全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林业科学研究　2006, 19 (4) : 509～512
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2006) 0420509204
红花石蒜 ISSR2PCR反应体系的建立
杨志玲 1 , 冯刚利 1 2 , 谭梓峰 1 , 栾启福 1 , 王承南 2
(1. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳　311400; 2. 中南林学院资源与环境学院 ,湖南 长沙　410004)
摘要 :以红花石蒜叶片基因组 DNA为模板 ,分析了模板 DNA、引物、dNTPs、Mg2 +的浓度及 Taq DNA聚合酶的用量对
ISSR2PCR扩增结果的影响。建立了石蒜 ISSR分析最优化的反应体系及应用程序 :即 25μL反应体系中 ,有 20 ng
模板 DNA、0. 5μmol·L - 1随机引物、150μmol·L - 1 dNTPs、2. 0 mmol·L - 1 Mg2 + 、1. 0 U Taq DNA聚合酶。反应程序
为 : 94 ℃预变性 5 m in;然后 45个循环 :每个循环 94 ℃变性 45 s, 55 ℃退火 60 s, 72 ℃延伸 2 m in;循环结束后 72 ℃
延伸 7 m in。
关键词 :红花石蒜 ;叶片 ; ISSR2PCR
中图分类号 : S56712　　　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2005208229
基金项目 : 浙江省重点农业项目 (2004C22041)部分内容
作者简介 : 杨志玲 (1969—) ,女 ,湖南祁阳人 ,副研究员 ,在读博士 ,从事药用花卉培育研究 , zlyang0002@126. com
Establishm en t of ISSR2PCR in L ycoris rad ia ta
YANG Zhi2ling 1 , FENG Gang2li 1, 2 , TAN Z i2feng1 , LUAN Q i2fu 1 , WANG Cheng2nan2
(11Research Institute of Subtrop ical Forestry, CAF, Fuyang　311400, Zhejiang, China;
21College of Resources and Environment of CSFU, Changsha　410004, Hu’nan, China)
Abstract: In this paper, the influencing factors of inter2simp le sequence repeat ( ISSR) were analyzed by using genom ic
DNA of Lycoris radia ta. By adjusting the concentration of temp late DNA, Mg2 + , dNTPs and p rimer, the contents of Taq
DNA polymerase and the different temperature, the stable and rep roducible op timum reaction system of ISSR2PCR amp lifi2
cation and PCR amp lification parameters were established for L. radiata. The op timal system contains 20 ng temp late DNA,
110 U Taq DNA polymerase, 210 mmol·L - 1 Mg2 + , 150μmol·L - 1 dNTPs and 015 mmol·L - 1 p rimer in 25μL reaction
volume. The amp lification p rogram was: after l cycle initial denaturation at 94 ℃ for 5 m in , each 45 cycles consist of 94
℃ 45 s, 55 ℃ 50 s, 72 ℃ 2 m in, then final extension was at 72 ℃ for 7 m in.
Keywords:L. radiata; leaves; ISSR2PCR
20世纪 90年代以来 , DNA分子标记技术的出
现 ,特别是基于 PCR为主的分子标记的发展为植物
的遗传改良提供了新的途径 ,也为优良种质资源的
鉴定、分类和起源进化研究提供了一个较为可靠的
研究方法。 ISSR ( inter2simp le sequence repeat,简单
序列重复区间 )是由 Zietkiewicz等于 1994年创建
的 ,是在 SSR标记基础上发展起来的一种新的分子
标记 ,也属于微卫星标记 [ 1, 2 ]。 ISSR 标记和 RAPD
标记类似 ,多数表现为显性标记 ,和随机扩增片断
DNA技术 (RAPD)相似 ,但是 ISSR标记的引物来自
SSR引物 ,因此能够更加高效地检测出基因组的多
样性 ,被认为是集 RAPD技术和 SSR技术优点于一
