全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 2) : 272～ 277
Forest Research
᭛ゴ㓪ো : 1001-1498( 2010) 02-0272-06
咘⠵Ѝ㢅㉝⫳⌏࡯⌟ᅮᮍ⊩ⱘ↨䕗ⷨお
৐ҝཀྵ, ฆ ཬ* , ᅋ຿ඁ, ᄻ ॾ, ᄂͯஜ
(中国林业科学研究院林业研究所 , 国家林业局林木培育重点实验室 , 北京 100091)
ᨬ㽕: 以黄牡丹的新鲜花粉为试材 ,利用单因子试验比较了液体培养基中蔗糖浓度、硼、钙、镁、钾对黄牡丹花粉萌发
的影响 , 在此基础上进行了正交试验 ,比较了蔗糖、H3BO3 及 CaCl2 对黄牡丹花粉萌发的影响 ; 通过对醋酸洋红染色
法、I-KI染色法和 TTC染色法的比较 ,寻找快速测定黄牡丹花粉生活力的方法。试验结果表明: 蔗糖及 H3BO3 对黄
牡丹花粉萌发有极显著影响。在 pH值为 6. 0时,蔗糖 150 g·L - 1 + H3 BO330 mg·L
- 1 + CaCl220 mg·L
- 1适宜黄牡
丹花粉培养 , 萌发率为 68.7% ; 纯水培养没有造成花粉原生质体破裂 , 内含物外流, 但萌发率极低 ,仅为 3% ; 200 g·
L- 1以上的高浓度蔗糖溶液和 300 mg·L - 1以上的高浓度盐溶液会造成原生质体失水萎缩 , 质壁分离 , 这两种情况
都抑制花粉萌发 ; TTC染色法测得的花粉活力率为 64. 9% ,是快速测定黄牡丹花粉生活力的最适染色法。
݇䬂䆡 : 黄牡丹; 花粉;生活力;测定方法
Ё೒ߚ㉏ো : S685.11 ᭛⤂ᷛ䆚ⷕ : A
收稿日期 : 2009-01-15
基金项目 : 科技部 863 项目 ( 2006AA100109, 2007AA10Z182) 及国家林业局 948 项目 ( 2006 -4-C07) 部分研究内容
作者简介 : 律春燕 ( 1984— ) , 女 , 山东青岛人 , 硕士研究生 ,主要从事园林植物应用 , E-mail: lvchunyan84 @ 163 . com
* 通讯作者 :王雁 , 研究员 , 博士生导师 ,从事园林植物应用 , E-mail: wangyan@ caf. ac. cn
Comparison of Methods about Paeonia lutea’s Pollen Viability Determination
LV Chun-yan, WANG Yan
*
, ZHUXiang-tao, ZHOU Lin, ZHENGBao-qiang
( Research Institute of Forestry, Chinse Academy of Forestry; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation,
State Forestry Administration, Beijing, 100091, China)
Abstract: The fresh pollen of Paeonia lutea was employed as experimental material to study the pollen viability. The
effects of different concentration of sucrose, boron, calcium, magnesium and potassium on the germination of P.
lutea’s pollen were compared through simple factorial experiment. Based on these, the orthogonal design was used to
compare the effects of sucrose, boron and calcium on the germination of P. lutea’s pollen. Carmine acetate staining,
I2-KI staining, and TTC staining were compared in order to seek for a fast determination method of P. lutea’s pollen
viability. The results showed that the sucrose and boron had great effects on the germination of P. lutea’s pollen.
Under the optimum pH 6. 0 values, the optimum culture solution was sucrose 150 g·L - 1 + H3BO3 30 mg·L
- 1 +
CaCl2 20 mg·L
- 1 , the germination rate was 68. 7% . When cultured in pure water, the protoplasm of the pollen
wouldn’t split, and the substance inside wouldn’t flow out, but its germination rate was very low. When cultured in
the solution with high concentration of sucrose or salt, the protoplasm would dehydrate and separate from the cell wall.
These two would inhibit the germination of P. lutea’s pollen. And TTC staining showed that the viability rate was
64. 9% which was the optimum staining for the fast determination of P. lutea’s pollen viability.
