全 文 ：林业科学研究!"#$"!"%"%#$%%$ %%/
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!!文章编号!$##$$&()""#$"##%#%%$#/
角倍总 9D;提取方法建立及 ;+T6.基因片段克隆
阮桢媛! 陈晓鸣#! 杨子祥
"中国林业科学研究院资源昆虫研究所!国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室!云南 昆明!*%#""&#
收稿日期$ "#$"#&$$
基金项目$ 国家林业公益性行业专项""#$"#&*#"#*云南省科技创新强省项目""#$#G,#")#
作者简介$ 阮桢媛"$().(#!女!江西南昌人!博士研究生!主要从事植物分子生物学研究P
#
通讯作者$ 陈晓鸣!研究员!博士生导师!主要从事资源昆虫学研究PYE8?L$SE:;6=hO?KPQE$*(P=6>
摘要!角倍总5Z,的提取是研究角倍蚜虫瘿形成分子机制的基础) 本研究针对其多酚多糖含量高的特点!从各类
试剂盒及常规方法改良中优选出G0,+"异丙醇#沉淀方法!较为简单经济有效地提取角倍总 5Z,!其得率可达
*#P$*
!
J/"$## EJ#
U$
) 利用该方法提取的 5Z,!通过 50_G5克隆肌动蛋白基因 ;+T6.片段!碱基序列长度为
(.& NK!编码 .$$ 个氨基酸!该序列与[6=+8=Q中已登录的;+T6.基因序列比对显示与芒果同源性最高!相似性达
到 (%3!与其它肌动蛋白的氨基酸序列同源性达到 )*3以上) 角倍总5Z,的提取及看家基因;+T6.的克隆可为
盐肤木和其他蚜虫虫瘿的分子克隆及基因表达分析奠定基础)
关键词!角倍$总5Z,提取$;+T6.基因
中图分类号!i(** 文献标识码!,
EF%/#1%&,$,38,%#59D;3/,GH,/$(*I7#5#$*
%-(65,$&$7 ,3;+T6.J($(0/#7G($%
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D@:6D J8L7P
=(+ >,/*2$ ;A9=6DJ8L* >A>8L5Z,6S>98:>?A=*;+T6.J6=6
角倍 是 由 角 倍 蚜 " ?)*F$)*&$0B(F=( )*=0$0%=%
+6LP#刺激盐肤木"*4%)*=0$0%=%1?LP#产生的一种
虫瘿!因其单宁酸含量极为丰富而被广泛应用于纺
织化工轻工业食品等行业+$ U", ) 从分子生物学
的角度分析角倍的形成机制将有助于对角倍形成过
程的全面了解) 角倍高质量 5Z,提取是对其进行
分子克隆以及基因表达分析等分子生物学研究的基
础) 多糖多酚类物质是困扰植物总 5Z,提取的难
点!多糖类物质由于理化性质与 5Z,有许多相似之
处而易于与其共沉淀+., !而酚类物质易被氧化成醌
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
类物质!与 5Z,结合后影响 5Z,的分离纯化+&, )
由于成熟角倍中富含多糖多酚等物质+% U/, !5Z,
的有效提取成为其分子生物学研究首要解决的问
题) 植物组织 5Z,提取常用的方法有 4-4 法
G0,+法09?]AL法苯酚法e?GL沉淀法等+) U$#, !本
试验结合角倍化学组成的特点!通过对不同试剂盒
及方法的比较!获得了角倍5Z,提取的优化方法)
植物肌动蛋白",G0存在的一种重要蛋白质!构成细胞骨架中的微丝系
统!参与细胞分裂细胞运动细胞空间形状维持物
质运输等生命活动+$$, ) 由于肌动蛋白基因表达水
平受环境影响较小且在各生长阶段均持续表达!被
视为真核细胞生理过程的看家基因!在基因表达调
控中被广泛作为分子内标+$" U$., ) 因此克隆出角倍
的内参基因 ;+T6.!将为其进行基因表达分析和利
用肌动蛋白基因研究植物进化提供资料!为盐肤木
属的其它成瘿植物 ;+T6.基因的克隆以及致瘿相
关基因的定量分析提供参考)
$!材料和方法
@P@A试验材料
角倍样品来源于中国林科院资源昆虫研究所温
室!采集后立即置于液氮中保存) 5Z,提取之前!
