全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林业科学研究　2007, 20 (4) : 469～472
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0420469204
美洲黑杨雄性花芽全长 cDNA文库构建
周祥明 1 , 张冰玉 2 , 苏晓华 23 , 王大海 2 , 黄秦军 2 , 张香华 2 , 张志毅 1
(1. 北京林业大学林木花卉国家重点实验室 ,北京　100083;
2. 中国林业科学研究院林业研究所 ,国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091)
摘要 :以美洲黑杨雄性花芽为材料 ,利用 SMART技术构建全长 cDNA文库。该库的滴度大于 106 pfu·mL - 1 ,重组率
达 95% ,平均插入片段大小为 1 kb左右 ,说明所构建的文库达到了用于目的基因分离筛选和表达的建库要求 ,为将
来克隆与杨树花发育相关基因及研究其它树种花发育的分子机理奠定了基础。
关键词 :美洲黑杨 ;雄花芽 ;全长 cDNA文库
中图分类号 : S792. 11 文献标识码 : A
收稿日期 : 2005209206
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30200225)
作者简介 : 周祥明 (1976—) ,男 ,福建人 ,博士研究生.3 通讯作者
Con struction of Full2length cD NA L ibrary of M a le
Flora l Buds of Popu lus de lto ides
ZHOU X iang2m ing1 , ZHANG B ing2yu2 , SU X iao2hua2 , WANG Da2hai2 ,
HUANG Q in2jun2 , ZHANG X iang2hua2 , ZHANG Zhi2yi
(1. The Key Laboratory for Genetic and B reeding of Forest and O rnamental Plants,MOE. Beijing Forestry University, Beijing　100083, China;
2. Research Institute of Forestry, CAF; Laboratory of Tree B reeding and Cultivation, State Forestry Adm inistration,Beijing　100091, China)
Abstract: The full2length cDNA library of male floral buds of Populus deltoides Marsh. was constructed through
SMATR ( the Switch Mechanism A t the 5’end of RNA Temp lates) technique. The titer is larger than 106 pfu·
mL - 1 , the percentage of recombination reaches 95% , and the average size of insert fragments is about 1kb. These
results indicate that the library is qualified for cloning and exp ressing target genes. The library has laid a foundation
for studies on the molecular mechanism of flower development in forest trees.
Key words: Populus deltoides; male floral bud; full2length cDNA library
杨树 ( Populus L. )是我国工业用材林和生态防
护林的主要树种 ,我国杨树人工林占全国人工林总
面积的 1 /5,是世界各国杨树人工林总面积 1. 4 ×
106 hm2的 4倍。杨木不仅是用材林中纸浆材的好原
料 ,也适合于胶合板材和包装箱材的加工利用 [ 1 ]。
过去对杨树的研究主要集中在速生、抗性以及材质
方面 ,而在分子水平上对杨树的生殖生长方面的研
究却相对较少 , Sheppard等 [ 2, 3 ] 以毛果杨 ( Popu lus