Key words:Paeonia lutea; pollen; viability; determination method
测定花粉生活力是进行杂交育种的前提。在目
前的科研、生产工作中,常采用染色鉴定法和离体萌
发测定法这 2 种快速有效的检测方法。不同的测定
方法适宜的材料不同,染色鉴定法适用于需要简易而
第 2 期 律春燕等: 黄牡丹花粉生活力测定方法的比较研究
迅速测定出其活力的新鲜花粉,如 Pinillos[ 1 ]、朱惜晨
等[ 2] 只采用染色法分别对农作物、芍药( Paeonia lacti-
flora L. )新鲜花粉原生质体的生活力进行了快速检
测,效果明显,但张颖等 [ 3 ]、王旭军等 [ 4] 在对矮牵牛
( Petunia hybrida L. ) 、台湾桤木( Alnus formosana L. )
的新鲜花粉采用 TTC染色鉴定中,几乎无法使材料着
色;离体萌发测定法对所有贮藏花粉或新鲜花粉都适
宜,此法能测出相对萌发率,其中以离体萌发液体培
养法最为简便,如王兵益等 [ 5]、贾文庆等[ 6 ]、张亚利
等[ 7] 、年玉欣等[ 8] 均采用离体萌发液体培养法分别对
滇牡丹( P. delavayi Franch L. ) 、栽培牡丹( P. suffru-
ticosa L. ) 品种、梅花( Prunus mume L. ) 、百合( Lilium
L. )花粉进行了有效的萌发率测定。
在同一种材料上采用不同的测定方法,其测定
结果也有差异:如王旭军等 [ 4 ]分别采用离体萌发液
体培养法, TTC、I-KI 和过氧化物酶沉淀 3 种染色法
对台湾桤木花粉活力进行测定,其中过氧化物酶沉
淀是最好的测定方法;因此,针对不同的材料选择适
宜的测定方法是实现准确测定的有效途径。
黄牡丹( P. lutea L. )为我国西南特有野生牡丹,
由于其花为黄色,极其珍贵,在杂交育种和鲜切花等
方面成为国内外学者研究的对象。测定黄牡丹花粉
生活力,目前仅见李宗艳等 [ 9] 对其贮藏花粉生活力进
行的 TTC染色和离体萌发测定法的研究;韩丽等 [ 10]
用离体萌发液体培养法测定其新鲜花粉生活力,以此
来确定适宜的花粉采集时期和花粉培养时间,但对新
鲜花粉适宜的萌发条件和最佳的染色鉴定法没有一
致的探讨与比较。本试验采用液体培养基,研究了蔗
糖、硼、钙、镁、钾等因素对其萌发的影响,以期找出更
适宜萌发及用于生活力测定的培养液,并比较了醋酸
洋红、I-KI和 TTC 3 种染色法的染色效果,以便获得
测定黄牡丹花粉生活力的快速有效方法,为有效开展
黄牡丹杂交育种提供技术支撑。
1 ϫॸူֺ֥
1. 1 䆩偠ᴤ᭭
2008 年 4 月于昆明采集黄牡丹含苞待放时的
花药,带回室内将其阴干,收集散出的花粉,于当天
进行花粉生活力测定。
1. 2 䆩偠ᮍ⊩
1. 2. 1 ტൺc଑cءcਣcޫ Ӧ࿙ᆐଁཱྀྡԅ༪႔
将蔗糖培养液设 0、50、100、150、200、250、300 g·
L- 1 7 个浓度梯度,将 H3 BO3、CaCl2、MgSO4、KNO3 4
种培养液各设 5、10、20、30、40、50、100、200、300 mg
·L - 1 9 个浓度梯度。每种培养液观测 5 个玻片,每
个凹孔观察 100 粒花粉,共观测 5 000 粒花粉。具体
试验方法参考年玉欣等 [ 8 ]的方法。
1. 2. 2 տ࿙ᆐଁཱྀྡԅ༪႔ 在单因子试验的基
础上, 选取对黄牡丹花粉萌发影响较大的蔗糖、
H3 BO3 和 CaCl2 ,各设 5 水平,培养液 pH 6. 0
[ 11 ]
,采
用 L2 5( 5
6
) 的正交试验设计( 表 1) 。将花粉与含有
蔗糖和矿质元素的不同培养液充分混合,具体试验
方法同 1. 2. 1。
㸼 1 ಴㋴Ϣ∈ᑇⱘ䗝ᢽ
水平
蔗糖 / ( g·L - 1 )
A
H3BO3 / ( mg·L
