全 文 ：收稿日期 : 2002210225
基金项目 : 北京市自然科学基金项目 (6982008)的部分研究内容
作者简介 : 张克中 (1968 —) ,男 ,湖北应城人 ,北京农学院教师 ,北京林业大学博士生.
林业科学研究　2003 ,16 (3) :372～375
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2003) 0320372204
辐射百合雄性不育突变体的 RAPD 分析
张克中1 , 赵祥云1 , 陆长旬2 , 黄善武2 , 张启翔3
(11 北京农学院园林系 ,北京　102206 ; 21 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ,北京　100081 ;
31 北京林业大学园林学院 ,北京　100083)
关键词 : 王百合 ;辐射育种 ;雄性不育 ;RAPD 分析
中图分类号 :S68212 + 9 　　　文献标识码 :A
近年来 ,分子标记辅助育种取得了较大进展 ,各种标记方法的广泛使用极大地加快了新品
种的选育速度。随机引物扩增 DNA 多态性分子标记 (RAPD) 因其灵敏度高、速度快 ,可对整个
基因组进行标记且费用和技术难度较低 ,易于应用而倍受青睐[1 ] ,已在植物亲缘关系与品种鉴
定[2～4 ] 、遗传多样性检测[5 ,6 ] 、遗传图谱的构建与基因定位[7 ] 、辅助选择育种[8 ,9 ] 、育种材料的早
期的选择、突变体的鉴定等方面得到了较多的应用[10～13 ] 。
由于突变体是植物基因组 (达 210 ×109 bp) 少数位点发生突变的结果 ,1 个随机引物仅能
检测基因组的极少部分 ,因而突变体的检测相对困难 ,RAPD 分子标记数量大 ,而且在很短时
间内可以探测大量的 DNA 位点 ,为区分突变体提供可能。人们通过 RAPD 鉴定出桃 ( Amygda2
lus persica L. ) [14 ] 、樱桃 ( Prunus avium Thunb. ) [15 ] 、美洲黑杨 ( Populus deltoides Marsh. ) [12 ] 、菊花
( Chrysanthemum morifolium Tzvel . ) [17 ] 、白薯 ( Ipomoea batatas L. ) [18 ] 等植物中发生的各种突变体
便是很好的例证。
1998 —2002 年期间 ,北京农学院园林系与中国农科院蔬菜花卉所合作 ,以60 Co 辐射王百合
( Lilium regale Wilson. )种球 ,辐射后剥取外部鳞片扦插诱发不定芽植株 ,开花时初选出 17 个表
现型突变体 ,其中 13 个为雄性不育突变体。本试验采用 RAPD 分子标记技术 ,对王百合及 13
个表现型雄性不育突变体进行 RAPD 分析 ,旨在从 DNA 水平进行早期筛选 ,淘汰非遗传因素
形成的雄性不育个体 ,确定出真正的雄性不育突变体。
1 　材料与方法
111 　试验材料
王百合及其 13 个表现型雄性不育突变体‘王 1G01’～‘王 1G03’,‘王 2G01’～‘王 2G03’,
‘王 2G05’,‘王 2G07’,‘王 2G08’,‘王 3G01’,‘王 3G03’～‘王 3G05’。
112 　试验方法
11211 　DNA 的提取　取 013 g 百合新鲜嫩叶液氮研磨至粉末。DNA 提取采用 CTAB 法[19 ] 。
11212 　引物 　选用Operon公司生产的随机引物300个 :A01～A20 ,C01～C20 ,D01～D20 ,
F01～F20 ,J01～J20 , K01～K20 ,L01～L20 ,N01～N20 ,P01～P20 ,Q01～Q20 ,R01～R20 ,U01～U20 ,
V01～V20 ,X01～X20 ,Y01～Y20。Marker 采用鼎国生物技术公司生产的 D01522。
11213 　PCR 反应　反应体系为 :25μL 反应体积 ,内含 DNA 模板浓度为 40～100 ng ;10 ×buffer
215μL ;MgCl2 215～315 mmol·L - 1 ;dNTP200μmol·L - 1 ; TaqDNA polymerase 115 单位 (U) ;10 个核
苷酸引物浓度为 1615 ng。扩增反应在 PE480 DNA 扩增仪上进行 ,扩增程序如下 : 94 ℃3 min
