全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (6) : 739～743
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0620739205
云南红豆杉简并锚定微卫星 2PCR反应体系优化研究
缪迎春 , 苏建荣 3 , 张志钧
(中国林业科学研究院资源昆虫研究所 ,云南 昆明 650224)
摘要 :采用交互正交设计 L64 (421 )对濒危植物云南红豆杉简并锚定微卫星 2PCR反应体系分别进行了 5因素 ( Taq
酶 ;Mg2 + ; dNTP; DNA及引物 ) 4水平的优化筛选 , SAS软件统计分析表明 : 3个单因素 ( Taq酶 ; Mg2 + ; dNTP)和 2个
交互作用 ( Taq ×Mg2 + ,Mg2 + ×dNTP)对此反应体系有显著影响作用。云南红豆杉简并锚定微卫星 - PCR反应的优
化体系是 :在 20μL反应体系中含有 1 ×PCR buffer, Taq酶 4 U,Mg2 + ( 2. 0 mmol·L - 1 ) , dNTP ( 0. 4 mmol·L - 1 ) ,
DNA 75 ng,引物 (1. 0μmol·L - 1 ) ,退火温度 (54 ℃)。交互正交设计既能快捷有效地筛选出最佳 PCR反应体系 ,
又能揭示试验因素及其交互作用对扩增的影响程度 ,分析结果更客观、准确 ,具有一定的应用价值。
关键词 :云南红豆杉 ;简并锚定微卫星 - PCR;反应体系 ;交互正交设计
中图分类号 : S718. 4 文献标识码 : A
收稿日期 : 2007205216
基金项目 : 科技部科研院所公益研究专项项目“濒危植物云南红豆杉的资源及保护技术研究 ”( 2004D IB3J104)和国家科技支撑项目
“特种工业原料林培育技术”(2006BAD18B03)的部分研究内容
作者简介 : 缪迎春 (1972—) ,女 ,云南通海县人 ,硕士 ,助理研究员.3 通讯作者
O ptim iza tion for SSR2anchored PCR Reaction System
in Endangered Plan t Taxus yunnanensis
M IAO Ying2chun, SU J ian2rong, ZHANG Zhi2jun
(Research Institute of Resource Insects, CAF, Kunm ing　650224, Yunnan, China)
Abstract: The interaction among different factors was usually ignored during experimental design with orthogonal de2
sign which was widely used in op tim izing for PCR reaction system. O rthogonal design L64 (421 ) involving interaction
was used to op tim ize simp le sequence repeated2anchored PCR by degenerate p rimer( SSR2 anchored PCR) amp lifi2
cation system on T. yunnanensis in five factors: Taq DNA polymerase, Mg2 + , dNTP, DNA and p rimer at four levels.
The analytic results by software SAS showed that: ①Three factors( Taq DNA polymerase, Mg2 + , dNTP) and the two
interactions ( Taq ×Mg2 + , Mg2 + ×dNTP) had notable effect on the SSR2anchored PCR amp lification system; ②An
op timal SSR2anchored PCR reaction system was established containing 1 ×PCR buffer, 4 U Taq DNA polymerase,
2. 0 mmol·L - 1Mg2 + , 0. 4 mmol·L - 1 dNTP, 75 ng DNA , 1. 0μmol·L - 1 p rimer in a total volume of 20μL reac2
tion system. Moreover the op timal annealing temperature (54 ℃) was p roposed by gradient PCR. O rthogonal design
involving interaction is of special app lication value as it can not only screen out the best PCR reaction system quickly
and effectively, but also reveal the extent to which the testing factors and their interaction can affect the PCR amp li2
fication, and thus make the analytic result more objective and accurate. W hile, further research of the judgmental
standard to the electrophoretogram of PCR amp lification p roducts is still needed to imp rove both the facility of the
method and the reliability of experimental data.