trichocarpa Torr. & Grog. )雌花芽为材料 ,构建了 cD2 NA文库 ,通过拟南芥 (A rabidopsis tha liana Heynh. )MADS2box同源基因设计探针 ,调取 cDNA文库中的相应基因 ,并研究其在花发育过程中的表达情况及作用 ; Sen等 [ 4 ]在美洲山杨中分离了 2个 MADS2box基因 ,分别为 PtMAGL4和 PtA P1; Shinohara[ 5 ]分离了编码杨树开花相关的 ( PnTFL1)基因 ;安新民等 [ 6 ]以毛白杨 ( Populus tom en tosa Carr. )为研究材料 ,通过设计兼并引物方法 ,采用 PCR扩增技术 ,获得与花发育相关的 A PETALA3、L EA FY2like和 AGAMOUS 基
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
因。以上研究均以少数与杨树开花相关基因为研究
对象 ,而花发育是一个多基因参与的复杂的发育过
程 ,仅克隆少数基因并对其功能进行研究很难揭示
杨树花发育的分子机理。构建全长 cDNA文库 ,并
对文库中基因表达谱进行研究 ,是开展杨树花发育
分子生物学研究的基础。本文以美洲黑杨 ( Popu lus
deltoides Marsh. )为材料 ,构建了雄性花芽全长 cD2
NA文库 ,为采用基因芯片技术研究雄性花芽中基因
的表达谱以及克隆与花发育相关基因奠定了基础 ,
为进一步研究林木花发育的分子机理提供理论
依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
植物材料为中国林科院院内 15年生雄性美洲
黑杨雄花芽。取材时间为 2004年 7月上旬。将苞
片快速剥去后 ,取出中间的花芽装入 Eppendorf管
中 ,迅速放入液氮速冻之后存放在 - 70 ℃冰箱 ,
备用。
主要试剂 : PolyATtract mRNA Isolation System
Kit购自 Promega公司 , SMART cDNA L ibrary Con2
struction Kit购自 BD 公司 ,文库包装所用的蛋白
Gigapack III Gold Packaging Extract购自 STRATA2
GENE公司。
1. 2　方法
1. 2. 1　总 RNA的提取及质量鉴定 　总 RNA的提
取采用异硫氰胍方法 [ 7 ] ,并用紫外分光光度法测定
总 RNA 的浓度和纯度 ,琼脂糖凝胶 ( 0. 8% )电泳
观察。
1. 2. 2　mRNA的分离 　采用 PolyATtract mRNA Iso2
lation System Kit (Cat. #Z5310)的试剂盒 ,从提取的
总 RNA中分离出 mRNA。电泳检查 mRNA的质量。
1. 2. 3　cDNA文库的构建 　参照 SMART cDNA L i2
brary Construction Kit使用说明 ,构建美洲黑杨雄性
花芽 cDNA文库。取 3μL mRNA (约 1μg) ,加入 1
μL SMART ⅣO ligo nucleotide (10μmol·L - 1 )、1μL
CDSⅢ /3’PCR Primer (10μmol·L - 1 ) ,混匀并短暂
离心 ,按试剂盒说明合成 cDNA第 1链 ,再用 5’PCR
Primer和 CDSⅢ /3’PCR Primer通过引物延伸合成
双链 cDNA,然后经过蛋白酶 K消化 , S fiⅠ酶切 ,过
柱分离并收集大于 500 bp 的双链 cDNA ,与载体
λTrip lEx2的左右臂在 16 ℃下连接过夜 ,最后按照
GigapackⅢGold Packaging Extract的方法进行包装 ,
包装后 ,用 0. 5 mL1 ×lambda dilution buffer稀释文
库后于 4 ℃保存。
引物及寡核苷酸片段序列如下 :
CDSⅢ /3’PCR Primer
5’2A TTCTA GA GGCCGA GGCGGCCGACA TGd
( T) 30 N - 1N23’;
SMART Ⅳ O ligo nucleotide
5 ’2AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCAT2
TATGGCCGGG3’;
5’PCR Primer
5’2AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT23’
1. 2. 4　文库的扩增及质量的检测 　将包装得到的
cDNA文库按 1∶5, 1∶10, 1∶15, 1∶20进行稀释 ,然后
各取 1μL与 0. 2 mL用 10 mmol·L - 1硫酸镁重悬的
过夜培养的 XL12B lue混合 , 37 ℃吸附 15 m in。再与
3 mL上层琼脂混匀 ,倒在预热的 LB平板上 , 37 ℃培
养 8～12 h。待噬菌体长出后 ,计数噬菌斑 ,计算 cD2
NA文库滴度。根据 cDNA文库的滴度 ,取适量噬菌
体 ,用加有 IPTG ( 50 mg·L - 1 )和 X2gal ( 50 mg·
L - 1 )的上层琼脂铺板 , 37 ℃培养 8～12 h,计数平板
上蓝色噬菌斑和白色噬菌斑的数目 ,计算重组率。
将文库扩增后保存。
