全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林业科学研究　2008, 21 (1) : 110～113
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2008) 0120110204
一种复合菌剂的培养保存与土壤接种试验
吴 明 1 , 邱晓力 2 , 蒋科毅 1
(1. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 ,浙江 富阳 311400; 2. 浙江省微生物研究所 ,浙江 杭州 310012)
关键词 :复合菌剂 ;保存 ;土壤接种
中图分类号 : S718. 8 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006203217
基金项目 : 国家“十五”科技攻关项目“竹子商品林培育与可持续经营技术研究”(2001BA506B01)
作者简介 : 吴　明 (1969—) ,男 ,浙江嵊州人 ,副研究员 ,主要研究方向为土壤生态学.
Stud ies on Preserva tion and So il Inocula tion of
a K ind of M ixed Bacter ia lM anure
WU M ing1 , Q IU X iao2li2 , J IANG Ke2yi1
(1. Research Institute of Subtrop ical of Forestry, CAF, Fuyang 311400, Zhejiang, China ;
2. M icrobiology Institute of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, Zhejiang, China)
Abstract:A kind of m ixed bacterialmanure was p repared, which was composed of four bacterium, namely, B acillus
m ega therium var. phospha ticum , B. m ucilag inosus, A zorh izobium sp. and cellulose2decomposing m icroorganism s.
Preservation experiments of the m ixed bacterial manure were carried out under different temperature conditions. The
results showed that when the temperature was 4, 18 and 28 ℃, the colony counts of each p reserved bacterium in2
creased until 30 days and then almost all of them began to decline, and the total colony counts of the bacterial ma2
nure varied little among 30 days and its growth curve reached a peak and a valley when the temperature was 4 and
38 ℃ respectively. This results suggested that the bacterial manure was op timum to be p reserved at 4 ℃ and be
kep t for 30 days, and the conditions 4—28 ℃ and 10—90 days were the matched ranges for its p reservation. Pot2
ting experiments showed that at room temperature and the amount of inoculation was ≤5‰, the growth curves of
Azorh izobium sp. and cellulose2decomposing m icroorganism s were very sim ilar and both hadn’t a great change, but
that of B. m ega therium var. phospha ticum and B. m ucilag inosus varied significantly with the increasing amount of in2
oculation. This suggested that at room temperature, the total colony counts of the bacterial manure would increase
when the amount of inoculation was ≤5‰ and reached the highest value 90 days later after soil inoculation.