用灭菌解剖刀将角倍剖开并去除其中的所有蚜虫!
以消除蚜虫对角倍5Z,提取可能造成的影响)
柱式植物总5Z,抽提纯化试剂盒及5Z,7?EKL6
0A>8L5Z,f?>总5Z,提取试剂盒分别购自上海生
工和北京天根公司!05<]AL试剂购自 15G公司!反
转录试剂盒购自C69E6=>87公司!胶回收试剂盒购自
,SHJ6=公司!KY,4j01 U0
$
载体购自北京全式金
公司)
@P?A试验方法
$P"P$!5Z,提取方法!"$#柱式植物总 5Z,抽提
纯化试剂盒$将 #2#% J植物组织用液氮研磨成粉末
与 &%#
!
e+@B695LH7?7_[震荡混匀!室温放置 %
E?=!而后 $" ### J& V离心 . E?=!将上清移至一新
的离心管中*加入 $a" 体积无水乙醇!充分混匀*将
吸附柱放入收集管中!将溶液全部加至吸附柱中!静
置 $ E?=!室温 $" ### J离心 $ E?=!倒掉收集管中废
液*将吸附柱放回收集管中!加入 %##
!
e[04AL@
>?A=!静置 $ E?=!室温 $# ### J离心 $ E?=!倒掉收集
管中废液*将吸附柱放回收集管中!加入 %##
!
eZ0
4AL@>?A=!静置 $ E?=!室温 $# ### J离心 $ E?=!倒掉
收集管中废液*将吸附柱放回收集管中!$" ### J离
心 " E?=*将吸附柱放入离心管中!在吸附膜中央加
入 "#
!
e-Y_G>968>6D DD"
b
"
!静置 " E?=!$" ### J
离心 " E?=!将所得到的5Z,溶液置于U/# V保存)
""#5Z,7?EKL60A>8L5Z,f?>总 5Z,提取试
剂盒$取 $## EJ植物组织加入 $ Ee裂解液 5k!充
分混匀后将匀浆液在室温放置 % E?=!使得核酸蛋白
混合物完全分离!$" ### J& V离心 % E?=!将上清移
至新离心管中*加入 "##
!
e氯仿!盖好管盖!剧烈震
荡 $% 7!室温放置 . E?=!$" ### J& V离心 $# E?=!
样品会分为 . 层$黄色的有机相!中间层和无色的水
相!将5Z,水相转移到一个新的离心管中进行下一
步操作*缓慢加入 #2% 倍体积的无水乙醇!混匀!将
得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱 G5. 中!$" ###
J& V离心 .# 7!弃掉收集管中的废液*向吸附柱中
加入 %##
!
e去蛋白液 5-!$" ### J& V离心 .# 7!
弃废液*向吸附柱中加入 *##
!
e漂洗液 5` !室温
静置 " E?=!$" ### J& V离心 .# 7!弃废液!重复此
操作步骤*将吸附柱放入收集管中!$" ### J& V离
心 " E?=!去除残余液体!而后转入一个新的离心管
中!加入 &#
!
e-Y_G>968>6D DD"
b
"
!静置 " E?=!
