全 文 ：第 51 卷 第 10 期
2 0 1 5 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 10
Oct．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20151004
收稿日期: 2014 － 12 － 17; 修回日期: 2015 － 04 － 06。
基金项目:林业公益性行业科研专项“江苏沿海困难立地造林关键技术研究”(201304211)。
* 季永华为通讯作者。
苦楝 －小麦农林复合生态系统土壤真菌
群落结构分析*
张 敏1 周 鹏2 季永华1
(1. 江苏省林业科学研究院 南京 211153; 2. 南京林业大学生物与环境学院 南京 210037)
摘 要: 【目的】采用 18S rDNA PCＲ-DGGE 技术研究苦楝 －小麦农林复合生态系统根际及非根际土壤真菌群
落结构，以期揭示农林复合生态系统中伴生树种对作物根际真菌群落的影响，为农林复合经营实践提供理论参
考。【方法】提取根际和非根际土壤真菌 DNA，采用通用引物 GC-FＲ1 和 FF390 扩增 18S rDNA 基因目的片段，
扩增片段用变性梯度凝胶电泳分析;不同处理间微生物群落结构的相似性采用非加权组算术平均法分析比较;
以物种丰富度指数、Shannon-Wiener 多样性指数和均匀度指数 3 个指标评价各样品真菌多样性;最后将 DGGE 图
谱中的优势条带割胶测序并建立系统发育树。【结果】根际真菌群落结构和多样性远比非根际土壤复杂，且根
际土壤样品 DGGE 电泳图谱中优势条带数也比非根际土壤样品多。进一步采用非加权组算术平均法对不同处
理间真菌群落结构的相似性进行分析，发现每个处理组 3 次重复间的相似度除苦楝根际土壤外均大于 70% ;在
聚类分析图中所有处理明显分为 3 个组，相似度为 51% ;小麦根际真菌菌群与苦楝 － 小麦农林复合系统中的小
麦根际真菌相似性最高，相似度为 72%，表明苦楝对小麦根际真菌群落的影响不大;苦楝根际真菌菌群与其他各
组间差异较大，相似度仅为 51%。主成分分析结果也表明所有处理明显分为 3 个群组。多样性分析结果表明，
各处理组根际真菌之间以及非根际真菌间丰富度差异均不明显，而苦楝 －小麦农林复合系统中的小麦及苦楝根
际真菌丰富度显著高于非根际真菌;根际真菌的 Shannon-Wiener 多样性指数存在显著差异，非根际真菌的
Shannon-Wiener 多样性指数差异不显著;根际真菌及非根际真菌各组间均匀度指数差异不大，而小麦 －苦楝农林
复合系统中的小麦以及苦楝根际真菌与非根际真菌均匀度指数存在明显差异。此外，DGGE 图谱中的 11 条优势
条带克隆测序结果表明，3 条条带为不能培养的真菌，其余 8 条条带对应的同源性最高的序列分别属于球囊菌
门、担子菌门、子囊菌门和半知菌亚门。【结论】小麦 － 苦楝农林复合系统中的小麦根际真菌丰富度、多样性指
数和均匀度均比单纯小麦根际真菌高，表明此复合系统中伴生的苦楝可增加小麦根际真菌的多样性。
关键词: 农林复合生态系统;真菌群落;PCＲ-DGGE
中图分类号:S718. 81 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2015)10 － 0026 － 09
Analysis on the Soil Fungal Community Structure in Melia azedarach-
Triticum aestivum Agroforestry Ecosystem
Zhang Min1 Zhou Peng 2 Ji Yonghua1
(1. Jiangsu Academy of Forestry Nanjing 211153; 2. College of Biology and the Environment，Nanjing Forestry University Nanjing 210037)
Abstract: 【Objective】 To explore the influence of tree species on rhizosphere-associated fungal community in an
agroforestry ecosystem， and to provide new insights into agroforestry practice， the fungal community structure in
rhizosphere and bulk soil in Melia azedarach-Triticum aestivum agroforestry ecosystem was investigated by 18S rDNA PCＲ-
DGGE．【Method】After the fungal DNA was extracted from extraction of nonrhizosphere and rhizosphere-associated soil，
and the targeted fungal 18S rDNA was amplified using universal primers GC-FＲ1 and FF390． And then the amplified DNA
fragments were analyzed by density gradient gel electrophoresis (DGGE) ． Similarity among different groups was analyzed
using the UPGMA ( unweighted pair group method with arithmetic averages ) method，and the fungal diversity was
evaluated with species richness ( S)，Shannon-Wiener index ( H) and the equitability index ( E) ． Finally，dominant
DGGE bands were excised，sequenced and a phylogenetic tree was constructed． 【Ｒesult】 Ｒesults showed that the
第 10 期 张 敏等: 苦楝 －小麦农林复合生态系统土壤真菌群落结构分析
structure and diversity of rhizosphere-associated fungi community were much more complex than that of the bulk soil，and
more dominant bands were observed in DGGE profiles of rhizosphere soil samples． The DGGE profiles were further