Key words: Taxus yunnanensis; SSR2anchored PCR; Reaction system; O rthogonal design involving interaction
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
简并锚定微卫星 2PCR ( Simp le Sequence Repeat2
anchored PCR by degenerate p rimer) 亦称 SSR2an2
chored PCR [ 1 ]是简单重复序列区间 ( Inter2Simp le
Sequence Repeat, ISSR ) 标记技术的 3 种方式之
一 [ 2～4 ] ,其基本原理是在不同简单重复序列的 5’或
3’端锚定数个简并碱基形成单一引物 ,对两个相距
较近 ,方向相反的微卫星 ( Simp le Sequence Repeat,
SSR)及两 SSR序列间的 DNA序列进行扩增 [ 1 ]。由
于简并锚定微卫星 2PCR具有特异性高、重复性强 ,
可防止引物与 DNA模板结合时发生滑动 ,避免扩增
产物电泳时涂布现象发生 [ 5 ]等优点 ,从而保证了
PCR扩增产物基因组中相应 SSR位点的实际长度。
目前 ,简并锚定微卫星 2PCR技术现已广泛用于品种
鉴定 [ 3～6 ]、遗传作图 [ 7～8 ]、基因定位 [ 9 ]、分类、进化及
遗传多样性 [ 10 ]等方面的研究。另一方面 ,简并锚定
微卫星 2PCR技术是 SSR引物研发方法中较快捷有
效、经济实用的方法 [ 2, 11 ] ,在适宜的 PCR扩增体系
下 ,能在一次 PCR产物中寻找到基因组中 2个以上
位点的不同组分微卫星 ,而且扩增每一个位点微卫
星只需合成一个引物 ,从而降低了寻找基因组中微
卫星及开发相应引物的费用。
云南红豆杉 ( Taxus yunnanensis Cheng et L. K.
Fu)因富含抗癌物质紫杉醇、分布广、资源相对丰富
而成为我国紫杉醇生产的主要树种 [ 12 ]。20世纪 80
年代以来 ,云南红豆杉的保护倍受重视 ,保护级别不
断攀升 ,分别于 1986年、1993年和 1999年被列为云
南省二级保护植物、林业部二级保护植物和国家一
级保护植物。云南红豆杉遗传多样性的研究也随之
受到重视 , 但仅见等位酶和同功酶水平的研
究 [ 13, 14 ] , DNA水平的遗传多样性研究亟待加强。鉴
于此 ,本文采用交互正交试验设计方法建立和优化
云南红豆杉简并锚定微卫星 2PCR反应体系 ,以期为
开展分子水平的遗传多样性研究和开发 SSR引物奠
定基础 ,促进云南红豆杉保护遗传学研究的深入
进行。
1　材料与方法
1. 1　材料来源
云南红豆杉叶片于 2005年 5月采自云南省大
理州鹤庆县 ,采用硅胶低温 ( - 20 ℃)保存 ,提取
DNA作为简并锚定微卫星 2PCR反应体系的模板。
简并锚定微卫星 2PCR 试验所用的 Taq 酶、
dNTP、Mg2 +均购自上海申能博彩生物科技有限公
司 ,经初步筛选的 5’简并锚定引物 5’2NNVRVRV
(CT) 6 23’作为本研究的固定引物。
1. 2 总 D NA的提取与浓度测定
采用 CTAB微量法 [ 15 ]用经硅胶低温干燥的嫩
叶片提取基因组 DNA,用 Beckman DU800核酸蛋白
质分析仪测定总 DNA浓度 ,根据 PCR反应体系的
需要稀释至 15 ng·uL - 1。
1. 3 PCR反应正交设计与扩增程序
1. 3. 1　正交设计 简并锚定微卫星 2PCR是由简并
碱基和某一重复序列两部分组成的单一引物所进行
的 PCR标记 ,反应条件主要受 Taq酶、Mg2 + 、dNTP、
DNA和 Primer的影响 [ 16 ] ,故选其作为试验因素 ,分
别以 A、B、C、D、E代表 ,并通过预备试验确定实验
因素浓度范围。本研究设计的试验因素及其水平如
表 1所示。由于 Taq酶和 Mg2 + 、Mg2 +和 dNTP之间
可能存在着交互作用 [ 17, 18 ] ,所以选用 L64 ( 421 )表进
行有交互作用的正交试验设计 ,试验共 64个处理 , 2
次重复。
表 1 PCR反应的因素与水平
水平
PCR反应因素
Taq酶 (A) Mg2 + (B) dNTP (C) DNA (D) Primer(E)
1 1. 5 1. 5 0. 2 60 0. 3
2 2. 0 2. 0 0. 3 75 0. 7
3 3. 0 3. 0 0. 4 90 0. 8
4 4. 0 4. 0 0. 5 105 1. 0
　　注 : Taq酶的单位为 U· (20μL) - 1 ; Mg2 +和 dNTP的为 mmol·
L - 1 ; DNA的为 ng· (20μL) - 1 ; Primer的为μmoL·L - 1。