$" ### J离心 " E?=)
".#传统 09?]AL法$将 $ Ee05<]AL5Y,[YZ0
5Z,提取试剂和 $## EJ液氮研磨样品加入离心管
中充分混匀!室温静置 % E?=!$" ### J& V离心 %
E?=!将上清移至新离心管中!加入 "##
!
e氯仿!剧
烈震荡 $% 7!在室温下静置 $% E?=!然后 $" ### J
& V离心 $% E?=!将无色水相转入新离心管中*加入
%##
!
e异丙醇!室温静置 % $# E?=!$" ### J& V
离心 ) E?=*去除上清!加入 $ Ee/%3乙醇!/ %## J
& V离心 % E?=!重复此步骤!去除乙醇洗液!将5Z,
沉淀室温放置 . % E?=!加入 &#
!
e-Y_G>968>6D
DD"
b
"
溶解5Z,)
" ?]AL改良法$样品在液氮研磨过程中加入
$#3 _d_!在 $ Ee09?]AL提取液中加入 $#
!
e
"
巯
基乙醇!使用苯酚$氯仿$异戊醇""%$"&$$#反复抽
提直至无白色中间层!而后用氯仿抽提一次!采用
"%#
!
e异丙醇与 "%#
!
e高盐溶液"#P) EAL/eU$柠
檬酸钠!$P" EAL/eU$ Z8GL#共沉淀 5Z,!其余步骤
与传统09?]AL法相同)
"%#G0,+改良法$样品在液氮研磨过程中加入
$#3 _d_!在 $ EeG0,+提取缓冲液""3 G0,+!
#2$ EAL/e
U$
09?7\GLK\)2#!$P& EAL/e
U$
Z8GL!
"%%
第 % 期 阮桢媛等$角倍总5Z,提取方法建立及;+T6.基因片段克隆
#P#"% EAL/e
U$
Y-0,#中加入 $#
!
e
"
巯基乙醇与
$## EJ研磨样品充分混合!于 *% V水浴 &# E?=!每
隔 $# E?=混匀一次!室温 $" ### J离心 $# E?=*取上
清依次加入 $a$# 体积无水乙醇!$a$# 体积 % EAL/
e
U$
f,:"K\&2)#!$a" 体积水饱和酚和 $a" 体积氯
仿a异戊醇""& $^#!充分混匀 . E?=!冰上静置 . E?=!
$" ### J& V离心 $# E?=!若仍有中间蛋白层可重复
此步骤至蛋白质层消失*取上清液加入等体积氯仿a
异戊醇""& $^#!充分混匀 $% 7!冰上静置 . E?=!
$" ### J& V离心 $# E?=*取上清分别采用 "a. 体积
的异丙醇与 $a. 体积 % EAL/eU$ Z8GL于U"# V 沉
淀 $ ;!"2% 体积无水乙醇与 $a$# 体积 . EAL/eU$乙
酸钠"K\%2"# U"# V 沉淀 " ;!& EAL/eU$ e?GL于 &
V沉淀过夜 . 种沉淀方法!而后异丙醇沉淀 $" ### J
& V离心 $# E?=!无水乙醇与e?GL沉淀离心 "# E?=!
后续步骤与09?]AL法相同)
$P"P"!5Z,纯化!为了消除提取 5Z,中痕量
-Z,对后续试验造成的影响!用-Z876<处理5Z,!
$
!
J5Z,使用 $ g-Z876<消化!./ V处理 .# E?=
后于 *% V将 -Z876<灭活) 经 -Z876<处理后的
5Z,需要进一步精制) 此时将 5Z,总体积增至
$##
!
e!加入等量酚a氯仿a异戊醇""% "^& $^#!充分
混匀!离心取上清!加入 $##
!
e氯仿a异戊醇""& $^#
反复抽提 " 次用无水乙醇沉淀!再经 /%3乙醇洗涤
两遍!最后干燥后溶解于-Y_G>968>6D DD"
b
"
中)
$P"P.!总5Z,纯度及完整性检测!分别取各种方
法提取的 "
!
e5Z,溶液在 $3非变性琼脂糖凝胶
中电泳!其中试剂盒及 09?]AL法为 5Z,提取原液!
