. 2 个, 而且每对引物扩增出多态
性条带的比率均在 90% 以上, 平均多态性条带比率
为 97. 20% , 说明供试的筇竹材料的基因多样性较
高。胖铁良等 [ 8 ] 利用 10 对 AFLP 引物组合对 35 个
竹子品种扩增出 872 个位点, 多态性位点比率为
95. 87% ; 李潞滨等 [ 1 0] 利用 10 对 AFLP 引物组合对
26 个竹子品种共扩增出 733 个多态性位点, 多态位
点比率为 87. 45% 。与他们的研究结果相比, 本实
验所选用的引物组合总扩增条带相对少一些, 但是
多态性位点的比率较高。
利用 AFLP分子标记技术对筇竹种群的遗传多
样性和遗传分化进行了分析, 筇竹遗传多样性的实
验结果为: 种 群水平 的平均 多态位 点百 分率为
97. 20% , 种 群 间 的 平 均 多 态 位 点 百 分 率 为
90. 91% ; 种群间和种群水平的 Nei?s 基因多样性指
数( Hs) 和 Shannon 信息指数( I) 值均表明, 筇竹种群
水平和种群间都有较高的遗传多样性, 但是种群水
平遗传多样性要高于种群间的遗传多样性; 种群分
化系数是种群间的遗传变异与总遗传变异的比值,
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注 : 1 32 为绥江种源 , 33 64 为叙永种源
图 2 筇竹种群 Nei?s 遗传距离的 UPGMA 聚类图
是判断遗传变异的主要来源。筇竹种群间的遗传多
样性 ( Dst) 为 0. 062 2, 种 群 分 化 系 数 ( Gst) 为
0. 157 2, 这说明由于地理隔离, 筇竹种群间存在一
定的遗传分化, 而且筇竹种群内的变异明显大于种
群间, 即遗传多样性主要存在于种群内。本研究所
得的筇竹种群总的遗传多样性 ( H = 0. 394 9 , I =
0. 574 9) 高于毛竹 ( Phyllosachys edulis H. de Le-
haie) 天然种群的遗传多样性 ( H = 0. 157 8, I =
0. 241 8)
[ 17] 、巨龙竹 ( Dendrocalamus sinicus Chia er
J. L. Sun) 种下变异类型的遗传多样性( H = 0. 329 3,
I = 0. 487 8) [ 18 ] 。Zawko 等 [ 19 ] 认为, 濒危或者分布
狭窄的物种存在较高水平的多样性, 可能与该种的
进化历史有关。筇竹表现出丰富的遗传多样性可能
是因为在进化过程中保留了广泛的遗传基础, 也可
能是由于在后期的自然选择过程中产生了丰富的遗
传变异。
基因流是影响种群内部和种群间遗传变异程度
的重要因素 [ 20 ] 。还是影响植物种群的遗传组成和
遗传结构的重要因子, 基因流的大小同样可以反映
种群遗传结构的大小, 一般来说, 大的基因流能够阻
止种群间的遗传分化, 因此基因流大的物种, 种群间
的遗传分化就小, 而基因流小的物种, 种群间的遗传
分化就大。Wright[ 21 ] 认为, 当 Nm > 1 时, 说明种群
间存在一定的基因流动。而本实验数据分析结果表
明筇竹种群水平上的基因流( Nm) 为 2. 900 9 >1, 说
明筇竹种群间存在基因流动, 种群间的遗传分化较
小, 这与实验所得种群间和中群内的遗传多样性以
及遗传分化系数分析结果相一致。而本实验所用筇
竹材料为筇竹天然林开花结实的实生苗, 表明筇竹
存在自然的有性繁殖现象; 又因其多分布在高山山
区, 花粉可借助风力远距离传播, 造成筇竹种群间有
一定的基因交流, 这也是造成筇竹种群间遗传分化
小于种群内的一个重要原因。
根据 Nei?s 遗传距离聚类分析可以看出, 两个种
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第 6 期 茹广欣等: 运用 AFLP技术分析筇竹种群遗传多样性
群中供试材料从总体上看能够清楚的聚类区别, 但
是绥江种群的 3 号材料聚类结果和叙永种群的遗传
关系更近, 可能是人为在播种或者收集实验材料时
的错误, 也可能是两个种源间的基因流动或两个种
源有着共同的遗传起源造成。但总的来说, 种群间
的遗传差异不大。
根据本研究对筇竹两个种群的遗传多样性的分
析, 表明筇竹种群内有较高的遗传多样性, 有利于保
存筇竹种质资源。对于保护筇竹来说, 由于筇竹不
同种群间出现了一定程度的遗传分化, 建议在迁地
保护和取样时, 不仅要在每个种群中取足够多的个
体, 而且要在尽可能多的种群中取样, 最大限度地保
护筇竹的遗传多样性, 为今后进一步研究筇竹的系
统演化奠定基础。
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