- 1 )
B
CaCl2 / ( mg·L
- 1)
C
0 50 10 10
1 100 20 20
2 150 30 30
3 200 40 40
4 250 50 50
注 : A、B、C分别表示蔗糖、H3 BO3、CaCl2 3 因素。
1. 2. 3 ܝט௹ౄޔԅ༪႔ 用 1% 的醋酸洋红、
5%的 I-KI和 5 g·L - 1的 TTC分别对黄牡丹花粉进
行染色。具体试验方法参考张颖等 [ 3 ]的方法。每种
染色法做 4 个重复,各观测 4 000 粒左右花粉,统计
花粉活力率, 以 150 g· L- 1 蔗糖 + 30 mg· L- 1
H3 BO3 +20 mg·L
- 1 CaCl2 培养液法测得的花粉萌
发率为对照,作为花粉活力的测定标准,进行黄牡丹
花粉生活力快速有效测定方法的比较。
2 ࠒڴူד๥
花粉在不同培养液中培养 1 h,均有花粉萌发,
且基本在 4 h后萌发率均趋于稳定。
2.1 㫫㊪⌧ᑺᇍ咘⠵Ѝ㢅㉝㧠থⱘᕅડ
以不同浓度的蔗糖溶液培养花粉, 花粉的萌发
率呈现单峰变化趋势 ( 图 1) ,浓度为 150 g·L - 1时
花粉萌发率最高,达 20. 2% , 萌发情况见图 2a。李
宗艳 [ 9 ]报道蔗糖浓度为 140 g·L - 1时黄牡丹贮藏花
粉的萌发率最高,说明新鲜花粉的含水量比贮藏花
粉的高,且代谢旺盛,需要的能量更多, 所以适宜二
者萌发的蔗糖浓度也不同。在水中培养的花粉萌发
率仅为 3% ,萌发情况见图 2b,说明花粉萌发需要消
耗能量。蔗糖溶液为 200、250、300 g·L - 1时, 花粉
的萌发率较低,分别为 17. 3%、14. 5%、9. 7% ,部分
花粉原生质体脱水( 图 2c) ,说明蔗糖浓度过高致使
原生质体脱水,花粉萌发受到抑制。
372
林 业 科 学 研 究 第 23卷
图 1 花粉在不同浓度蔗糖溶液中的萌发率
2. 2 ⷓ⠽䋼ঞᖂ䞣ܗ㋴ᇍ咘⠵Ѝ㢅㉝㧠থⱘᕅડ
从图 3、4 分别可以看出: 硼离子对花粉的萌发
率影响较大,并且花粉管生长快且长( 图 5a) ,钙、镁
和钾的影响较小,花粉萌发量少且花粉管短(图 5b、c、
d) ,与张颖[ 3] 报道的矮牵牛花粉在含硼的培养液中的
萌发率远高于含有钙、镁、钾培养液的萌发率相一致,
证明硼对花粉萌发、花粉管伸长有显著的促进作用。
H3 BO3 单独应用时呈单峰变化趋势,以浓度 30
mg·L - 1最好,萌发率为 31. 8% ; 30 ～ 50 mg·L- 1
浓度范围内萌发率急剧下降, 下降至 15% 左右;浓
度超过 50 mg·L - 1 ,萌发率下降缓慢(图 3)。
Ca2 + 主要影响花粉萌发速度和花粉管生长速
度,低 Ca2 +不利于花粉管生长, 而高 Ca2 +抑制花粉
萌发速度和花粉管生长, CaCl2 单独应用时, 在 0 ～
200 mg·L - 1范围内 Ca2 + 浓度对黄牡丹花粉的萌发
率影响不大,其萌发率在 14%左右,其中以 40 mg·
L - 1为最好, 但浓度高于 200 mg·L - 1时, 萌发率快
速下降( 图 4) 。
a. 150 g·L - 1蔗糖培养液 ( ×200) b. 纯水 ( ×400) c.高浓度蔗糖溶液 ( ×400)
图 2 花粉在不同浓度蔗糖溶液中的萌发情况
图 3 花粉在不同浓度 H3BO3 溶液中的萌发率 图 4 花粉在不同浓度钙、镁、钾溶液中的萌发率
镁和钾是植物生长发育的必需元素, MgSO4、
KNO3 单独应用时均呈现单峰变化趋势,最适浓度均
为 40 mg·L - 1 ,萌发率分别为 11. 7%和 5. 5% ,到达
最高点之后急剧下降,浓度为 300 mg·L - 1时,萌发
数均为 0(图 4)。钙、镁、钾盐的浓度过高( 大于 300
mg·L - 1 ) 导致花粉原生质失水发生质壁分离现象,
未见花粉管生长(图 5e) 。
