全 文 ：L
一谷氨酞胺和桂皮酸对云南红豆杉
愈伤组织生长的影响
中国协和医科大学
中国医学科学院 药物研究所 (北京 1 0 0 0 50 )陈永勤
.朱蔚华 ” 吴蕴棋 胡 秋
摘 要 研究 了不 同化合物对褐化严重 的云南红 豆杉愈伤组 织生长 的影 响 。 结果表 明 , 在培养基
中添加 .0 29 m g / L L 一谷氨酞胺和 0 . 074 一 o . 2 m g / L 桂皮酸后能有效 地抑制愈伤组织和培养基的
褐化 , 显著 改善愈伤组织 的生长 , 并对紫杉醇的 含量影 响不大 ;桂皮酸 浓度在 0 . 30 m g / L 以 上时 ,
则抑制愈伤组织的生长 ,但 能提高其紫杉醇含 量 。
关健词 云南红豆杉 愈伤组织 褐化 紫杉醇
紫 杉 醇 ( at x ol ) 是 从 红 豆 杉 属 植 物
( T 口 x u : L
.
) 中分 离出来 的一个具有抗 肿瘤
活性 的二菇生物碱 , 自 1 9 9 3 年 以来 , 已成为
临床上治疗乳腺癌和卵巢癌的重要药物 。 但
由于红豆杉属植物资 源十分有 限 ,且生长非
常缓慢 , 体内紫杉醇含量很低 ,所以紫杉醇的
药源 问题一开始就受 到人们 的高度关注 , 至
今未得到很好的解决 。 用红豆杉属植物组织
培养技术生产紫杉醇被认为是一种有潜力的
方法 , 已成为研究热点 , 并取得一些进展 1[] 。
但该研究仍处在试验阶段 , 还未见用此方法
商业化生产紫杉醇的报道 。
在进行红豆杉属植物组织培养时 , 愈伤
组织的褐化是一个非常普遍的现象 。 褐化严
重时 ,愈伤组织的生长会受到显著的抑制 ,甚
至不能继代培养成功 2j[ 。 因此 ,寻找克服愈伤
组织褐化的有效方法在红豆杉属植物组织培
养的研究中具有非常重要的意义 。
1 材料与方法
1
.
1 愈 伤组织 的诱导 与培养 : 云南红豆 杉
aT
x u : y u n n a en
n sl’ : 当年生枝条洗净后 , 剪成
小段 , 分别 用 70 % 乙醇 消毒 Z m in 和 0 . 1%
H g C 1
2 消毒 2 0 m i n 。 用无菌水漂洗 6 次后 ,将
茎段剪成长约 1 . 5 ~ 2 . 0 c m 的小段 , 斜插在
诱导培养基 上进行愈伤组织的诱导 ; 愈伤组
织形成后 , 将愈伤组织转到增殖培养基上进
行继代培养 。
.1 2 培养条件 : 基本培养基为 B 。 培养基川
的无 机成分 , 1 0 · o m g / L 肌 醇 、 1 . 25 m g / L
烟 酸 、 1 . 0 m g / L 维生素 B l 、 0 . 5 m g / L 维 生
素 B 。 、 2 .0 0 9 / L 蔗 搪 、 6一节 基 氨 基 嗦 吟
(B A P ) 0
.
1 9 / L
、
1
·
o ~ 3
·
0 m g / L Z
,
4
一二氯苯
氧乙酸 ( 2 , 4一 D )和 8 . 0 9 / L 琼脂 。 愈伤组织诱
导培养基 中加有 1 . 0 9 / L 水解乳蛋 白 ,增殖
培 养 基 同基 本 培 养 基 , 2 , 4一 D 浓 度 为 1 . 0
m g / L
。后来为了改善一些褐化严重的愈伤组
织系的生长 , 在培养基 中分别添加了 1 . 0 9 /
L 的水解乳 蛋白 、 1 . 0 9 / L 蛋 白陈 、 1 . 0 9 / L
水解 酪蛋 白 、 1 . 5%聚 乙烯 毗 咯烷酮 、 1 0 0 . 。
m g / L 抗坏血酸 、 0 . 29 m g / L L 一谷氨酞胺 和
0
.