1. 3. 2　PCR扩增程序 　20μL反应体系在 MJ2PTC
200 DNA扩增仪上扩增 ,初步反应程序为 94 ℃预变
性 4 m in; 94 ℃变性 1 m in, 50 ℃退火 1 m in, 72 ℃延
伸 1 m in,循环 35次 ; 72 ℃延伸 10 m in; 4 ℃保存。
PCR扩增产物通过 1. 5%琼脂糖电泳 ,采用 UVP
GDS28000凝胶成像系统拍照分析。
1. 4 优化体系的建立
1. 4. 1 优化组合筛选 参照文献 [ 19, 20 ]的方法
和标准对 PCR扩增图谱进行评分 ,主要以图谱中主
带的多少、清晰度、重复性对各处理扩增结果记分。
条带数量丰富、清晰度高和背景低的最佳产物记为
33分 ,与此相反 ,最差的记为 0分 ,分值范围 0～33,
然后通过直观分析、方差分析筛选试验因素的最优
反应组合水平。
1. 4. 2 退火温度确定 选用正交试验结果分析、
047
第 6期 缪迎春等 :云南红豆杉简并锚定微卫星 2PCR反应体系优化研究
选定的最优反应组合 ,用 MJ2PTC 200 DNA扩增仪
自动生成在 46～66 ℃间的 12个温度进行 PCR扩
增。通过电泳图谱的直观比较筛选出引物 5’2
NNVRVRV (CT) 6 23’的最佳退火温度 ,组成优化反
应体系。本试验设置的 12个温度为 46. 0、46. 5、
47. 7、49. 2、51. 5、54. 4、57. 8、61. 7、62. 8、64. 4、
65. 6、66. 0 ℃。
1. 4. 3 稳定性检验 采用各因素最优反应水平组
合和最佳退火温度进行同一个模板、同一条引物、不
同批次的 7次重复实验 ,以验证 PCR优化反应体系
的稳定性和可靠性。
1. 5 数据分析
采用 SAS 9. 0软件对 2次重复的评分结果进行
方差分析 ,确定影响反应的关键因素、具显著交互作
用的因素及其最佳反应水平组合。
2　结果与分析
2. 1 交互正交试验结果与分析
2. 1. 1 电泳结果及其评分的直观分析 按照交互
正交设计 L64 (421 )进行 64组 PCR扩增 ,将扩增产物
通过 1. 5%的琼脂糖电泳。2次扩增试验产物的电
泳图谱见图 1。
图 1 64个处理的 PCR产物电泳图谱
注 :M为标准分量 SM0321, 1～64为试验处理号。
　　根据打分结果计算不同因素各水平电泳评分平
均值和极差 (表 2)。
表 2 不同因素与水平的电泳评分平均值和极差
水平 Taq酶 (A) Mg2 + (B) dNTP (C) DNA (D) Primer( E)
1 13. 59 10. 88 16. 47 12. 59 11. 63
2 9. 16 19. 78 11. 78 13. 41 12. 75
3 15. 94 12. 09 12. 53 12. 50 12. 78
4 11. 69 7. 63 9. 59 11. 88 13. 22
极差 6. 78 12. 16 6. 88 1. 53 1. 59
表 2表明 ,极差的大小顺序为 : Mg2 + > dNTP >
Taq酶 > Primer > DNA。因此 ,可以判断 Mg2 +的影
响最大 ,是反应体系中的关键因子 ; dNTP的影响次
之 ,居第 2位 ; Taq酶的影响居第 3位 ; DNA和 Prim2
er的极差都很小 ,约为 Mg2 + 极差的 1 /10,它们对
PCR扩增的影响也很小。各因素最高平均值对应的
水平组合 A3B2C1D2E4即为直观分析初步筛选的
最优组合 ,但是 ,该组合没有考虑交互作用 ,不能准
确反映各因素的作用。因此 ,需要分析因素间的交
互作用及其影响才能确定最优组合 ,故下面将进一
步进行方差分析。
2. 1. 2 电泳评分结果的方差分析 　电泳结果评分
值的方差分析表明 , Taq酶、Mg2 +和 dNTP各水平的
差异达极显著水平 ( p = 0. 01) , DNA和 Primer的 F
值仅 0. 70和 0. 82,差异均不显著 ( p = 0. 05)。为提
高假设检验的灵敏度 ,将 DNA和 Primer的方差合并
入误差项 [ 21 ]得到方差分析表 (表 3)。
由表 3可知 , Taq酶、Mg2 + 、dNTP、Taq酶 ×Mg2 +
和 Mg2 + ×dNTP的 F值大小顺序为 Mg2 + >Mg2 + ×
dNTP > Taq酶 > dNTP > Taq酶 ×Mg2 + ,并且 Mg2 +与
Taq酶、dNTP的交互作用达极显著水平 ( p = 0. 01)。
因此 ,应根据 Mg2 +与 dNTP的交互作用选定 Mg2 +与
dNTP的浓度 ,然后根据选定的 Mg2 +浓度与 Taq酶
交互作用确定 Taq酶浓度 ,再根据与 DNA和 Primer
最大平均值对应的水平数确定其浓度 ,从而筛选出
