全 文 ：越橘果实总RNA提取方法比较研究
裴嘉博，李晓艳，李亚东*
（吉林农业大学园艺学院，长春 130118）
摘 要：越橘成熟果实富含多糖、多酚和花色素苷等次生代谢物质，严重影响果实总RNA的提取。试验以越
橘成熟果实的果肉和果皮为试材，采用适合多糖多酚植物RNA提取试剂盒及试剂和改良的CTAB法提取越橘果肉
和果皮中总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪（NanoDrop 2000）检测。结果表明，改良的CTAB法效果最
好，提取的总RNA完整性好，纯度高。通过RT-PCR验证，所提取的总RNA可以满足基因克隆等分子生物学试
验的要求。
关键词：越橘；果实；总RNA提取；多糖；多酚
中图分类号：S663.9 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2012）10-0030-05
Study on total RNA isolation from blueberry (Vaccinium corymbosum L.)
fruit/PEI Jiabo, LI Xiaoyan, LI Yadong(School of Horticulture, Jilin Agricultural University, Changchun
130118, China)
Abstract: It is difficult to isolate total RNA from blueberry fruit because of a great deal of polysaccharides,
polyphenolics, anthocyanins and other metabolites. In this study, total RNA from pulp and skin of blueberry fruit was
isolated with plant RNA Isolating Reagent kit, reagent method and improved CTAB method. The total RNA were
detected by the agarose gel electrophoresis and nucleic acid/protein assay (NanoDrop 2000). The results showed that
improved CTAB method had the best result. The total RNA isolated by this method was proved to be relatively intact and
with high purity. The isolated RNA could be used in molecular biology experimentation by RT-PCR analysis.
Key words: blueberry; fruit; total RNA isolation; polysaccharide; polyphenolic
从不同组织和器官中提取纯度高、完整性好
的 RNA 是进行 Northern 分析、实时定量 PCR、
cDNA文库构建和新一代测序（如 454 pyrosequenc-
ing和 Illumina sequencing）等许多分子生物学研究
的必要前提。但是由于植物种类繁多，次生代谢
物质复杂，导致很难有一种通用的方法来提取不
同植物组织中的RNA。尤其是许多植物果实组织
中富含多糖和酚类化合物，而且RNAase（核糖核酸
酶）水平较高，这些因素使得从果实中提取
高质量RNA十分困难[1-3]。目前已经从葡萄[4]、猕猴
桃 [5]、香蕉 [6]、苹果 [5]和柿 [7]等的果实中提取到高质
量的RNA，但以越橘（Vaccinium corymbosum L.）果
实为材料进行RNA提取的文章尚未见报道。
越橘果实富含多糖多酚，尤其是花色素苷的
含量在众多水果和蔬菜当中高居榜首 [8-9]。对越橘
花色素苷合成途径的一些关键酶基因进行克隆分
离及通过实时定量PCR研究其在不同组织中表达的
特异性，是了解越橘花色素苷合成分子机制的主要
方法，而提取高质量的RNA是这一系列后续试验的
前提和基础。本试验以越橘成熟果的果肉和果皮为
试材，采用市售经典的适合多糖多酚植物RNA提取
试剂盒、Trizol试剂法和改良的CTAB法提取越橘
收稿日期：2012-05-06
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201103037）
作者简介：裴嘉博（1986-），女，硕士研究生，研究方向为果树种质资源与分子生物学。E-mail: peijiabo@163. com
*通讯作者：李亚东，教授，博士生导师，研究方向为果树种质资源与分子生物学。E-mail: blueberryli@163. com
Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第43卷 第10期 43(10): 30~34
2012年10月 Oct. 2012
果实组织总RNA。以探索和研究最适于越橘果实
的总RNA的提取方法。
1 材料与方法
1.1 材料
以越橘品种北陆为试材，来源于吉林农业大
学小浆果试验基地。成熟果实（花后50 d）采收后快