07 4一 0 . 2 2 m g / L 桂皮酸 。 所有培养基 的
p H 值均为 5 . 8 。 除抗坏血酸 、 L 一谷氨酞胺和
桂皮酸为过滤灭菌外 , 其余培养基成分 均为
高温灭菌 。
试验在黑暗中进行 , 培养室温度为 ( 2 士
2 )
。
C
。
A d d r e s s
:
C h e n Y o n g q in
,
I n s t i t u t e o f M a t e e r i a M e d i e a
M e d i e a l C o ll e g e
,
eB iji
n g
陈永勤 男 , 博士 . 湖北 大学生命科学学院副教授 . 曾从事兰科植物 、杜仲和红豆杉组织与细胞培养的研究 。 现正从事药用植物组织培养与有效成分及其它经济植物 的快 速繁殖技术的研究 。 现在 工作单位 : 湖北大学生命科学 院 (武汉 4 3 00 62)
. , 聪蕊 人
.
5 4 2
-
1
.
3愈伤组织生长量和紫杉醇含量的测定 :系的生长周期延长 、 颜色变浅 、 增殖较多 。 通
愈伤组织生长量以生长指数表示 。 在本试验 过挑选新生的 、 颜色浅 的愈伤组织块进行继
中 ,生长指数一 (收获愈伤组织干重一接种愈 代 ,经过 3 至 4 次继代培养就可形成生长 良
伤组织干重 )/ 接种愈伤组织干重 。 好的愈伤组织系 。在有谷氨酞胺时 , 添加一定
愈 伤组织 中紫杉 醇 含量 的测 定 按 W u 浓度 (0 . 15 ~ 0 . 2 m g / L ) 的桂皮酸能有效地
等川 建 立 的 H P L C 法 进 行 。 色 谱 柱 为 抑制愈伤组织和培养基变红 ,并能改善愈伤
lP an it
n u m C
1 8 柱 , 流 动 相 为 甲醇 一 乙 睛 一水 组织的生长 。
(2 5
,
35
,
45 ), 流溥为 .1 O m L /m in , 检测波 .2 2 L 一谷氨酞胺和桂皮酸对云南红豆杉愈
长为 2 2 7 n m 。 用外标法计算样 品中紫杉醇含 伤组织系 ( T Y 6) 生长和 紫杉醇含量的影 响 :
量 , 以干重百分 比表示 。 将原来在加有谷氨酞胺的增殖培养基上继代
2 结果 生长的 T Y 6 愈伤组织 再转到无谷氨酞胺的
2
.
1 愈伤组织的诱导和培养 : 在本试验的诱 培养基上后 ,其生长速率有所下降 ,而且培养
导条件下 ,来 自 5 株云南红豆杉的茎段都 比 基 的 棕 红 色 较深 ; 而 在有 谷 氨酞 胺 ( 0 . 15
较容易形成愈伤组织 , 诱导成功率均在 80 % m g / L 和 O · 2 9 m g / L ) 的培养基上 , 愈伤组织
以上 。 将所形成的愈伤组织转到增殖培养基 增殖很好 , 培养基 的棕红色较浅 。 同无谷氨酞
上 以后 ,有 3个愈伤组织系褐化程度较轻 ,一 胺的处理相 比 ,有谷氨酞胺的处理的紫杉醇
直增殖较好 ,但另两个 ( T Y 6 和 T Y )S 在继代 含量有所下降 ,但不显著 。
培养 6 个月后发生严重褐化 , 愈伤组织和培 在无谷氨酞胺时 , 0 . 巧 m g / L 的桂 皮酸
养基均呈深褐色至棕红色 , 长势显著减弱 。 虽 对 T Y 6 愈伤组织的生长有强烈的抑制作 用 ;
然其新生的组织为淡黄色 , 但不久就变成棕 在有 谷 氨酞 胺 时 , 较低 浓 度 ( 0 . 0 74 ~ 0 . 2
褐色 、 老化 、 停止增殖 。 m g / L ) 的桂皮酸对愈伤组织 的生长有一定的
为了改善一些褐化严重 的 T Y 6 和 T Y S 促进作用 , 但浓度达到 0 . 3 0 m g / L 和更高时
愈伤组织系的生长 , 在培养基 中分别添加 了 则抑制愈伤组织的生长 , 培养基变红的程度
水解乳蛋 白 、 蛋 白陈 、 水解 酪 蛋 白 ( 各 1 9 / 随桂皮 酸浓度 的增 加而减轻 。 当浓度达 到
)L
、
L S%聚 乙烯毗咯烷酮或 10 0 . 0 m g / L 抗 0 . 2 m g / L 时 , 培养基变红的现象完全 被抑
坏血酸 。 这些物质均不能有效地抑制这两个 制 。 虽然高浓度的桂皮酸会抑制愈伤组织的
愈伤组织系的褐化 。 但添加 0 . 15 一 0 . 2 9 m g / 生长 ,但可提高愈伤组织中紫杉醇的含量 (表
I L
一谷氨酞胺的培养基上 , 这两个愈伤组织 1 ) 。
表 I L一谷氨酞胺和桂皮酸对云南红豆杉愈伤组织 系 ( T Y 6) 生长和紫杉醉含 . 的影响
处 理 收获干愈伤组 织 生长指数 紫杉醉含量 紫杉醇产量
谷氨酷胺 ( m g / L ) 桂皮酸 ( m g / L ) ( g / L ) (% ) ( m g / L )
1CO八onJù托0内子了1工J亡内b20自叮内口七ù勺.…,é2ùq乙口O山9ó20
.