147
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
PCR反应各因素的最优组合。
表 3 PCR反应中各因素的方差分析
变异来源 自由度 方差 均方 F值
Taq酶 3 794. 19 264. 73 14. 853 3
Mg2 + 3 2 545. 69 848. 56 47. 593 3
dNTP 3 789. 75 263. 25 14. 763 3
Taq酶 ×Mg2 + 9 780. 00 86. 67 4. 863 3
Mg2 + ×dNTP 9 3 422. 19 380. 24 21. 333 3
误差 100 1 783. 06 17. 83
　　注 : 3 3 表示在 0. 01水平上差异极显著。
表 4为 Mg2 +与 Taq酶、dNTP的交互作用下的
电泳结果评分平均值。由表 4可知 ,在 Mg2 +浓度取
2水平 , dNTP浓度取 3水平时 ,电泳评分平均值最
高 ,达 26. 38;在 Mg2 +取 2水平的条件下 , Taq酶浓
度取 4水平时 ,电泳评分的平均值最高 ,达 23. 00。
从表 2可知 , DNA浓度为 2水平时 ,电泳评分平均值
最高达 13. 41; Primer浓度取 4水平时 ,电泳评分平
均值最大 ,达 13. 22。因此 ,云南红豆杉简并锚定微
卫星 2PCR反应体系的最适条件应为 A4B2C3D2E4,
即 Taq酶浓度为 4 U· (20μL ) - 1 ,Mg2 +浓度为 2. 0
mmol·L - 1、dNTP浓度为 0. 4 mmol·L - 1、DNA浓度
为 75 ng· ( 20 μL ) - 1、Primer浓度为 1. 0 μmol·
L - 1。该组合 (A4B2C3D2E4)为 55号处理 ,与直观
分析得出的结果 (A3B2C1D2E4)并不一致 ,其原因
是直观分析忽略了因素间的交互作用。图 1表明 ,
55号处理的 PCR扩增产物的电泳效果最好 ,得分值
也最高。可见 ,考虑交互作用分析得出的结果能客
观地反映试验结果 ,忽视因素间的交互作用会导致
分析结果产生偏差。据此 ,初步确定 55号处理为反
应的优化组合。
表 4 M g2 +与 Taq酶、dNTP交互
作用下的电泳评分平均值
Mg2 +
水平
Taq酶
1 2 3 4
dNTP
1 2 3 4
1 9. 38 10. 38 13. 25 10. 50 24. 75 13. 50 4. 25 1. 00
2 20. 88 15. 00 20. 25 23. 00 23. 25 18. 75 26. 38 10. 75
3 15. 13 6. 00 20. 25 7. 00 9. 75 10. 00 13. 63 15. 00
4 9. 00 5. 25 10. 00 6. 25 8. 13 4. 88 5. 88 11. 63
2. 2 PCR扩增退火温度的确定
退火温度的高低直接影响引物与 DNA的特异
性结合。根据方差分析优选出的 55号 PCR扩增体
系 (A4B2C3D2E4)进行退火温度的筛选试验。在
MJ2PTC 200 DNA扩增仪自动生成 12个温度 (最小
设置为 46 ℃,最大设置为 66 ℃) , PCR结果用 1. 5%
琼脂糖电泳检测。
图 2表明 , 54 ℃下的 PCR反应结果不仅主带清
晰 ,而且特异性高 ,是反应的最佳退火温度。退火温
度过低时 (46～49 ℃) ,非特异性扩增多 ,特意性扩
增 (主带 )不明显和发生缺失 ;而在退火温度过高时
(62～66 ℃) ,则扩增不出任何条带。
图 2 不同退火温度 PCR产物电泳图谱
注 : 1～12分别代表退火温度 46. 0、46. 5、47. 7、49. 2、
51. 5、54. 4、57. 8、61. 7、62. 8、64. 4、65. 6、66. 0 ℃;
M为标准分量 SM0321。　　　 　　　　　　　
2. 3 稳定性验证和最优 PCR体系确定
采用 55号处理 (A4B2C3D2E4)的最优组合在
54 ℃退火温度下重复试验 7次检验 PCR扩增产物
的稳定性 ,图 3为 PCR扩增产物电泳图谱。
图 3表明 , 7次重复试验的电泳图谱基本一致 ,
每次试验电泳图谱的主带明显 ,清晰度高 ,具有很好
的重复性和稳定性。在后续实验中 ,采用该优化体
系 ,利用简并引物 5’2NNVRVRV (CT) 6 23’成功地找
到 32个云南红豆杉微卫星 ;所以 ,最终确定 55号处
理 (A4B2C3D2E4)和 54 ℃退火温度为云南红豆杉
简并锚定微卫星 2PCR反应的优化体系。
图 3 优化体系的稳定性试验
注 : 1～7代表 A4B2C3D2E4处理 54 ℃退火温度下的
7次重复试验 ,M为标准分量 SM0321。
3 结论与讨论