速将果肉和果皮剥离，并分别置于液氮中速冻，
于-80 ℃低温冰箱保存备用。
1.2 果实总RNA的提取
试验所用到的研钵、钵杵、镊子、药匙在使
用前于 180 ℃烘箱干热灭菌 6 h，离心管和各种移
液器吸头等塑料器材使用前用 0.1%（V/V）的DEPC
水（Diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯） 37 ℃浸
泡12 h，高压灭菌后使用。试剂均用0.1% DEPC水
配制，高压灭菌后使用。本试验选用的试剂盒都是
目前市场反映较好的能从多种植物组织中，特别是
从富含多糖多酚的果实中提取RNA的产品（见表1）。
试剂盒的操作均严格按说明书进行，每种试剂盒至
少重复 3次。改良的CTAB法，此法是参照 Jaakola
等报道的从越橘属植物欧洲越橘（Bilberry）果实中
提取RNA的方法并略加改动[10]。
表1 6种不同的RNA提取方法
Table 1 Six different methods of RNA isolation
主要试剂：
CTAB提取缓冲液：2% CTAB；2% PVP（W/V）
（Polyvinylpyrrolidone，分子质量 360 000，聚乙烯
吡咯烷酮，分子质量 360 000）； 100 mmol·L-1
Tris-HCl（pH 8.0）；25 mmol·L-1 EDTA；2.0 mol·L-1
NaCl；0.5 g·L-1亚精胺（Spermidine）。
SSTE 缓冲液： 1.0 mol·L-1 NaCl； 0.5% SDS
（W/V）；10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 8.0）；1 mmol·L-1
EDTA（pH 8.0）。
具体步骤如下：
① 65 ℃水浴10 mL CTAB提取缓冲液，在使用
前加入2%（V/V）β-巯基乙醇。
②从-80 ℃冰箱中取出材料置于液氮预冷过的
研钵中，加入适量液氮充分研磨样品，液氮挥发后
将样品迅速移入预冷的 10个 1.5 mL离心管中，每
管0.1 g，冰上操作。
③ 加 1 mL 65 ℃预热的CTAB提取缓冲液，涡
旋混匀，65 ℃水浴 10 min，其间震荡离心管 2~3
次，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。
④ 取上清液转移至新的离心管中，用等体积
的氯仿􀏑异戊醇=24􀏑1（V/V）抽提 2次，每次充分震
荡，放置10 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。
⑤将上清液转移至新的离心管中，加入1/4体
积 10 mol·L-1 LiCl，轻轻混匀， 4 ℃冰上 6~8 h
（或-20 ℃过夜）沉降RNA。
⑥ 4 ℃，13 000 r·min-1离心20 min。
⑦ 慢慢倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸
上数分钟。
⑧加500 mL 70%冰冷乙醇洗涤沉淀（小球状沉
淀）2次，短暂离心并慢慢倒掉乙醇。如果有色素
可以重复多次清洗，直至色素去除。
⑨ 用 100 mL SSTE缓冲液溶解RNA沉淀，如
果溶解较慢，适当进行 65 ℃水浴以加速RNA的溶
解。将10个离心管中的溶液合并成2管。
⑩ 用等体积的苯酚􀏑氯仿􀏑异戊醇=25􀏑24􀏑1
（V/V）及等体积的氯仿􀏑异戊醇=24􀏑1各抽提 1次，
每次充分震荡，放置 10 min，4 ℃，12 000 r·min-1
离心10 min。
11 取上清液，加入 2倍体积的冰冷无水乙
醇，-20 ℃沉降2 h（或-80 ℃沉降30 min）。
12 4 ℃，13 000 r·min-1离心 20 min。弃掉上清，
沉淀用 500 mL 70%冰冷乙醇洗涤 2次，真空干燥
后溶于 50 mL DEPC水中，置于-80 ℃冰箱保存
备用。
方法 Methods
百泰克通用植物总RNA提取试剂盒 BioTeke kit（RP3301）
植物RNAout Plant RNAout（3080-50）
植物总RNA提取试剂盒 RNAprep pure（DP432）
植物总RNA提取试剂 RNAplant plus Reagent（DP437）
Trizol试剂法 Trizol reagent
改良CTAB法 Improved CTAB
来源 Sources
北京百泰克生物技术有限公司
北京天恩泽基因科技有限公司
天根生化科技（北京）有限公司
天根生化科技（北京）有限公司
宝生物（大连）工程有限公司
参照文献[10]
裴嘉博等：越橘果实总RNA 提取方法比较研究第10期 ·31·
1.3 RNA完整性与质量检测
用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳对提取的总RNA进
行完整性检测。使用NanoDrop 2000对样品RNA的
浓度和纯度进行定量分析。
1.4 RT-PCR验证
越橘果肉和果皮提取的总 RNA，用 DNaseⅠ
（RNase free）消化基因组 DNA 后，各取 1 μg为模
板，用M-MuLV First cDNA Synthesis Kit（Promega）
反转录合成 cDNA第一链备用。根据越橘转录组测
序（以果肉和果皮为材料进行 Illumina/Solexa测序，