0
0
.
15
0
.
2 9
0
。
0
0
.
2 9
0
.
2 9
0
.
2 9
0
.
2 9
0
。
2 9
0
.
0
0
.
0
0
.
0
0
.
1 5
0
.
0 7 4
0
.
1 5
0
.
2 2
0
.
3 0
0
.
4 4
9
.
6 7士 1 . 0 4
1 2
.
2 1士 0 . 9 8
1 2
.
4 2士 1 . 1 5
6
.
8 5士 0 . 7 7
1 1
.
8 0士 0 . 7 2
1 1
.
9 0士 1 . 0 2
1 1
.
3 8士 1 . 0 3
9
.
6 0士 0 . 9 2
7
.
2 3士 1 . 4 8
1
.
1 3 2士 0 . 2 7 6 a
1
.
2 3 8士 0 . 1 7 8 a
1
.
3 3 1士 0 . 1 8 3 8
0
.
7 8 7士 0 . 3 1 5 .
1
.
4 0 5士 0 . 2 3 8 .
1
.
3 6 6士 0 . 3 5 5 .
1
.
1 8 7士 0 . 1 9 1 .
0
.
8 8 4士 0 . 1 6 9 .
0
.
4 1 2士 0 . 2 3 8b
0
.
0 2 1 8士 0 . 0 0 1 7 a
0
.
0 2 0 7士 0 . 0 0 1 4 a
0
.
0 2 1 0士 0 . 0 0 1 6 .
0
.
0 3 8 9士 0 . 0 0 0 8b
0
.
0 1 8 9士 0 . 0 0 1 8 a
0
.
0 1 9 1士 0 . 0 0 1 1 .
0
.
0 2 3 7士 0 . 0 0 1 4 c
0
.
0 2 7 8士 0 . 0 0 2 1 c
0
.
0 3 55士 0 . 0 0 1 3b
注 : 数据 为 牙士 , 。 生长数据 n = 6 , 萦杉醉含 t 和产 t 的 , = 3 。 数据间的差异性用筋 R 侧验 ,尸 < 。 . 05 ,具有相 同字母的数
据表示 相互之间没有显著性差异 。
《中草药 》 2 9 9 9 年第 3 0 卷第 7 期 · 5 4 3 ·
谷氨酞胺和桂皮酸克服愈伤组织 的褐化
和促进生长的作用在 Y TS愈伤组织 系上也
得到了证实 (资料略 )。
3讨论
用红豆杉属植物细胞大规模培养方法商
业化生产紫杉醇是当今植物次生代谢研究中
的一个热点 。 因为红豆杉属植物细胞培养都
是用愈伤组织建立起来 的 , 所以维持 愈伤组
织的长期培养是该研究的基础 。 愈伤组织的
褐化是妨碍其 长期 继 代培 养 的主 要 因 素 。
eF t
一
N et 。 等卿认 为红豆 杉属植物愈伤组织
的褐化是由于愈伤组织形成的酚类物质氧化
所致 。但在我们的试验中 ,培养基 中添加酚类
物质的吸附剂 (聚乙烯毗咯烷酮 )和抗氧化剂
(抗坏血酸 )等并没有能有效地抑制 2 个褐化
严重的云南红豆杉愈伤组织系的褐化 、 改善
其生长 ,而同时添加 0 . 3 0 m g / L L 一谷氨酞胺
和 0 . 0 7 4一 0 . 2 2 m g / L 桂皮 酸则效果 很好 。
在植物细胞的氮代谢 中 ,谷 氨酞胺是转移 氨
基的重要中间体 ,它 与谷氨酸构成一个转移
氨基的谷氨酞胺 一谷氨酸循环 ; 桂皮酸是植物
细胞 中苯丙烷类物质代谢的关键酶 一苯丙氨
酸裂解酶的抑制剂 ,可 以阻止黄酮和类黄酮
类植物色素的形成圈 。 因此 , 红豆杉属植物愈
伤组织的褐化可能与其细胞 中谷氨酞胺一谷
氨 酸循环受阻及黄酮和类 黄酮类 的形成有
关 。 我们的试验结果表 明 , 在培养基 中添加
0
.