Key words:m ixed bacterial manure; p reservation; soil inoculation
随着纯培养技术的完善和对微生物互生和共生
现象的研究 ,人工微生物混合培养或混合发酵已渐
为人们所重视。混合菌是值得重视并应加强研究和
利用的微生物资源 [ 1 ]。复合菌肥可以更有效地提高
土壤肥力或对植物具有促生抗病作用 ,在农林业生
产中已得到了广泛应用 [ 2 - 6 ]。有效菌含量是菌剂质
量的主要指标之一 ,因此有效菌的培养及保存在菌
肥的应用过程中显得极为重要。国内对单一菌的培
养和保存已有不少报道 [ 7 - 9 ] ,但对混合菌的培养、保
存研究较少 [ 10 - 12 ]。
本研究进一步探讨了钾细菌、磷细菌、根瘤菌和
纤维素分解菌 4种微生物混合发酵制备的试验菌剂
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第 1期 吴 　明等 :一种复合菌剂的培养保存与土壤接种试验
在不同温度、时间的交互保存 ,并对其进行了土壤接
种试验 ,通过检验该混合菌剂的保存和施入林地后
的一些特性 ,为复合菌肥的商品制备和施用提供理
论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 试验菌种 磷细菌 :巨大芽胞杆菌 (B acillus
m ega therium var. phospha ticum (Azomeg) ) ,由浙江省
微生物研究所提供 ;纤维素分解菌 :采用由中国林科
院亚热带林业研究所分离保存的 SF21菌株 ;钾细
菌 :采用自行分离纯化的胶质芽孢杆菌 (B acillus m u2
cilag inosus Avakyan et a l. )菌株 ;根瘤菌 :固氮根瘤菌
(A zorh izobium sp. )菌种 ,由浙江省微生物研究所
提供。
1. 1. 2 菌剂培养基质 采用经过 45 d堆制腐熟的
猪粪商品有机肥 (杭州萧山汇仁有机肥有限公司提
供 )为原料 ,添加质量分数为 3%的玉米粉和适量
水 ,混匀灭菌处理后备用。
1. 1. 3 供试土壤 接种培养用土壤采自浙江省龙
游县 ,为砂岩发育的表层低丘红壤 ,风干磨碎后全部
过 2 mm筛。土壤基本理化性状为 pH值 4. 78,有机
质 15. 7 g·kg- 1 ,全 N 1. 509 g·kg- 1 ,全 P 0. 486 g
·kg- 1 ,速效 P 6. 0 mg·kg- 1 ,速效 K 66. 9 mg·
kg- 1 ,代换性 Ca 535. 2 mg·kg- 1 ,代换性 Mg 50. 3
mg·kg- 1。
1. 2 试验设计
1. 2. 1 复合菌剂制备
1. 2. 1. 1 扩大培养 钾细菌接种于硅酸细菌培
养基斜面 ,根瘤菌、磷细菌和纤维素分解菌分别
接种于一支细菌培养基斜面 , 28 ℃条件下培养
24～36 h;然后将培养好的斜面取出转接于 500
mL小摇瓶中 ,钾细菌接种于硅酸盐细菌培养液 ,
其余 3种菌混合接种于细菌培养液 ,每一摇瓶各
装培养液 300 mL ,接种量为每种菌各一满环 , 28
℃下摇瓶发酵 36 h;最后 ,分别将发酵好的 300
mL菌液转接于 3 000 mL大摇瓶中 ,各装培养液
2 000 mL ,发酵条件同上。
1. 2. 1. 2 肥料菌的固体发酵 经扩大培养后的
发酵液均匀地混入基质中 ,拌匀后堆积约 20 cm
高 , 28～37 ℃下固体发酵 3～4 d。培养的菌剂初
始含水量为 32 % ,用于进一步保存和土壤接种
试验。
1. 2. 2 复合菌剂保存试验 设置 4、18、28 和
38 ℃4个温度梯度 ,取发酵的菌剂 50 g装入已灭
菌的 100 mL 三角瓶中 ,每个温度设置 12瓶 ,共
48瓶。然后置于上述温度条件下 ,于 10、30、90、
180 d时 ,各取 3 瓶 ,分别测定每瓶混合样活菌
数 ,取平均值。
1. 2. 3 土壤接种培养试验 取 5 kg风干土壤装
盆 ,加水约土壤最大持水量的 70% ,每盆种植 1株高
约 30 cm的竹苗 , 1周后用已制备的复合菌剂进行接
种 ,设 0. 0 (CK)、1. 0、5. 0 g· ( kg土 ) - 1 3个水平处
理 , 3个重复 ,置室温下培养。分别在 10、30、90、180
d时 ,每盆用管状取样器采集 3～5 cm深度范围内
土壤样品 ,混合后测定活菌数。
1. 3 菌落数测定方法
采用平板稀释分离技术 ,选取菌落数为 30～
300的平板作为菌落计数标准 ,每一稀释度采用
2个平板菌落的平均数乘以稀释倍数进行菌落
计数。
2 结果与分析
2. 1 复合菌剂保存试验结果
图 1表明 :在 18、28 ℃条件下 ,根瘤菌、磷细菌
和纤维素分解菌 3种肥料菌的含菌量随保存时间的
变化其高低顺序基本保持一致 ,含菌量顺序为 : 30 d
> 10 d > 90 d > 180 d;而钾细菌 4 ℃条件下最大含
菌量出现在 90 d时 ; 30 d时不同温度下含菌量高低
顺序为 : 4 ℃ > 18 ℃ > 28 ℃ > 38 ℃。