2.3 㫫㊪ǃ⹐ǃ䩭 3಴ᄤℷѸ䆩偠ᇍ㢅㉝㧠থⱘ
ᕅડ
从表 2 可知:蔗糖、H3 BO3、蔗糖 ×H3 BO3、蔗糖
×CaCl2 和 H3 BO3 ×CaCl2 对花粉萌发率的影响极显
著, CaCl2 对花粉萌发率的影响并不显著。最佳培养
液组合为 13 号,即蔗糖 150 g·L - 1 + H3 BO330 mg·
L - 1 + CaCl220 mg·L
- 1 ,用该培养基 养,花粉萌发
472
第 2 期 律春燕等: 黄牡丹花粉生活力测定方法的比较研究
a. 30 mg·L - 1 H3BO3 培养液 ( ×200) b. 40 mg·L
- 1 CaCl2 培养液 ( ×200)
c .镁溶液 ( ×400) d. 钾溶液 ( ×400) e. 高浓度盐溶液 ( ×400)
图 5 花粉在矿物质及微量元素溶液中的萌发情况
率高达 68. 7% ,无异常现象 ( 图 6) ;较好的组合为
12、14 号,即蔗糖 150 g·L - 1 + H3BO320 mg·L
- 1
+
CaCl210 mg·L
- 1、150 g·L - 1 + H3 BO340 mg· L
- 1
+ CaCl230 mg·L
- 1 ,这 2 种培养基的花粉萌发率
分别为 45. 4%、50. 0% ;最差的组合为 25 号,即蔗糖
250 g· L - 1 + H3 BO350 mg· L
- 1
+ CaCl230 mg·
L - 1 ,花粉萌发率仅为 9. 3% (图 7)。
㸼 2 咘⠵Ѝ㢅㉝㧠থⱘℷѸ䆩偠㒧ᵰ
试验号 A B A×B C A ×C B×C 萌发花粉数 /个 萌发率 /%
1 0 0 0 0 0 0 160 16. 0 H
2 0 1 1 1 1 1 213 21. 3 F
3 0 2 2 2 2 2 332 33. 2 E
4 0 3 3 3 3 3 291 29. 1 E
5 0 4 4 4 4 4 157 15. 7 H
6 1 0 1 2 3 4 201 20. 1 F
7 1 1 2 3 4 0 382 38. 2 D
8 1 2 3 4 0 1 464 46. 4 C
9 1 3 4 0 1 2 328 32. 8 E
10 1 4 0 1 2 3 192 19. 2 G
11 2 0 2 4 1 3 243 24. 3 F
12 2 1 3 0 2 4 454 45. 4 C
13 2 2 4 1 3 0 687 68. 7 A
14 2 3 0 2 4 1 500 50. 0 B
15 2 4 1 3 0 2 217 21. 7 F
16 3 0 3 1 4 2 212 21. 2 F
17 3 1 4 2 0 3 388 38. 8 D
18 3 2 0 3 1 4 531 53. 1 B
19 3 3 1 4 2 0 280 28. 0 E
20 3 4 2 0 3 1 174 17. 4 G
21 4 0 4 3 2 1 125 12. 5 I
22 4 1 0 4 3 2 198 19. 8 G
23 4 2 1 0 4 3 301 30. 1 E
24 4 3 2 1 0 4 139 13. 9 I
25 4 4 3 2 1 0 93 9. 3 J
MS 11 052. 29 18 290. 59 19 223 . 42 442. 8 11 152. 66 17 859 . 6
F 18. 72* * 30. 98 * * 32 . 56 * * 0. 75 18. 89* * 30 . 25 * *
注 : A ×B、A×C、B×C分别表示两两因素间的相互作用 ,每处理测定的花粉数均为 1 000 粒 , F0. 01 = 16 . 0, 不同大写字母表示差异极显著 ,
A、B、C分别代表蔗糖、H3BO3、CaCl2。
572
林 业 科 学 研 究 第 23卷
图 6 最佳培养液组合中的花粉萌发情况 ( ×200 ) 图 7 最差培养液组合中的花粉萌发情况 ( ×400)
