全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 2期，第 338-341页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.2, 338-341
技术主题
Technology Feature
平邑甜茶总 RNA提取方法研究
张丽杰 董文轩 *
沈阳农业大学园艺学院,沈阳, 110866
*通讯作者, wxdong63@126.com
摘 要 为探究苹果属富含多糖多酚物质的平邑甜茶总 RNA提取的最优方法，本研究以平邑甜茶的幼嫩
叶片、盛花期子房、花瓣和萼片为材料，利用常规 CTAB法和试剂盒法(TIANGEN生化科技有限公司提供的
RNAprep Pure多糖多酚植物总 RNA提取试剂盒)分别提取平邑甜茶不同器官、组织的总 RNA，并对 RNA
浓度和和电泳图谱进行比较分析。研究结果表明：利用天根生化科技公司提供的多糖多酚植物总 RNA提取
试剂盒可提取到纯度较高，完整性较好的总 RNA，可以用于获取 cDNA全长、RT-PCR及荧光定量 RT-PCR
等分子生物学实验。
关键词 苹果属,平邑甜茶,总 RNA提取
Study of The Extraction Methods of Total RNA from Malus hupehensis
Zhang Lijie Dong Wenxuan *
College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang, 110866
* Corresponding author, wxdong63@126.com
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000338
Abstract To optimize the extract methodology of total RNA from polysaccharides-rich Pingyi Tiancha (M. hu-
pehensis), methods of CTAB & reagent kits (Tiangen RNAprep Kit DP441) were used to extract RNA of different
tissue such as tender leaves, flowering ovary, petals, sepals. The spectrophotometry analysis and agarose gel
electrophoresis was used to evaluate the quality of extraction. The results showed: the total RNAs obtained by
(Tiangen RNAprep Kit DP441) were highly pure and undergirded which is suitable for full-length cDNA clones,
semi-quantitative RT-PCR and Q-PCR.
Keywords Malus Mill., Malus hupehensis Rehd., Total RNA
平邑甜茶 (Malus hupehensis (Pamp.) Rehd. Var.
pingyiensis Jiang)是苹果属湖北海棠(Malus hupehen-
sis Rehd.)的一个变种，原产于中国山东省平邑县，是
典型的三倍体无融合生殖型植物，具有非常高的无
融合生殖能力，其无融合生殖能力达到 95%以上(甄
睿等, 2011)。种子繁殖后代苗木高度整齐，在农业生
产中具有广阔的应用前景。董文轩等(1995)利用矮生
扎矮山定子作父本，与无融合生殖型平邑甜茶杂交
获得了无融合生殖型皱叶矮化株系。王颖等(2008)利
用流式细胞仪方法鉴定其杂交后代无融合生殖能力
显著降低。为探明苹果属无融合生殖发生机理，分析
收稿日期：2013-06-13 接受日期：2013-08-06 网络出版日期：2013-11-20
URL: http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1674-mpbopa
基金项目：本研究由国家自然科学基金(30971975)资助
无融合生殖能力下降的调控机制，需要获取高质量
平邑甜茶的总 RNA才能进行基因克隆、RT-PCR等
下游试验。由于苹果属植物中含有大量的多糖及酚
类物质(王壮伟等, 2004)，并且 Rnase含量丰富，RNA
极易被分离降解，为其分离纯化增加很多困难，严重
影响总 RNA的质量和浓度。目前，关于植物总 RNA
提取方法的报道有很多，但由于植物组织及器官本
身的特异性，不同的研究材料，甚至是同一植物同一
材料的不同发育时期 RNA的提取方法也不尽相同，
均要根据试验分析选取适宜的总 RNA的提取方法
(冯延芝等, 2012)。
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1常规 CTAB 法和 RNAprep Pure Plant Kit 试剂盒法提取