(1)本研究首次利用交互正交设计方法筛选出
云南红豆杉简并锚定微卫星 2PCR优化反应体系 :在
20μL反应体系中含有 1 ×PCR buffer, Taq酶 4 U ,
247
第 6期 缪迎春等 :云南红豆杉简并锚定微卫星 2PCR反应体系优化研究
Mg2 + 2. 0 mmol·L - 1、dNTP 0. 4 mmol·L - 1 , DNA 75
ng, Primer 1. 0μmol·L - 1 ,退火温度 54 ℃。验证表
明 ,优化体系的重复性好 ,主带清晰、稳定 ,而且在云
南红豆杉的 SSR引物开发方面具有一定的价值。
(2)正交设计具有均衡分散、综合可比、效应明
确的特性 ,能迅速找出最优水平组合 [ 21 ]。它在 PCR
反应体系优化中应用较广泛 ,但以往类似研究的试
验设计未考虑交互作用 ,判断各因素及其交互作用
的主观性很大 [ 16, 20, 22 ] ,对结果的阐述比较模糊、随
意。本研究中 , Taq酶和 Mg2 + 、Mg2 +和 dNTP的交互
作用对 PCR扩增的影响显著 ,而且 Mg2 +和 dNTP交
互的 F值较大 ,所以出现了考虑交互作用和不考虑
交互作用所得最优组合不一致的现象。可见 ,在
PCR反应体系优化试验设计、分析中不能忽略因素
间的交互作用 ,否则会降低试验的可靠性和对结果
解释的客观性。综上所述 ,交互正交设计既能够快
捷、有效地筛选出最佳的 PCR反应体系 ,又能揭示
各因素及其交互作用对 PCR扩增的影响程度 ,分析
结果也更客观、准确 ,因而具有一定的应用价值。然
而 ,该方法对 PCR扩增效果的评判仍具有一定的主
观性 ,应就其评判标准进行深入研究 ,以提高方法的
易操作性和分析结果的可信度。
(3)Mg2 +和 dNTP、Mg2 +和 Taq酶的交互作用主
要体现在二方面。一方面 , Mg2 +能与 dNTP分子中
的磷酸基团定量地结合 ,使实际反应中的 dNTP减
少 ;另一方面 , Taq酶是 Mg2 +依赖性酶 ,需要一定浓
度的 Mg2 +来激活。因此 ,Mg2 + , dNTP和 Taq酶三因
素浓度相互联系 ,相互制约 ,它们之间浓度过高或过
低都会导致目的产物的减少 ,其中 Mg2 +的浓度最为
关键。
参考文献 :
[ 1 ] Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerp rinting by sim2
p le sequence repeat ( SSR) 2anchored polymerase chain reaction am2
p lification[ J ]. Genom ics , 1994 , 20 (2) : 176～183
[ 2 ] Fisher P J, Gardner R C, R ichardson T E. Single locus m icrosatel2
lite isolated using 5’2anchored PCR [ J ]. Nucleic Acids Research,
1996, 24 (21) : 4369～4371
[ 3 ] B lairM W , Panaud O, McCouch S R. Inter2simp le sequence repeat
( ISSR) amp lification for analysis of m icrosatellite motif frenquency
and fingerp rinting in rice (O ryza sativa L. ) [ J ]. Theor App l Genet,
1999, 98: 780～792
[ 4 ] L ian C L, Zhou Z H, Hogetsu T Z. A Simp leMethod for Develop ing
M icrosatellite Markers using Amp lified Fragments of Inter2simp le Se2
quence Repeat( ISSR) [ J ]. J Plant Res, 2001, 114: 381～385
[ 5 ] W eising K, A tkinson R G, Gardner R C. Genom ic fingerp rinting by
m icrosatellite2p rimed PCR: a critical evaluation [ J ]. PCR Methods
App l, 1995, 4 (5) : 249～255
[ 6 ] Culley TM, Wolfe A D. Population genetic structure of the cleistog2
amous p lant species V iola pubescens A iton (V iolaceae) , as indica2