2. 4 咘⠵Ѝ㢅㉝ᶧ㡆ࠖⱘㄯ䗝
试验发现,采用醋酸洋红染色,花粉粒均被染成
红色,采用 I-KI染色,基本为黄褐色, 这两种方法均
无法判定花粉有无活力;而 TTC染色法能使有活力
的黄牡丹花粉着色, 呈红色, 染色率为 64. 9% ( 图
8) ,而李宗艳等 [ 9 ] 对来源于大理花甸、中甸那帕海、
嵩明梁王山等地的 4 个不同的黄牡丹居群的研究表
明,在贮藏 30 d 时黄牡丹的花粉平均着色率约为
85% ,高于本试验新鲜花粉的着色率,推断是所采的
居群不同所致花粉着色率的差距。
图 8 TTC染液中的花粉着色情况 ( ×200)
用 TTC染色法所测得的黄牡丹花粉活力率与
最适培养液法测得的萌发率结果基本一致。最适培
养液法为黄牡丹提供了最适宜的萌发条件,当在授
粉前需要对花粉生活力进行快速测定时,该方法有
局限性;因此,在实际应用中, TTC染色法是测定黄
牡丹花粉生活力的快速方法。
3 ࠒৢူඉৢ
蔗糖能影响花粉的萌发,适宜的蔗糖浓度 ( 150
g·L - 1 ) 能促进黄牡丹花粉的萌发。蔗糖浓度适宜
可缓解花粉破裂, 如果浓度不适宜则花粉发育不
良 [ 1 2]。在水中( 对照) 培养的花粉有少数萌发,这与
年玉欣 [ 8 ]报道的百合花粉在水中培养时出现原生质
体脱离、花粉粒外壳和内含物外流的现象不一致,推
断是由于植物材料、生活环境的不同导致结果有差
异;若浓度过高,会造成原生质体脱水,抑制萌发,蔗
糖浓度高于 200 g·L - 1时改变了花粉管壁的透性,
导致代谢物和离子泄露在培养基里, 这对花粉萌发
不利。本试验研究结果表明, 蔗糖浓度为 150 g·
L - 1时最有利于黄牡丹新鲜花粉的萌发。
硼能促进糖的吸收与代谢,且有利于花粉管壁
的形成,可以减少花粉破裂,显著提高花粉的萌发
率, 并促使花粉管生长伸长 [ 13 ]。本试验表明, 黄牡
丹花粉萌发的适宜 H3 BO3 浓度为 30 mg·L
- 1 ,李宗
艳等 [ 9 ]报道的最适 H3 BO3 浓度为 70、80 mg·L
- 1 ,
这是由新鲜花粉与贮藏花粉的吸收代谢等方面的差
异所致。
Ca2 +诱导花粉管产生一定的趋向性,可以保持
顶端的极性生长,使花粉管朝 Ca2 +浓度高的方向生
长。前人还没有对黄牡丹进行这方面的研究, 本试
验结果表明: Ca2 +浓度为 0 ～ 200 mg·L - 1时,单独
用于黄牡丹花粉萌发的作用不明显,以 40 mg·L- 1
浓度最佳, 高于 300 mg· L - 1 时抑制其萌发。当
Ca2 +与糖和硼同时用,作用也不显著,但由于 3 因素
间的交互作用,以 20 mg·L - 1浓度最佳。
镁在核酸和蛋白质代谢中起重要作用,钾在碳
水化合物代谢、呼吸作用及蛋白质代谢中起重要作
用,是构成细胞渗透势的重要成分。镁和钾在影响
花粉萌发方面的作用不显著,本试验结果表明: 镁、
钾浓度各为 0 ～ 200 mg·L - 1时,单独用于黄牡丹花
粉萌发的作用不明显,高于 300 mg·L- 1时抑制其萌
发。
本试验通过正交设计,筛选出最适宜黄牡丹花
粉萌发的液体培养基是 150 g·L- 1 + H3 BO330 mg·
672
第 2 期 律春燕等: 黄牡丹花粉生活力测定方法的比较研究
L
- 1
+ CaCl220 mg·L
- 1
, 由于用离体培养法来测定
黄牡丹花粉活力需要提供花粉萌发所需要的特定条
件,且需要进行多次重复试验来确保结果的准确性,
所以在实际应用中该方法不适宜用于授粉前的快速
测定。本试验结果表明,用 TTC染色法测得的黄牡
丹花粉活力率与最适培养液法测得的萌发率的结果
基本一致, TTC染色法是黄牡丹花粉生活力快速有
效的测定方法, 其操作程序简单快捷, 可以单独
使用。
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