平邑甜茶 RNA
注: 1: 叶片; 2: 子房; 3: 萼片; 4: 花瓣; A: 常规 CTAB 法; B:
RNAprep Pure Plant Kit试剂盒法
Figure 1 Extraction RNA of Pingyi Tiancha (M. hupehensis) us-
ing by conventional CTAB and plant total RNA Kit method
Note: 1: Leaf; 2: Ovary; 3: Sepal; 4: Petal; A: Conventional
CTAB; B: RNAprep Pure Plant Kit
表 1不同方法提取平邑甜茶总 RNA比较
Table 1 Comparison of extracting methods of RNA from but in
Pingyi Tiancha
样品
Sample
叶
Leaf
子房
Ovary
花瓣
Petal
萼片
Sepal
叶
Leaf
子房
Ovary
花瓣
Petal
萼片
Sepal
提取方法
Extraction method
常规 CTAB法
Conventional
CTAB method
RNAprep Pure
Plant Kit试剂盒法
RNAprep Pure
Plant Kit
OD280
0.065 7
0.069 5
0.047 8
0.106 4
0.244 3
0.179 9
0.399 7
0.239 1
OD260/280
2.327 6
1.454 7
2.621 0
2.230 4
2.075 0
1.990 7
1.997 9
1.937 9
不同波长下的吸光值
Absorption values with
different wavelengths
本研究为了获取克隆平邑甜茶无融合生殖相关
基因及 RT-PCR定量表达分析所需的总 RNA，比较
了不同方法对平邑甜茶 RNA提取质量的影响，旨在
筛选出适合苹果属平邑甜茶总 RNA的提取方法，为
深入开展苹果属无融合生殖机理的分子生物学研究
提供理论依据。
1结果与分析
1.1平邑甜茶总 RNA样品完整性检测
以平邑甜茶新萌发的幼嫩叶片、盛花期的子房、
花瓣和萼片为材料，采用常规 CTAB 法 (李贺等 ,
2009)和 RNAprep Pure 多糖多酚植物总 RNA 提取
试剂盒提取总 RNA，并经琼脂糖凝胶电泳检测提取
结果(图 1)。从图 1A可以看出，在电泳图上泳道 2的
RNA出现降解，其他泳道可以看出 28S、18S，但看不
清 5S rRNA谱带；而图 1B用 RNAprep Pure试剂盒
法提取的总 RNA谱带清晰明亮，三条谱带(28S, 18S,
5S)非常清晰，其中 28S和 18S谱带明亮清楚，5S的
谱带暗淡，点样孔正常，说明其多糖去除较为干净，
提取的总 RNA完整性较好，降解较少。另外，从提取
耗时分析，常规 CTAB法提取植物总 RNA需要约
1~2 d的时间，而且获得的总 RNA易降解，为后续分
子实验带来一定难度；而试剂盒法虽然价格贵些，但
是会在 2 h内获得总 RNA，且质量和浓度均能满足
实验所需。
1.2总 RNA纯度和浓度的检测
利用美国 Beckman 公司生产的 DU800核酸蛋
白分析仪检测，分别测得各方法提取的 RNA 样品
的OD230、OD260和 OD280值，并计算样品浓度、OD280和
OD260/280比值。一般认为，OD260/OD280比值是衡量蛋白
质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD260/OD280应在
1.8~2.1之间，比值为 2.0是高质量 RNA的标志，过
低则表明有蛋白质或酚类污染。对检测结果进行比
较分析(表 1)，可以看出，天根生化有限公司 RNA提
取试剂盒提取的 RNA样品纯度较高，能够满足实时
定量要求。
1.3 RT-PCR检测
提取的平邑甜茶总 RNA经反转录后，再设计内
参基因 18S引物进行 PCR扩增，从 PCR产物电泳结
果可以看出，以常规 CTAB法提取的总 RNA反转
cDNA 为模板进行 PCR 扩增得到的条带较为模糊
(图 2A)；而用天根生化公司的试剂盒提取的 RNA反
转的 cDNA为模板进行 PCR扩增得到的条带清晰，
DNA去除干净，无杂质，且长度和预计的目的片段
大小一致，完全可以满足后续实验要求(图 2B)。
2讨论
分离完整性好、高质量的 RNA是基因克隆和表
达分析等分子生物学实验的前提(袁红梅等, 2013)。
339
平邑甜茶总 RNA提取方法研究
Study of The Extraction Methods of Total RNA from Malus hupehensis
图 2不同方法提取的平邑甜茶总 RNA的 RT-PCR检测
注: M: 100 DNA marker; 1:叶片; 2:子房; 3:萼片; 4:花瓣; A:
常规 CTAB法; B:植物总 RNA试剂盒法
Figure 2 RT-PCR detection of total RNA of Pingyi Tiancha (M.