产生两个文库后进行差异比较分析，得到在果皮中
高表达的 unigenes，数据上传至 NCBI Short Read
Archive数据库，登录号：SRA046311）产生的在果
皮中高表达的序列 Unigene23486（440 bp），通过
ClustalX多重比对确定其保守区，用Primer version 5.0
设计一对特异引物 CHSUnigene23486-F：5GACCG
TCGAGGAAGTCAGGA 3和 CHSUnigene23486-R：5
GCCTTCACAGCAGCCTCTTT 3，以 cDNA为模板，
利用特异引物进行PCR扩增，预期扩增产物片段大
小为 440 bp左右。扩增程序为 94 ℃预变性 5 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃
7 min。扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1 RNA样品完整性分析
通过几种方法的反复摸索，结果发现只有改良
的CTAB法和百泰克试剂盒都能从越橘的果肉和果
皮组织中提取RNA。从琼脂糖凝胶电泳检测的胶
片图上可以看出（见图 1），改良的CTAB法和百泰
克试剂盒所提取的越橘果肉和果皮总RNA呈现两
条带，条带清晰，无明显拖尾现象，说明提取的总
RNA完整性好，纯度高。
2.2 RNA样品纯度和产率检测
对于纯RNA样品，A260/A280比值应为 1.7~2.0，
A260/A230比值应大于 2.0[11]。A260/A280>1.8说明RNA纯
度较好，A260/A280<1.7说明样品中存在蛋白质或酚
类等其他有机物的污染；A260/A230>2.2说明RNA已
经被水解成单核酸，A260/A230<2.0说明RNA样品中
可能存在萜类化合物等次生代谢物的干扰。
使用NanoDrop 2000对RNA样品的浓度和纯度
进行定量分析表明（见表2），百泰克试剂盒提取的
总 RNA的 A260/A280比值在 1.9~2.1之间，A260/A230比
值在 1.5~2.0之间。这可能是由于越橘果实中含有
大量的多糖、多酚类等次生代谢物质，百泰克试
剂盒法无法有效地去除干扰物质的影响，发生轻
微的水解现象。改良的 CTAB法提取的总RNA的
A260/A280的比值在 1.9~2.1之间，A260/A230的比值在
2.0~2.2之间。可见，本试验中改良的CTAB法提取
的总RNA样品纯度较好，既没有蛋白质及其他干
扰物质污染，也没有被水解成单核酸。从RNA浓
图1 改良的CTAB法和百泰克试剂盒提取的RNA琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA isolated by improved CTAB and BioTeke kit
M-Marker DL2000；1-改良的CTAB法，果皮；2-改良的CTAB法，果肉；3-百泰克试剂盒，果皮；4-百泰克试剂盒，果
肉；5-植物总RNA提取试剂盒，果皮；6-植物总RNA提取试剂盒，果肉；7-植物RNAout，果皮；8-植物RNAout，果
肉；9-植物总RNA提取试剂，果皮；10-植物总RNA提取试剂，果肉；11-Trizol试剂法，果皮；12-Trizol试剂法，果肉
M-Marker DL2000; 1-Improved CTAB method, Skin; 2-Improved CTAB method, Pulp; 3-BioTeke kit, Skin; 4-BioTeke kit, Pulp;
5-RNAprep pure, Skin; 6-RNAprep pure, Pulp; 7-Plant RNAout, Skin; 8-Plant RNAout, Pulp; 9-RNAplant plus Reagent, Skin;
10-RNAplant plus Reagent, Pulp; 11-Trizol reagent, Skin; 12-Trizol reagent, Pulp
2000 bp
1000 bp750 bp500 bp
250 bp
100 bp
28 S
18 S 2000 bp
1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp
1 2 M 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
东 北 农 业 大 学 学 报·32· 第43卷
度和产率来看，百泰克试剂盒提取的总 RNA浓
度和产率均低于改良的 CTAB法。植物 RNAout、
Tiangen试剂盒、Tiangen试剂和 Trizol试剂法都没
有从越橘果实中提取出RNA，根据A260/A280和A260/
A230两个比值不难看出，这些方法都存在蛋白质、
酚类以及一些次级代谢物的干扰，进一步说明这
些方法不能够克服越橘成熟果实中多糖和酚类等
次级代谢物质的干扰。
表2 6种方法提取的越橘果实总RNA的纯度与产率比较
Table 2 Comparison of total RNA purity and yield in different tissues of blueberry fruit by six isolation methods
方法Methods
百泰克试剂盒BioTeke kit
植物RNAoutPlant RNAout