预变性 ;94 ℃变性 50 s ,36 ℃复性 40 s ,72 ℃延伸 1 min 20 s ,41 个循环 ;94 ℃变性 50 s ,36 ℃复
性 40 s ,72 ℃延伸 10 min ,1 个循环 ;4 ℃保温。反应物产物在 112 %琼脂糖胶上 (加有 EB) 以
315 V·cm - 1电场强度电泳 210～215 h。紫外检测仪上观察照像。
2 　结果与分析
300 个随机引物中 ,对所有材料能扩增出带的引物有 93 个 ,其中‘王 1G01’、‘王 1G02’、‘王
2G01’、‘王 2G02’、‘王 2G05’、‘王 2G07’、‘王 2G08’、‘王 3G01’、‘王 3G03’、‘王 3G04’‘王 3G05’
与王百合 RAPD 图谱之间没有显著差异。
‘王 2G03’、‘王 1G03’与王百合 RAPD 图谱之间有显著差异 ,能产生稳定多态性差异的引
物有 14 个 (表 1 ,图 1) ,占所用引物的 417 %。由表 1、图 1 可以看出 ,多态性主要表现为两种情
况 :一是不育比可育增加了扩增片段 ,二是不育比可育减少了扩增片段。‘王 2G03’与王百合
相差 21 个多态性位点 ,‘金王二号’与王百合相差 25 个多态性位点。‘王 2G03’与‘金王二号’
相差 21 个多态性位点。可见 ,‘王 2G03’、‘王 1G03’已经在 DNA 组成上发生了改变 ,可确定为
真突变体。‘王 2G03’与‘王 1G03’的扩增图谱也有较大差异 ,说明是两个不同的突变体。
表 1 　不育株与可育株的多态性位点
引物 碱基序列
检测位点
王百合 王 2G03 王 1G03
多态性片段长度Πbp
王百合 王 2G03 王 1G03
A14 TCTGTGCTGG 4 5 5 800 800
A15 TTCCGAACCC 2 2 2 400 600 800
A16 AGCCAGCGAA 3 4 4 600 500 , 700 500 , 700
C11 AAAGCTGCGG 2 3 3 400 700 , 800 400
D02 GGACCCAACC 2 2 2 700 700 400
D11 AGCGCCATTG 6 6 6 1 400 600 600
F16 GGAGTACTGG 3 4 4 1 500 1 500
J12 GTCCCGTGGT 4 3 3 250 , 400
P12 AAGGGCGAGT 3 4 5 800 800 , 1 100
P15 GGAAGCCAAC 4 2 5 1 100 , 1 200 1 000 , 1 100 , 1 200
Q06 GAGCGCCTTG 3 3 3 1 200 1 200 800
Q08 CTCCAGCGGA 2 3 1 1 300 1 000 , 1 300
X09 GGTCTGGTTG 4 3 6 350 , 900 , 1 100 250 , 350 250 , 400 , 900 , 1 000 , 1 100
X14 ACAGGTGCTG 3 3 3 600 600 450
3 　讨论
导致植物雄性不育性的因素是多种多样的。雄性不育性可能是遗传的 ,也可能非遗传的 ,
可能是自发产生的 ,也可能是诱导产生的。
辐射产生的表现型雄性不育突变体 ,可能是基因突变 (遗传因素) 、不良环境条件 (如高温、
干旱、不良光照等非遗传因素)及辐射产生的生物学效应 (诱导因素)等引起的。辐射诱变处理
373第 3 期 张克中等 :辐射百合雄性不育突变体的 RAPD 分析
M代表 Marker D01522 ,0 代表王百合 ,1 代表突变体‘王 2G03’,2 代表突变体‘1G03’
图 1 　王百合及其 2 个雄性不育突变体 RAPD 图谱比较
第一代可检测的一个重要生物学效应就是 M1 或 V1 植株的不育性。这种不育性有各种解释 ,
包括点突变、染色体畸变 (如缺失或易位等) 、细胞质突变和生理效应 ;因而这种不育性可能是
遗传的 ,也可能是非遗传的 (可恢复的) 。
常规检测雄性不育突变体的方法是采用表现型检测 ,如观察雄性器官的形状异常情况、花粉
有无及花粉活力的大小等。由于表现型检测受辐射的后效应、环境及基因型的互作影响 ,检测结
果直观但往往不可靠。DNA 分子标记检测由于直接对基因组进行检测 ,其灵敏性及可靠性都较
高。表现型检测与分子标记检测的结合 ,可以尽早缩小真突变体的选择范围 ,提高了选育效率。
RAPD 分析结果表明 ,其中的 11 个表现型雄性不育突变体 ,目前的 93 个引物扩增的 RAPD