将噬菌体文库转化为大肠杆菌质粒文库。挑取
大肠杆菌 BM 25. 8菌株单菌落 ,于 50 mL LB (含
10 mmol·L - 1麦芽糖 , 10 mmol·L - 1MgCl2 )培养基
中 , 31 ℃振荡培养至 OD600为 1. 0。取 2. 5 mL菌液
与 0. 25 mL稀释后文库混匀 , 31 ℃静置培养 30 m in
后 ,振荡培养 20 m in使抗性基因得以表达。取 100
μL转染后的菌液涂于含 50 mg·L - 1羧苄青霉素
(Carb)的 150 mm LB固体平板 , 31 ℃静置培养过
夜。用牙签随机挑取转化后在含有 Carb ( 50 mg·
L - 1 )抗性平板上生长的 12个大肠杆菌单菌落 ,用
5’PCR Primer和 CDSⅢ /3’PCR Primer分别进行
PCR扩增检测插入片段的长度。用 1 ×TAE电泳缓
冲液 , 0. 8%琼脂糖凝胶 , 50V电泳 , EB染色 15 m in
后在紫外灯下检查扩增的结果。
2 结果与分析
2. 1　总 RNA及 m RNA质量
RNA质量的高低直接影响到文库的质量 [ 8 ]。
提取的总 RNA经电泳检测 ,观察到 18S和 28S rRNA
两条带完整 ,说明基本上无 RNA降解 (图 1) ;同时
经 分 光 光 度 计 测 定 OD260 nm /OD280 nm ≈ 2,
074
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
第 4期 周祥明等 :美洲黑杨雄性花芽全长 cDNA文库构建
OD260 nm /OD230 nm≈ 1. 82,说明总 RNA 的质量较好 ,
无 DNA、蛋白质及小分子污染。用 PolyATtract mR2
NA Isolation System Kit (Cat. #Z5310)分离的 mRNA
经电泳检测 ,呈均匀弥散状 ,也证明总 RNA的质量
好 ,无降解。
图 1　不同浓度总 RNA电泳图
2. 2　m RNA反转录成双链 cD NA
用约 1μg mRNA反转录合成第 1条链 ,经引物
延伸 3次循环合成的双链 cDNA电泳呈弥散状 ,弥
散范围重点分布在 0. 5 bp～1. 5 kb (图 2) ,其弥散程
度与分离的 mRNA相似 ,说明反转录过程中 ,未有
mRNA降解 ,反转录比较成功 ,双链 cDNA质量满足
建库要求。
图 2　mRNA反转录成双链 cDNA电泳图
2. 3　美洲黑杨雄性花芽 cD NA文库的滴度检测
经检测美洲黑杨雄性花芽 cDNA文库的滴度为
6. 8 ×106 pfu·mL - 1 ,文库扩增后的滴度为 7 ×1012
pfu·mL - 1。扩增后的文库于 - 70 ℃保存冰箱。经
过蓝白斑计数 ,文库的重组率达到 95%。
2. 4　噬菌体文库转化成大肠杆菌质粒文库及 PCR
检测
为后续实验工作的方便 ,把噬菌体文库转化成
大肠杆菌质粒文库。通过随机挑选 4 500个大肠杆
菌单菌落进行 PCR扩增检测 , PCR扩增产物片段长
度范围为 0. 5～2. 5 kb,平均长度为 1 kb。图 3为 12
个大肠杆菌 PCR扩增结果 ,其中第 8个泳道的 PCR
产物为 200 bp ,根据试剂盒提供的载体序列说明 ,判
断该产物是一个空载体 ,未插入目的片段 ;其余 PCR
产物均大于 500 bp ,说明已插入大小不同的目的
片段。
图 3　随机挑选 12个大肠杆菌进行 PCR检测 (M:Marker)
1～12为不同的单菌落
3　讨论
(1)构建 cDNA的步骤大致包括细胞总 RNA的
提取 , mRNA的分离 , cDNA第 1链的合成 , cDNA第
2链的合成 , cDNA s的克隆 [ 9～12 ]。在这些步骤中 ,
mRNA质量是影响 cDNA文库的关键因素 ,因此必
须要保证 mRNA纯度高且无降解。本实验采用异硫
氰胍方法提取的总 RNA无蛋白和其它杂质污染 ,琼
脂糖凝胶电泳显示 28S和 18S 2条带清晰 ,且亮度
比值为 2∶1以上 ,无扩散现象 ,说明其纯度和完整性
高 ,完全符合建库的要求。通过总 RNA分离得到的
mRNA电泳图中 ,观察到 mRNA成弥散状态 ,重点分
布在 0. 5～1. 5 kb,也说明 mRNA的纯度和完整性
高 ,完全符合建库的要求。
(2)在 cDNA文库的构建中 ,利用 SMART技术
可以合成全长的具有完整 5’端的 cDNA第 1条链。
用常规方法进行反转录 ,一般难以获得全长的 cD2
NA ,尤其是 mRNA5’端的信息会丢失。利用 SMART
O ligo在反转录中作为 mRNA5’端延伸出的模板合
成对应的一段序列 ,再用 5’PCR Primer和 CDSⅢ /
3’PCR Primer进行引物延伸 ,就能合成完整的双链
cDNA。一般认为 ,非哺乳动物如植物、昆虫、酵母等
的 PolyA + RNA分布在 0. 5～3. 0 kb之间 ,由其合
成的 ds cDNA的分布范围也相应减少。对随机挑选