G0,+法为 % 倍稀释液!溴化乙锭染色!而后在凝胶
成像系统下观察并拍照) 取 "
!
e5Z,原液!用
5Z876B966水将其稀释 % 倍用于分光光度计检测)
通过测定其 ,
".#
,
"*#
,
")#
值!计算 ,
"*#
a,
".#
!,
"*#
a
,
")#
!用于判断5Z,纯度!并且得出 5Z,浓度及得
率) 5Z,浓度 c,
"*#
l样品稀释倍数 l&#)
$P"P&!角倍;+T6.基因片段的克隆!按照 56O69
>,?D
01
\1?=@7C?97>4>98=D :-Z,4H=>;67?7f?>反转
录试剂盒说明书进行 5Z,的反转录!生成:-Z,第
一链) 根据 [6=+8=Q 中已知芒果"RC/./#.*2$#拟
南芥"Z1m$"$#$)2.#肌动蛋白基因序列!运用_9?E
69%2# 设计一对简并引物 _$$0[0G,0[[00[[0,0
[[[0G和 _"$"Ga0#0[[,,[[0[G0[,[[[,) 取
"
!
e反转录产物为模板!用引物 _$!_" 进行 50
_G5反应!体系为$(& V预变性 . E?=!(& V变性
.# 7!%" V退火 .# 7!/" V延伸 $ E?=!.# 个循环!最
后 /" V延伸 $# E?=)
$P"P%!目的片段回收克隆和测序!将目的片段按
照胶回收试剂盒说明书割胶回收!与 KY,4j010
$
载
体连接转化大肠杆菌 -\%
#
感受态细胞!进行蓝白
斑筛选!选取带有目的片段的重组质粒!进行 _G5
检测!确认后送上海生工测序) 序列运用 ZG+<和
-Z,E8=软件进行比对和分析)
"!结果与分析
?P@A不同5Z,提取方法比较
由于成熟角倍中多糖多酚次级代谢产物含量
较高!传统09?]AL法及5Z,提取试剂盒"北京天根#
中的提取试剂无法有效抑制其作用!未能有效提取
到角倍总5Z,!电泳均未见明显条带) 经过改良的
09?]AL法所提取的5Z,不完整!大分子 5Z,降解严
重"见图 $#) 柱式 5Z,提取试剂盒"上海生工#虽
然能够较快速简单地提取到较完整且纯度较高的
5Z,"见图 "#!但是得率极低!仅为 #2.)
!
J/"$##
EJ#
U$
"见表 $#!无法用于后续的反转录试验) 同样
使用G0,+的方法!分别采用异丙醇e?GL与无水乙
醇三种方法沉淀 5Z,!均能有效得到完整的总
5Z,!")4与 $)4 95Z,带型完整且二者亮度之比约
为 " $^"见图 .#!但异丙醇沉淀得到 5Z,量远高于
其它方法!为 *#2$*
!
J/"$## EJ#
U$
"见表 $#)
图 $!09?]AL改良法总5Z,电泳 图 "!生工试剂盒总5Z,电泳
表 @A不同提取方法总9D;的得率和纯度比较
方法 ,
"*#
a,
")#
,
"*#
a,
".#
5Z,得率a
!
J/"$## EJ#
U$
生工柱式5Z,提取试剂盒 $P(* "P"# #P.)