带型与王百合没有差异 ,是否为基因型突变体还有待进一步检测。另 2 个表现型雄性不育突
变体‘王 2G03’、‘王 1G03’与王百合 (可育对照) 的 RAPD 图谱有明显差异 ,初步确定为基因型
突变体 ;但是否为基因型雄性不育突变体 ,还有待进一步研究。因为某些生化突变可能也表现
出 RAPD 标记的多态性 ,但在形态上不一定能识别出来。
通过鳞片扦插把‘王 2G03’、‘王 1G03’繁殖成无性系 ,形成V2 代植株。V2 代植株开花时 ,其
雄性败育情况与 V1 代表现一致 ,并且雄性不育无性系的花器官在内源激素[15] 、同功酶、氨基酸、
蛋白质及糖类与王百合有显著差异 ,因而可基本确定这两个突变体为真雄性不育突变体。可见
RAPD 分子标记检测在雄性不育突变体的早期筛选中起了重要作用。至于这些 RAPD 标记是否
为与雄性不育基因连锁的分子标记 ,将通过杂交及杂交后代的检测作进一步的验证。
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(1) :112～116
RAPD Analysis on Male Sterility Mutant Initiated from Irradiation Lily
ZHANG Ke2zhong1 , ZHAO Xiang2yun1 , LU Chang2xun2 , HUANG Shan2wu2 , ZHANG Qi2xiang3
(11 Department of Landscape and Gardening , Beijing Agricultural College , Beijing 　102206 ,China ;
21 Institute of Vegetable and Flowers , Chinese Academy of Agricultural Science , Beijing 　100081 , China ;
31College of Landscape and Gardening , Beijing Forestry University , Beijing 　100083 , China)
Abstract : RAPD analysis on Lilium regale and its 13 phenotype male sterility mutants initiated from irradiation
bulbs was made by means of 300 random 102mer primers. Of the tested primers , 93 primers produced ideal am2
plification bands on all materials , 14 primers generated stable different polymorphic bands among mutant‘Wang
2G03’、mutant‘Wang 3G03’and Lilium regale. 21 different polymorphic bands were found between‘Wang
2G03’and Lilium regale. 25 different polymorphic bands existed between‘Wang 1G03’and Lilium regale. It
was showed that‘Wang 2G03’and‘Wang 1G03’were two real different male sterility mutants of Lilium regale.
From the 93 primers RAPD bands , the other 11 phenotype male sterility mutants showed no difference in com2
parison with Lilium regale. It was proposed that more test need to be made to identify whether they were real
mutants.
Key words : Lilium regale ; irradiation breeding ; male sterility ; RAPD analysis
573第 3 期 张克中等 :辐射百合雄性不育突变体的 RAPD 分析