3 0 m g / L L
一谷氨酞胺和 0 . 0 7 4一 0 . 2 2 m g /
L 桂皮酸可 以改善愈伤组织 的严重褐化现象
而使其能长期培养继代 。
致谢 : 紫衫醉标准品 由本所方 唯硕博士
提供 。
参 考 文 献
l 陈永勤 ,等 . 植物生理学通讯 , 19 97 , 3 3( 3) : 2 13
2 W i
c k r e m e s in h e E RM
, e t a l
.
P la n t C e ll
,
T i s s u e a n d o r
-
g a n C u l t u r e
,
1 9 9 3
,
3 8
:
1 8 1
3 G a m b o r g O I
J , e t a l
.
E x p
.
C e l l R e s
, 1 9 6 8
,
5 0
:
1 5 1
4 W u Y Q
, e t a l
.
J
.
L iq C h r o m a t g r & R e la t e d T e e h n o l
,
1 9 9 7
,
2 1
: 3 1 4 7
5 F e t t
一
N e t o A G
, e t a l
.
B io / T e e h n o lo g y
,
1 99 2
,
1 0
:
1 5 7 2
6 B o lw e l l G P
, e r a l
.
P l a n t a
,
19 8 6
.
16 9
:
9 7
( 1 9 9 8
一 0 8
一
2 4 收稿 )
杜仲露天新法土插研究
湘西 民族教育学院 (吉首 4 1 6 0 0 0) 刘建成 . 陈先玉
摘 要 杜仲露 天新法枝擂技术 lj[ , 解决了杜仲枝插难 以成活或不能成 活的难题 , 杜 仲露 天新法
土插初试成功 , 既改进 了插穗切 口封 闭技术 , 又改砂床为土床 , 降低 了成本 , 减少 了投资 ,使杜仲露
天新法枝插技术更具有实 用性及可推广性 。
关键词 杜仲 露天 枝条 土插
杜仲 E u e o m m i a u lm o i de : O l i v . 为名贵
中药材 。 杜仲枝条露天土插 , 我们曾于 1 9 9 1
年 5 月 、 1 9 9 3 年 3 月和 1 9 9 4 年 4 月在 湖南
吉首地 区 多次进行试验 , 发现扦 插后 1 一 2
个月内 ,插穗虽然都能抽芽或部分展小叶 ,但
后期 随着气温的升高和多雨季节的到来 , 以
及寒冬的到来 ,则全部烂心枯死 , 为解决杜仲
枝条露天土插不能成活或难以成活 的难题 ,
我们采用露天新法土插技术 , 即对插条上端
切 口采用石蜡等物封闭 ,初步解决 了这一难
植物生理学课程 .
录论文 30 余篇 。
.
5 4 4
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E d u e a t ion C
o l e g e f or N a t io n a li t ie s
,
J i s h o u授 , 1 9 6 6 年毕业于湖南大学生物系植物学专业 . 现在湘 西民族教育学院生物学系任教植物形态解剖学及
多年来主要从事松乳菇 、红汁乳菇驯化 利用 、植物尽天新法扦擂及珍稀药用植物组培 等研究 , 发表及被收