09?]AL改良法 $P). "P$/ $(P&&
G0,+法"异丙醇沉淀# $P(/ "P#) *#P$*
G0,+法"e?GL沉淀# $P(& "P$" .$P.#
G0,+法"无水乙醇沉淀# $P(% "P$* .&P%*
.%%
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
$$无水乙醇沉淀5Z,* "$ e?GL沉淀5Z,* .$异丙醇沉淀5Z,
图 .!G0,+法总5Z,电泳
?P?A50_G5扩增
使用改良 G0,+"异丙醇沉淀#方法提取的总
5Z,!通过 50_G5的方法获得大小为 (.& NK 的
;+T6.基因片段!电泳结果见图 &)
?PBA测序结果与分析
阳性克隆测序获得一段长度为 (.& NK 的核酸
序列!编码 .$$ 个氨基酸 "见图 %#) 所得序列与
[6=+8=Q中已登录的;+T6.基因序列比对显示他们
之间 同 源 性 均 在 )*3 以 上! 其 中 与 芒 果
" \i%)%(((2$ # 荔 枝 " \i%)))%%2$ # 杨 梅
",+*%#%)(2$# ;+T6.基因序列同源性较高!与芒果
相似性达到 (%3!与荔枝和杨梅相似性达 ("3!这
表明所克隆片段为;+T6.基因片段!在[6=+8=Q 中
1$$##NK 189Q69
图 &!;+T6.基因特异片段
的登录号为 Ri(*&$$/) 将推测的盐肤木肌动蛋白
氨 基 酸 序 列 与 谷 子 " ,,[$##&$2$ # 绿 豆
",,C.$*&.2$ # 夏 堇 " ,+[&(.("2$ # 拟 南 芥
",,1*%*%/2$#甘蓝",,-#".")2$#绿地珊瑚蕨
",,-&)..&2$#肌动蛋白氨基酸序列进行多重比较
分析!此 / 种植物分属于不同科!有 "*& 个保守氨基
酸"见图 *#!可见所克隆片段为 ;+T6.基因的高度
保守区) 盐肤木与谷子 4?,G0同源性最高"(/3#!
与蕨类植物门绿地珊瑚蕨同源性最低!亦达到 ($3
"见图 /#!由此进一步证明肌动蛋白是一种高度保
守的蛋白)
图 %!角倍;+T6.基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
&%%
第 % 期 阮桢媛等$角倍总5Z,提取方法建立及;+T6.基因片段克隆
图 *!盐肤木与其它植物;+T6.基因片段氨基酸序列多重比较
图 /!5:,G0与其他植物;+T6.基因的氨基酸序列同源性分析
%%%
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
.!结论与讨论
植物组织总 5Z,的提取是分子生物学研究中
的基础!更是研究中的难点) 不同的植物种类甚至
同一种植物不同生长发育时期的材料都会因为其中
化学组成的不同而需要对其总 5Z,提取的方法做
出相应调整) 多糖多酚是影响 5Z,提取的主要因
素) 由于酚类化合物的存在!5Z,提取过程中极易
产生褐化效应+$&, !氧化的酚类化合物 "如醌类#可
以与 5Z,不可逆地结合导致 5Z,的降解及 5Z,
活性的丧失+$%, ) 针对此类问题已有许多解决方法!
其中使用_d_"聚乙烯吡咯烷酮#与
"
巯基乙醇处
理多酚类物质较为常见) _d_是酚的络合物!能与
多酚形成一种不溶的络合物质!有效去除多酚!减少
5Z,中酚的污染!同时能够防止多酚氧化产物形成
对核酸质量影响!多酚被 _d_络合之后可以通过离
心的方式去除!不影响后续的提取过程)
"
巯基乙
醇是抗氧化剂!可以有效防止酚氧化成醌!避免褐
变!使酚容易去除) 由于角倍中单宁酸含量极高!为
保证5Z,不被降解!本试验在研磨时使用高比例
_d_络合多酚!并在离心过程中除去络合物!提取液
中适量
"
巯基乙醇的加入进一步防止多酚氧化!两
者结合效果较好) 非变性胶电泳结果显示!G0,+
改良法能够获得完整的总5Z,)
成熟的角倍组织多糖含量高是其 5Z,提取面
临的另一个问题) 多糖能与 5Z,共沉淀形成难溶
的胶状物!还可以抑制许多酶的活性) 上述用于螯
合多酚的_d_也能和多糖结合!有效去除多糖) 传
统的09?]AL法在遇到有较高含量多糖时!往往采用
高盐溶液沉淀的方法!在沉淀的过程中同时加入 $a
" 体积的异丙醇与 $a" 体积的高盐溶液) 本试验在
改良09?]AL法中尝试使用此法减少多糖对5Z,提取
的影响!与传统方法比较而言!改良之后粘性物质有
所减少) 高浓度Z8n或 fn或低浓度乙醇存在条件
下可部分除去多糖+$* U$/, ) 使用终浓度为 " EAL/
e
U$的 e?GL沉淀 5Z,+$), ! 无水乙醇与乙酸钠
"K\%2"#共沉淀+$(, !或者综合使用多种方法均能通
过选择性沉淀多糖达到 5Z,进一步纯化的效
果+"#, ) 异丙醇可选择性沉淀大分子 95Z,及 E5
Z,!所需容积小且速度快!一般不需要在低温条件
下长时间放置!但是为了尽可能去除多糖!需要在高
盐条件下沉淀以提高 5Z,纯度) e?GL沉淀 5Z,可
除去部分多糖!但沉淀时间过长!造成 5Z,损失)
在低浓度乙醇与高浓度 fn沉淀除多糖的前提下!