ted by allozyme and ISSR molecular markers [ J ]. Heredity, 2001,
86: 545～556
[ 7 ] Wolfe A D, Xiang Q Y, Kephart S R. A ssessing hybridization in natu2
ral populations of Penstemon ( Scrophulariaceae) using hypervariable
inter2simp le sequence repeat ( ISSR) bands[ J ]. Mol Ecol, 1998, 7
(9) : 1107～1125
[ 8 ] Sankar A A, Moore G A. Evalutilon of inter2simp le sequence repeat
analysis for mapp ing in Citrus and extension of the genetic linkage
map [ J ]. Theor App l Genet, 2001, 102: 206～214
[ 9 ] Ratnaparkhe M B, Santra D K, Tullu A, et al. Inheritance of inter2
simp le sequence repeat polymorphism s and linkage with a fusarium
wilt resistance gene in chickpea[ J ]. Theor App l Genet, 1998, 96:
348～353
[ 10 ] Joshi S P, Gup ta V S, Aggarwal R K, et al. Genetic diversity and
phylogenetic relationship as revealed by inter simp le sequence re2
peat ( ISSR) polymorphism in the genus O ryza [ J ]. Theor App l
Genet, 2000, 100: 1311～1320
[ 11 ] Vander NestM A, Steenkamp E T, W ingfield B D , et a l. Devel2
opment of simp le sequence repeat ( SSR ) markers in Eucalyp tus
from amp lified inter2simp le sequence repeats ( ISSR ) [ J ]. Plant
breeding, 2000, 119: 433～436
[ 12 ] 苏建荣 , 张志钧 , 邓疆. 不同树龄、不同地理种源云南红豆杉
紫杉醇含量变化的研究 [ J ]. 林业科学研究 , 2005, 18 ( 4) : 369
～374
[ 13 ] 陈少瑜 , 吴丽圆 , 李江文. 云南红豆杉天然种群遗传多样性研
究 [ J ]. 林业科学 , 2001, 37 (5) : 41～48
[ 14 ] 吴丽圆 ,陈少瑜 ,项伟. 云南红豆杉天然群体内同工酶遗传变异
的研究 [ J ]. 遗传 , 2001, 23 (3) : 237～242
[ 15 ] 王关林 ,方宏简. 植物基因工程原理与技术 [M ] . 北京 :科学
技术出版社 , 1998
[ 16 ] 王佳 , 梁国华 , 缪旻珉 , 等. 正交设计优化黄瓜 ISSR体系 [ J ].
分子植物育种 , 2006, 4 (3 ) : 439～442
[ 17 ] 席嘉宾 ,郑玉忠 ,杨中艺. 地毯草 ISSR 反应体系的建立与优化
[ J ]. 中山大学学报 , 2004, 43 (3) : 80～84
[ 18 ]李海生 ,陈桂珠. 红树植物海桑简单重复序列区间 ( ISSR) 条件
的优化 [ J ]. 广东教育学院学报 , 2004, 24 (2) : 80～83
[ 19 ] 何正文 ,刘运生 ,陈立华 ,等. 正交设计直观分析法优化 PCR条
件 [ J ]. 湖南医科大学学报 , 1998, 23 (4) : 403～404
[ 20 ]王彦华 , 侯喜林 , 徐明宇. 正交设计优化不结球白菜 ISSR反应
体系研究 [ J ]. 西北植物学报 , 2004, 24 (5) : 899～902
[ 21 ] 李松岗. 实用生物统计 [M ]. 北京 :北京大学出版社 , 2002
[ 22 ] 谢运海 , 夏德安 , 姜静 , 等. 利用正交设计优化水曲柳 ISSR2
PCR反应体系 [ J ]. 分子植物育种 , 2005, 3 (3) : 445～450
347