身的分子标记技术 ,近年来在品种鉴定、种质资源分
析和遗传多样性研究中得到广泛应用 ,显示出了广
阔的应用前景 [ 3～7 ]。
石蒜属 (Lycoris Herb. )为石蒜科 (Amaryllidace2
ae)具鳞茎的多年生草本植物 ,全世界约有 20余种 ,
我国有 15种 ,主要分布于长江以南 ,尤以江苏、安徽、
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
浙江的种类最多 [ 8 ]。该属植物具有较高的观赏价值
和药用价值 ,国内外市场需求巨大 [ 9, 10 ]。国内外学者
在石蒜属植物的染色体核型、花粉形态、观赏价值及
药用价值等方面的研究取得了很大的进展 [ 11～15 ] ;在
分子标记应用方面 , RAPD标记被初步应用于石蒜的
种间研究 [ 16 ] ,邓传良等 [ 17 ]则将 ISSR技术应用于长筒
石蒜花被片的分子标记研究。为了研究野生石蒜居
群间遗传多样性 ,本研究以分布较为广泛的红花石蒜
(Lycoris rad iate (L’Her. ) Herb. )为例 ,建立了适合石
蒜叶片 DNA提取及 ISSR反应的技术体系 ,为大规模
进行野生石蒜居群遗传多样性研究奠定基础 ,同时 ,
该成熟技术体系的建立对于合理而全面地开发石蒜
属植物具有重要的理论和应用价值。
1　材料与方法
111 材料及来源
所用石蒜叶片由浙江兰溪基地提供 , ISSR引物
(100个 )购自加拿大哥伦比亚大学 ;其它 PCR所需
试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
112　D NA的提取与检测
采用改良的 CTAB法 [ 18 ]进行 DNA提取 ,然后采
用 8 g·L - 1琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量 , Shima2
zu (岛津 ) UV2401分光光度计测定 DNA浓度。
113　PCR扩增
以石蒜基因组 DNA 为模板 ,根据预备试验结
果 ,对影响 ISSR2PCR扩增的主要参数设置了不同梯
度处理。反应总体系为 25 μL,其中 DNA 模板设
10、20、40、60、80 ng 5个浓度梯度 ;引物浓度设 011、
013、015、017、018 μmol·L - 1 5个梯度 ; dNTPs设
100、150、200、250、300 μmol·L - 1 5 个浓度梯度 ;
Mg2 +浓度设 110、115、210、215、310 mmol·L - 1 5个
梯度 ; Taq DNA聚合酶设 015、110、115、210 U 共 4
个梯度。另外根据 Tm值对退火温度设置了 52、55、
58 ℃ 3个梯度。
114　 ISSR2PCR产物的检测
ISSR2PCR产物采用 10 g·L - 1琼脂糖凝胶分离
扩增产物 , EB染色 ,电压为 4 V·cm - 1。当溴酚蓝
指示剂距离前沿约 2～3 cm时停止电泳。在紫外自
动凝胶成像系统上观察并拍照记录。
2　结果与分析
211　D NA提取
本实验提取的 DNA呈白色或无色絮状沉淀 ,电
泳显示 DNA完整 ,无明显降解 (图 1)。用紫外分光
光度计测定 DNA在 260 nm和 280 nm的光吸收比
值 (A260 /A280 )为 1180～1195。结果显示改进后的
CTAB法 [ 18 ]是一种简单快速、效率高的基因组 DNA
提取方法。
图 1　样品石蒜总 DNA
(泳道 1～5代表兰溪样品 1、2、3、4、5)
212　模板浓度对 ISSR扩增的影响
DNA模板浓度是影响 ISSR2PCR扩增效果的一
个重要因子。模板浓度过低 ,扩增产物不稳定或无
扩增产物 ;模板浓度过高 ,又会相应增加非特异性产
物。本实验设置了 5个模板浓度梯度 (图 2)参与
PCR反应 ,结果显示 :浓度为 80 ng时 ,扩增条带比
较模糊 ,而在 10～60 ng之间条带清晰 ,本实验选择
20 ng为反应体系中模板的浓度。
图 2　模板浓度对 ISSR扩增的影响
(泳道 1～5 DNA加入的量分别为 10、20、40、60、80 ng)
213 引物浓度对 ISSR扩增的影响
引物浓度会对 PCR的条带产生明显的影响 ,浓
度过低不能产生扩增 ,浓度过高会增加引物二聚体
的形成 [ 19 ] ,导致条带不清晰或者产生新的特异性位
点。为了减少非特异性扩增 ,加强重复性 ,本实验根
据林万明等 [ 19 ] 确认的引物浓度范围 ( 011 ～210
μmol·L - 1 ) ,参考相关实验结果设置了 5个较低浓
度梯度 ,比较引物浓度对 ISSR扩增结果的影响。结
果表明 (图 3) :随着引物浓度升高 ,扩增带由弱到
强 ,当达到 017μmol·L - 1时 ,扩增产生的无主条带
清晰度下降 ,并出现非特异性条带 ,所以 ,研究确定
加入引物浓度为 015μmol·L - 1。
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第 4期 杨志玲等 :红花石蒜 ISSR2PCR反应体系的建立
图 3　引物浓度对 ISSR扩增的影响
(泳道 1～5引物浓度分别为 011、013、015、017、018μmol·L - 1 )
214　dNTPs浓度对 ISSR扩增的影响
dNTPs是 PCR的原料 ,常用 100～200μmol·