在 4、18、28 ℃条件下 , 4种肥料菌含菌量随
时间的推移而呈现出增长的趋势 ,除钾细菌含菌
量在 4 ℃时直至 90 d到达最大值外 ,其余均在 30
d时达到最高值 ,之后出现了大幅下降 ,保存 30 d
可得到高含菌量的菌剂。在 38 ℃条件下 ,根瘤
菌和纤维分解菌含菌量在 10 d即达到了最大值 ,
其后含菌量开始下降 ;钾细菌含菌量在 30 d之前
随时间呈现增加趋势 ,之后下降 ;磷细菌含菌量
在 30 d之前保持不变 ,其后开始减少 ,保存 10 d
后可得到高含菌量的菌剂。4 ℃条件下保存的菌
剂与其它 3个温度相比 ,总体含菌量是最高的 ,
30 d内肥料菌的含菌量呈逐渐上升趋势 ,在该温
度条件下可以较大程度地维持菌种的高活性状
态。在同样保存 30 d条件下 ,随着温度的升高 ,
试验样品的含菌量逐渐减少 , 28 ℃条件下保存
的菌剂其含菌量比 18 ℃时平均减少 42. 2 % , 38
111
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
℃时降至最低。
试验表明 ,该种菌剂的最佳保存时间为 30 d,最
长保存时间为 90 d;最佳保存温度为 4 ℃,适宜保存
温度为 4～28 ℃。在 4～28 ℃条件下保存 , 10～90
d内菌剂含菌量能保持较高水平。
图 1 保存温度、保存时间对活菌数的影响
2. 2 土壤接种定殖试验
土壤接种试验结果显示 ,除纤维素分解菌活菌
量在定殖 180 d、接种量 1‰时出现比 5‰条件下更
高外 ,该复合菌剂中其它 3种菌株在不同的定殖时
间都随着接种量的增加而增加。
由图 2可见 :在接种量 1‰时 ,根瘤菌和钾细菌
生长曲线较为一致 ,均出现 2个高峰 ,纤维素分解菌
为单峰 ,且 3种肥料菌生长高峰期都集中在 90 d左
右 ;磷细菌的生长曲线高峰在接种定殖 10 d时出
现。与接种量 1‰时相比 ,在接种量为 5‰时 ,根瘤
菌和纤维素分解菌的生长曲线总体趋势都变化不
大 ,活菌量高峰期仍出现在 90 d左右 ,但纤维素分
解菌高峰期活菌量有了较大幅度的增加 ;磷细菌和
钾细菌的生长曲线都有较大变化 ,在接种量增加的
条件下二者的生长曲线呈现了相反的变化趋势 :接
种量的增加导致磷细菌的生长曲线高峰推迟到来 ,
从 10 d增加到 30 d;而钾细菌的生长曲线则与其相
反 ,高峰提前到 30 d左右出现 ,高峰期也延长为 10
～90 d左右 ,两种细菌的活菌量都有了较大幅度的
增加。
试验表明 :在室温条件、接种量低于 5‰时 ,该
菌剂中活菌数随着接种量增加具有增加的趋势 ,且
活菌量高峰期出现在 90 d左右。
刘丽丽等 [ 10 ]研究表明 :磷细菌和钾细菌的混合
培养并不影响彼此的解磷、解钾活动 ; 而蒲一涛
等 [ 11 ]研究发现 ,固氮菌和纤维素分解菌混合培养的
活菌数及含氮量均高于两种菌株各自单独培养 ,并
认为自生固氮菌和纤维素分解菌可以进行混合培养
并做成混合菌剂。这表明该混合菌剂的菌种配置是
合理的 ,结合本研究结果 ,为了获得更高的活菌量 ,
同时更好地促进根瘤菌和纤维素分解菌协同作用 ,
该混合菌剂的接种量可以尝试适量增加 ,或者提高
该菌剂制备过程中根瘤菌和纤维素分解菌的含菌量
和比例。
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第 1期 吴 　明等 :一种复合菌剂的培养保存与土壤接种试验
图 2　不同接种量下土壤中 4种菌种生长 (活菌净增殖量 )变化
3 小结
(1)复合菌剂的有效保存与保存时间密切相
关。在 0～28 ℃条件下 ,钾细菌、磷细菌、根瘤菌和
纤维素分解菌 4种肥料菌含菌量 30 d内随时间的
推移而呈现出增长的趋势 ,除钾细菌含菌量在 4 ℃
时直至 90 d达到最大值外 ,其余均在保存 30 d时达
到高峰 , 30 d后含菌量出现较大幅度下降 ;在 38 ℃
条件下 ,除钾细菌含菌量高峰保持不变 ,其余 3种高
峰均提前到 10 d。初步认为该种菌剂的最佳保存时
间为 30 d,最长保存时间 90 d。
(2)温度条件对复合菌剂的有效保存影响较
大。在 4 ℃条件下保存菌剂时 ,各菌种含菌量是最
高的 ,随着温度的升高 ,含菌量逐渐减少 , 38 ℃时降
至最低。该种菌剂最佳保存温度为 4 ℃,适宜保存
温度为 4～28 ℃。
(3)该复合菌剂经土壤接种后 ,磷细菌的土壤
增殖效率较低 , 4种菌株总体上定殖、增殖作用明
显 ,初期土壤含菌量随接种量增加而增加。除磷细
菌外 , 1‰和 5‰的土壤接种处理都在 90 d时达到最
大的活菌数。
(4)复合菌剂的含水量可能对试验结果产生较
大的影响 ,本试验只是 32%的初始含水量时的数
据 ,有待于进一步增加实验 ,提出该类复合菌剂最佳
的含水量范围。
(5)由于混合发酵中各菌种的最佳培养条件 ,
包括培养基 C /N、温度、湿度和发酵时间等都存在一
定的差异 ,各菌种之间交互作用也复杂多变 ,本试验
只是对混合发酵的初步探讨 ,对多菌种混合发酵条
件及其过程机理有待于进一步研究 ,以形成相对完
善可靠的发酵工艺。
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