Tiangen试剂盒Tiangen kit
Tiangen试剂Tiangen reagent
Trizol试剂法Trizol reagent
改良的CTAB法Improved CTAB
不同组织Different tissues
果肉
果皮
果肉
果皮
果肉
果皮
果肉
果皮
果肉
果皮
果肉
果皮
A260/A280
1.9~2.1
2.0~2.1
1.0~1.2
1.0~1.2
1.0~1.2
1.0~1.2
1.0~1.2
1.0~1.2
1.0~1.2
1.0~1.2
1.9~2.1
2.0~2.1
A260/A230
1.5~1.7
1.8~2.0
<1.0
<1.0
<1.0
<1.0
<1.0
<1.0
<1.0
<1.0
2.0~2.2
2.0~2.2
RNA浓度（ng·mL-1）RNA concentrations
12.0~20.0
31.0~77.0
-
-
-
-
-
-
-
-
80.0~130.0
235.0~420.0
RNA产率（μg·g-1）RNA production
6.0~10.0
20.5~38.5
-
-
-
-
-
-
-
-
8.0~13.0
23.5~42.0
2.3 RT-PCR验证
以百泰克试剂盒和改良的CTAB法所提取的总
RNA 反转录产物 cDNA 为模板扩增由 Illumina/
Solexa测序产生的CHSUnigene23486基因片段。从
图 2中可以看到，在果肉中没有扩增得到目的片
段，而在果皮中得到一个440 bp左右的片段，由于
CHSUnigene23486片段是由 Ilumina/Solexa测序产生
的在果皮中特异表达的序列，所以在果肉中没有检
测到CHSUnigene23486，试验结果与转录组测序结
果一致。同时也说明用百泰克试剂盒和改良的
CTAB法所提取的总 RNA能够满足 RT-PCR等以
RNA为基础的分子生物学研究。
M-Marker DL2000；1-改良的CTAB法，果肉；2-改良的CTAB法，果皮；3-百泰克试剂盒，果肉；4-百泰克试剂盒，果皮
M-Marker DL2000; 1-Improved CTAB method, Pulp; 2-Improved CTAB method, Skin; 3-BioTeke kit, Pulp; 4: BioTeke kit, Skin
图2 越橘果肉和果皮CHSUnigene23486基因片段的RT-PCR扩增
Fig. 2 Amplification of a CHSUnigene23486 fragment by RT-PCR from blueberry pulp and skin
1000 bp
2000 bp
750 bp500 bp
250 bp
100 bp
440 bp
M 1 2 3 4
3 讨论与结论
试验结果表明，①改良的CTAB法和百泰克试
剂盒法都能够完成越橘果实总RNA的提取，而从
两种方法所获得的总 RNA样品的纯度和产量上
看，改良的CTAB法优于百泰克试剂盒法。从提取
的成本上看，百泰克试剂盒要明显高于CTAB法。
而其他 4种方法均不适合越橘果实总RNA的提取。
② 越橘果实中总RNA产率低。原因是越橘果实皮
薄、柔软多汁特点造成果皮和果肉极难分离，在取
裴嘉博等：越橘果实总RNA 提取方法比较研究第10期 ·33·
样过程中RNA易发生降解，或者是越橘果实自身
RNA含量较低。也可能是由于越橘果实中富含多
糖和酚类（如原花色素和花色素等）物质，酚类物质
极易被氧化并能与 RNA稳定地结合，从而影响
RNA的分离纯化。Newbury等发现RNA提取的难易
程度与材料中酚类物质的总量之间相关性不大，主
要是与酚的种类有关，聚合多羟基黄酮醇类物质
（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合
物[12]。
为解决酚类化合物的干扰，在提取缓冲液中加
入较高浓度的PVP（2%）和β-巯基乙醇（2%），不仅
能有效地去除果实中的酚类物质和多糖，还能去除
一些色素物质提高RNA的完整性和纯度。多糖的
许多理化性质与RNA很相似，因此很难将其分开，
在高浓度Na+或K+离子存在的条件下，通过苯酚、氯
仿抽提可以除去一些多糖。Fang等认为缓冲液中含
有高浓度的NaCl有助于去除多糖[13]。本试验提取缓
冲液中NaCl浓度增大到2.0 mol·L-1，增加苯酚和氯
仿的抽提次数，能够去除多糖的干扰。另外，通过
LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中[14]。
针对越橘果实RNA浓度低、产率低的特点，
在 CTAB法提取的过程中，采取加大样品的提取
量，适当增加苯酚、氯仿抽提次数，在用 SSTE溶
解RNA沉淀后，将 10个离心管中的溶液合并成 2
管，增加了RNA的浓度。本试验中百泰克试剂盒
提取的RNA得率低，采取用真空冷冻干燥法将几
次提取的RNA浓缩后增加其浓度，但是试验结果
发现RNA降解严重。虽然经过长时间的摸索找到
了适合越橘果实总RNA提取方法，即改良的CTAB
法，提取的RNA能够满足RT-PCR等以RNA为基
础的分子生物学研究，但相对于其他植物，该方法
提取的RNA样品得率仍低且耗时。因此，在今后
的研究中还有待于进一步优化和完善。
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