L - 1 ,浓度过低会导致扩增带产率低 ,而过高会产生
错误掺入。从图 4可以看出 :在各 dNTPs浓度下 ,都
能扩增出基本一致的条带 ,但浓度为 300μmol·L - 1
时较大的 DNA扩增带不能进行有效的扩增 ,反而变
弱 ,说明高浓度的 dNTPs会抑制分子质量相对较大
的条带扩增 ,考虑到反应的稳定性与可重复性 ,本试
验采用 150μmol·L - 1的 dNTPs浓度。
图 4　dNTPs浓度对 ISSR扩增的影响
(泳道 1～5 dNTP浓度分别为 100、150、200、250、300μmol·L - 1 )
215　M g2 +浓度对 ISSR扩增的影响
Mg2 +浓度是 ISSR2PCR的一个主要变化因素。
作为 Taq酶的辅助因子 ,Mg2 +浓度不仅影响 Taq酶
活性 ,还能与反应液中的 dNTPs、模板 DNA及引物
结合 ,影响引物与模板的结合效率、模板与 PCR产
物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形
成 [ 19 ]。本试验对所采用的每个引物设置了 5 个
Mg2 +浓度梯度比较 ,结果 (图 5)表明 : Mg2 +浓度为
110～115 mmol·L - 1时 ,扩增产物模糊 ,不清晰 ;浓
度 210～215 mmol·L - 1能得到清晰稳定的条带 ,且
无非特异性扩增 ;浓度 310 mmol·L - 1虽也能得到扩
增条带 ,但条带变少 ,且具有非特异性扩增 ;因此 ,
Mg2 +浓度采用 210 mmol·L - 1。
图 5　Mg2 +浓度对 ISSR扩增的影响
(泳道 1～5 Mg2 +浓度分别为 110、115、210、215、310 mmol·L - 1 )
图 6　Taq酶浓度对 ISSR扩增的影响
(泳道 1～4 Taq酶的加入量分别为 015、110、115、210 U)
图 7　退火温度对 ISSR扩增的影响
(泳道 1～3退火温度分别为 52、55、58 ℃)
115
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216　Taq D NA聚合酶浓度对 ISSR扩增的影响
本实验在 25μL的反应体系中对 Taq酶设置了
015、110、115、210 U 4个梯度进行处理 ,结果表明
(图 6) : 015 U扩增条带不明显 ,而大于 110 U扩增
效果好。由此可见 :量太少 ,扩增结果不好 ,量过大
的时候 ,成本高 ,易出现非特异性条带 ;因此 ,本实验
在 25μL反应体系中加入 110 U DNA聚合酶。
217　退火温度对 ISSR扩增的影响
扩增反应的程序对扩增效果至关重要 ,不同物
种的扩增程序有所不同。退火温度是扩增程序中影
响扩增特异性最重要的因子。退火温度可由引物的
Tm 值确定 ,退火温度为 Tm 值 ±3℃, ISSR反应过程
中一般的退火温度在 45 ℃以上。本实验根据 Tm
值对退火温度做了 3个梯度 : 52、55、58 ℃。结果见
图 7所示 : 52 ℃和 55 ℃都能扩增出清晰条代 , 55 ℃
显然可以减少引物与模板之间的非特异性结合 ,提
高反应的特异性。另外 ,在 58 ℃时则造成“拖尾 ”
现象 ,因此 ,实验过程中选择较高的退火温度 55 ℃
作为反应的退火温度。
3　小结
本文经过反应条件的筛选获得了最优的 25μL
反应体系。反应程序上 : 94 ℃预变性 5 m in;然后 45
个循环 :每个循环 94 ℃变性 45 s, 55 ℃退火 60 s, 72
℃延伸 2 m in;循环结束后 72 ℃延伸 7 m in。反应组
分上 : 20 ng模板 DNA、随机引物 015μmol·L - 1、
dNTPs 150μmol·L - 1、Mg2 + 210 mmol·L - 1、110 U
Taq DNA聚合酶。
反应条件的变化对 ISSR扩增影响较大 ,特别是
Mg2 +浓度、Taq DNA聚合酶、退火温度。Mg2 +是 Taq
DNA聚合酶激活所必需的 ,引物和模板的双链杂交
体的解链和退火温度也受二价阳离子的影响。
Mg2 +浓度过低时 ,酶活性显著降低 ;过高时 ,则酶催
化非特异性产物的扩增。需指出的是 , PCR混合物
中的 DNA 模板、引物和 dNTPs的磷酸基均可与
Mg2 +结合 ,降低 Mg2 +的实际浓度 ,因此在实验的反
应体系中 ,Mg2 +浓度是一个较难把握的因素 ,需要
加以重点考虑。
退火温度对 PCR的特异性十分关键 ,过低会导
致引物与模板的非特异性结合 ,使扩增的特异性下
降 ,提高温度就会减少非特异性结合 ,提高反应的特
异性 ,本研究根据所选引物的 Tm 值选择了 Tm 值 ±
3 ℃共 3个温度梯度 ,获得了比较理想的 55 ℃的退
火温度 ,没有再做更低温度下的选择实验 ,节约了实
验成本。
在本研究中用琼脂糖凝胶来建立适合石蒜叶片
DNA扩增片断分离的技术体系 ,简化了实验过程 ,
所得出的结果能够在正规聚丙烯酰胺凝胶电泳过程
中应用 ,是初步进行 ISSR2PCR 实验的一个过程。
ISSR技术和 RAPD技术相比 ,操作的难度相应地加
大了 ,但一般来说 ISSR 技术比 RAPD 技术更加稳
定、多态性更高 [ 20 ] ,可能会在相关的物种多样性研
究中得到更广泛的应用。
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