hupehensis) using conventional CTAB method and plant total
RNA Kit method
Note: M: 100 DNA marker; 1: Leaf; 2: Ovary; 3: Sepal; 4: Petal;
A: Conventional CTAB; B: Plant total RNA Kit method
但是对于多年生木本经济植物而言，其植物器官组
织中富含有多糖、多酚类物质，使得该类植物 RNA
的提取相对于其它植物材料要困难很多。目前，已有
多种植物总 RNA提取方法的报道(Ainsworth, 1994)，
这些方法需要根据不同植物组织的特点选取适宜的
提取方法(周亚军等, 2013)。郭翠英等(2007)以葡萄风
信子花瓣为试材采用葡萄 CTAB 法和 SDS法提取
花瓣总 RNA，结果表明改进的 CTAB法可以有效去
除多糖类物质污染，获取高质量的总 RNA。冯延芝等
(2012)利用改良 CTAB法、Trizol法和 2种 RNA提取
试剂盒法分别提取枣花蕾的总 RNA，研究表明利用
奥莱博生物技术有限公司提供的植物 RNA提取试
剂盒法可提取到纯度较高，完整性好的总 RNA。王壮
伟等(2004)研发了一种新的适用于苹果属组培苗茎
叶等组织快速、高效的总 RNA提取方法，该方法可
以在 4 h内获得质量高、完整性好、无 DNA污染的
苹果组培苗的总 RNA。Chang 等(1993)、Ildiko 等
(1999)和窦道龙等(2003)应用 CTAB 抽提法先后从
高度富含次生代谢物质的松树针叶和根、食肉植物
茅膏菜以及棉花中分离出高质量完整的 RNA，但这
种方法需要 1~2 d的操作时间，而且提取 RNA的效
果易受很多因素的影响。本研究中比较了 2种平邑
甜茶不同器官组织总 RNA的提取方法的效果。在提
取植物总 RNA试验操作过程中所有使用的器材等
都要经过高温高压灭菌和 DEPC 水处理，以防止
RNA 提取过程中 Rnase 酶污染引起降解。常规
CTAB可以获得 RNA，但 RNA容易产生降解，而且
在 RT-PCR反转录过程中效果不佳；而 TIANGEN
生化有限公司的 Plant total RNA试剂盒法在常温下
即可操作，操作方法简单，花费时间短，从总 RNA的
浓度和提取质量分析，能够满足后续的基因克隆和
表达分析等下游分子生物学实验要求。
在分子生物学实验中，实时定量表达分析对 RNA
的质量和纯度均要求较高。RT-PCR是检测 RNA质
量是否可用后续试验的常用方法，如果在基因组
RNA样品中含有糖类及酚类等杂质，那么在 RNA
反转录过程中就会受到抑制，导致反转录失败。因
此，制备质量优，完整性好的植物总 RNA是进行分
子生物学研究是否成功的关键(杨成君等, 2008)。
3材料和方法
3.1材料
试验材料为 2012年 5 月初采自沈阳农业大学
果树种质资源圃的平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)
新萌发的幼嫩叶片及盛花期的子房、花瓣和萼片，采
样后立即将试材(大约 0.5~1 g)用锡箔纸包裹，液氮
速冻，保存在-70℃冰箱备用。
3.2主要试剂
主要试剂包括常规 CTAB提取缓冲液及 NaAc，
氯仿 / 异戊醇 (24:1)、乙醇、DEPC 等国产分析纯；
RNAprep Pure Plant Kit DP441 购自 TIANGEN生化
科技有限公司；TaKaRa PrimeScript RT Regant Kit，
研钵、枪头、离心管等经 DEPC水处理后高压灭菌
121℃ 1 h，以抑制 RNA酶的活性。
3.3总 RNA的提取
方法Ⅰ：常规 CTAB法(李贺等, 2009)提取平邑
甜茶总 RNA。
方法Ⅱ：系用 TIANGEN生化科技有限公司生产
的 RNAprep Pure Plant Kit DP441。
3.4 RNA检测
分别取 1 μL RNA 样品稀释 100 倍，用美国
Beckman 公司生产的 DU800 核酸蛋白分析仪上测
定 OD260、OD280，计算检测 RNA的纯度和浓度。同
时将提取的 RNA样品分别加入溴酚蓝混匀后用含
有 EB (0.5 μg/mL)的 1.0%琼脂糖凝胶电泳进行 RNA
完整性检测，在紫外透射仪上观察 RNA分子的大
小、完整性、电泳谱带的清晰度，并用佳能 A610数码
相机拍照。
3.5 RT-PCR分析
根据大连宝生物公司 TaKaRa PrimeScript RT Re-
340
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
gant Kit说明书，以 Oligo dT为引物，以提取的平邑
甜茶总 RNA为模板，反转录合成 cDNA。以 18S为
内参进行 PCR 扩增，PCR 扩增为 25 μL 体系：10×
Buffer 2.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，dNTP
(10 mmol/L) 2.5 μL，cDNA 1 μL，Taq 酶(5 U/L)
0.4 μL，ddH2O 17.6 μL。扩增条件为：94℃预变性
5 min；94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环；
72℃ 5 min，然后将 PCR产物进行电泳检测。
作者贡献
董文轩是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，也是项目的构思者和负责人，完成实验设计，数
据分析，论文的写作和修改；张丽杰完成实验操作、
数据分析和试验结果分析。全体作者都阅读并同意
最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(30971975)资助。感
谢沈阳农业大学园艺学院果树学分子实验室张志宏
教授在本研究过程中的支持与帮助。
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