e?GL沉淀与改进的异丙醇沉淀能获得相似质量的总
5Z,!但异丙醇沉淀产量约为e?GL沉淀法的两倍!可
能是由于e?GL沉淀时间过长造成 5Z,的损失) 无
水乙醇沉淀法由于需要较大体积的乙醇!不适宜大
体积样品的提取) 与异丙醇相比!乙醇较为亲水!碳
链较短!沉淀5Z,的效果不如异丙醇!故得率较低)
使用酚$氯仿$异戊醇反复抽提!将水相中 5Z,
与中间层和有机相中 -Z,蛋白质以及多糖物质充
分分离!但是无论何种方法提取的总 5Z,!均需要
使用-Z876<处理!以保证其无 -Z,对后续试验产
生干扰) 本研究通过改良 G0,+"异丙醇沉淀#法获
得完整且产量较高的总 5Z,!并在进一步纯化后用
于50_G5) 从;+T6.基因克隆结果分析!所提取
的总5Z,完全能满足后续试验要求)
肌动蛋白无论是在核酸序列还是在氨基酸序列
中都具有高度的同源性+"$, !本试验克隆得到的盐肤
木 ;+T6.基因片段与其它植物核苷酸序列同源性
均在 )*3以上!多序列比对结果亦显示它与其它植
物氨基酸序列的高度同源性!进一步证明 ;+T6.基
因是高度保守的看家基因) 目前尚无有关盐肤木属
植物肌动蛋白基因的研究!在整个漆树科植物中!
[6=+8=Q中已登录的只有芒果的相关信息!盐肤木
;+T6.基因的成功克隆不仅能为盐肤木分子生物学
研究奠定基础!也为克隆其它近源种 ;+T6.基因提
供信息资源)
对基因表达进行定量检测时常使用
"
肌动蛋
白基因")4 和 $)4 95Z,等看家基因作为内部参
照!这些基因被认为在某些类型细胞中的表达是恒
定的+"" U"., ) 在角倍形成过程中!部分参与其中的基
因在表达量上可能与正常的盐肤木叶片存在着差
异!盐肤木角倍 ;+T6.基因的克隆或许能够为其它
基因的表达和调控提供内标参考!为优良基因筛选
提供理论依据)
参考文献!
+$, 顾人侠P分光光度法测定倍子单宁酸的研究+R,P林产化学与工
业! $()%! % "&#$ $" U".
+", 孙达旺P植物单宁化学+1,P北京$ 中国林业出版社! $(("
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>?A= AB5Z,B9AEKL8=>>?77@67+R,P,=8LH>?:8L+?A:;6E?7>9H! $()/!
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$(/&! .$$ %") U%&%
*%%
第 % 期 阮桢媛等$角倍总5Z,提取方法建立及;+T6.基因片段克隆
+%, 陈!祥!孙秀芳!毛!群P五倍子单宁组份分离鉴定的研究
"
$
#P低分子量组份和醇解产物的分离鉴定+R,P林产化学与
工业! $()%! % ""#$ $* U".
+*, 夏定久P我国的五倍子资源+R,P林产化学与工业! $()%! %
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+/, 贺近格! 李启基P林产化学工业全书+1,P北京$ 中国林业出版
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