的 4 500个大肠杆菌单菌落进行 PCR 扩增检测 ,
PCR扩增产物片段长度范围为 0. 5～2. 5 kb,说明库
内的 cDNA序列具有完整性 ,这为今后以该文库进
行与开花相关基因的筛选和克隆奠定了基础。
174
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
(3)文库的滴度、重组率及插入片段的大小是
鉴定 cDNA 文库质量的重要指标。根据公式 :
N = ln (1 - P) / ln (1 - 1 / n) (N 为实际所需克隆数 , P
为要求的概率 (一般为 99% ) , n为某一种类型的稀
有 mRNA在总 mRNA中所占的比例 ) ,当要求克隆
到某低丰度 mRNA的概率为 99%时 ,文库的克隆数
不应低于 1. 7 ×105个。本研究采用 Clontech公司开
发的 SMART方法 ,用长距离 PCR (LD2PCR )合成双
链 cDNA,在扩增引物中引入了植物基因中稀少的
SfiI酶切位点 , PCR产物不需经过加接头、甲基化等
操作步骤可直接进行酶切、连接载体 ,经过引物延伸
后 ,低丰度 cDNA的量也得到扩增 ,从而保证 cDNA
序列的完整性。本文库的总克隆数为 6. 8 ×106个 ,
远大于 1. 7 ×105个 ,已满足构建表征性完整的文库
的要求 ,包括了大部分稀有 mRNA的克隆 ,说明文库
完整有效 ,获得具有较高代表性的 cDNA文库 ,因此
从本文库筛选出低丰度目的基因是完全可行的。
美洲黑杨高质量全长 cDNA文库的成功构建 ,
不仅为研究由多基因参与的复杂的其它树种花发育
过程奠定了坚实的分子生物学基础 ,而且与杨树开
花相关关键基因的克隆也为培育不育的转基因林木
的研究具有重要意义。目前 ,作者已从库中克隆了
数个与花发育相关的基因 ,并制作了与花发育相关
的表达谱芯片 ,相关的后续实验正在进行中 ,有关结
果另文报告。
参考文献 :
[ 1 ] 苏晓华 , 张绮纹 , 郑先武 , 等. 美洲黑杨 ( Populus deltoides
Marsh. ) ×( P. cathayana Rehd. )分子连锁图谱的构建 [ J ]. 林
业科学 , 1998, 34 (6) : 29～37
[ 2 ] Sheppard L A. PTD : a Populus trichocarpa gene with homology to
floral homeotic transcrip tion factors[ D ]. O regon: O regon State Uni2
versity, Corvallis, OR, 1997
[ 3 ] Sheppard L A, B runner A M, Krutovskii K V, et a l. A DEF IC IENS
homolog from the dioecious tree black cottonwood is exp ressed in
both female and male floral meristem s of the two2whorled, unisexual
flowers[ J ]. Plant Physiol, 2000, 124: 627～639
[ 4 ] Sen B. Molecular characterization and functional analysis of MADS
Box fam ily genes from dioecious A spen [ D ]. M ichigan: M ichigan
Technological University, 1999
[ 5 ] Shinohara K. Growth control of woody p lants through genetic engi2
neering[ J ]. The International Forestry Review, 2005, 7 (5) : 49
[ 6 ] 安新民. 毛白杨开花关键基因的分离及其功能分析 [ D ]. 北京 :
北京林业大学 , 2004
[ 7 ] 顾红雅 ,瞿礼嘉 ,明小天. 植物基因与分子操作 [M ]. 北京 :北京
大学出版社 , 1995
[ 8 ] 袁旭 ,王劲 ,李旭峰. 利用 SMART技术构建白菜型油菜 cDNA文
库 [ J ]. 四川大学学报 , 2000, 37 (增刊 ) : 72～75
[ 9 ] 沈倍奋. 分子文库 [M ]. 北京 :科学出版社 , 2001
[ 10 ] 冯斌 ,谢先芝. 基因工程技术 [ M ]. 北京 : 化学工业出版
社 , 2000
[ 11 ] 张士璀 ,范晓 ,马军英. 海洋生物技术原理和应用 [M ]. 北京 :
海洋出版社 , 1998
[ 12 ] Sambrook J, Fritsh E F,Maniatis T. 分子克隆实验指南 (第 2版 )
[M ]. 金冬雁 ,黎孟枫译. 北京 :科学出版社 , 1992
274