investigated by cluster analysis using the UPGAMA method，revealing that the similarity among the three replicates of each
treatment was more than 70% except for the rhizosphere soil of M． azedarach． In clustering diagram，all the samples were
grouped into three clusters with a similarity of 51% ． The highest similarity (72% ) was found between the rhizosphere-
associated fungal community from wheat and wheat grown under M． azedarach，which indicated that M． azedarach had
minor influence on the rhizosphere-associated fungal community of wheat． In addition，only 51% similarity was noticed
between the rhizosphere-associated fungal community of M． azedarach and the other groups． The principal-component
analysis (PCA) also demonstrated that all the treatments was divided into three groups． There were no obvious differences
in species richness among rhizosphere-associated fungal communities and nonrhizosphere fungal communities． However，
the species richness of rhizosphere-associated fungal community from wheat grown under M． azedarach and M． azedarach
were higher than nonrhizosphere fungal community． There were significant differences in Shannon-Wiener indexes among
rhizosphere-associated fungal communities， while the difference was not significant among nonrhizosphere fungal
communities． Additionally，no significant differences were present in equitability index among rhizosphere-associated
fungal communities or nonrhizosphere fungal communities，whereas，the equitability index between rhizosphere-associated
and nonrhizosphere fungal community of wheat grown under M． azedarach was significantly different，and the same as M．
azedarach． Finally，sequencing of eleven dominant DGGE bands showed that 3 of the 11 sequences were uncultured fungi
and the rest 8 sequences belonged to Glomeromycota，Basidiomycota，Ascomycota or Deuteromycota． 【Conclusion】The
species richness，Shannon-Wiener index and equitability index of rhizosphere-associated fungi from wheat grown under M．
azedarach were higher than that of monocultured wheat，which indicated that diversity of rhizosphere-associated fungal
community of wheat was enriched by trees grown in this agroforestry ecosystem． Our results may provide new reference for
agroforestry practice．
Key words: agroforestry ecosystem;fungal community;PCＲ-DGGE
根际是指土壤中紧邻植物根部的一个狭窄区
域，这一区域直接受到植物根系活动及土壤微生物
的影响(Hinsinger et al．，2009)。植物根际形成一个
相对稳定的微环境并且由根系分泌物提供了丰富的
营养物质，从而吸引大量微生物定居 ( Saito et al．，
2007)。研究表明，宿主植物可以通过根系分泌物
调控土壤微生物的群落结构(Haichar et al．，2008)，
土壤类型也会影响根际微生物群落 ( Berg et al．，
2009)，但究竟哪个因素更为重要目前尚无定论。
根际微生物，特别是真菌会对宿主植物的生长产生
重要影响。如菌根真菌可以促进根系对水分和矿质
元素的吸收、改善土壤的物理性质;某些真菌可以分
泌抗菌物质抑制土壤病原菌的生长，从而保护宿主
植物免受病原菌侵袭;内生真菌有助于协助宿主植
物应对不良环境胁迫;土壤真菌还能分解落叶等有
机物为植物提供营养物质(Finlay，2008; Mendes et
al．，2013; Berendsen et al．，2012; Khan et al．，2012)
等。土壤真菌对植物生长也会产生不利影响，如某
些真菌可能引发植物病害、影响作物产量甚至导致
植物死亡(Mendes et al．，2013)。此外，宿主植物也
会对根际真菌的生长产生影响，如植物凋落物可以
为根际真菌提供碳源、植物根系分泌物可以选择性
抑制 某 些 真 菌 而 促 进 另 外 一 些 真 菌 的 生 长
(Urbanová et al．，2015)。
农林复合生态系统中的木本植物可以改善土壤
的理化性质，从而影响土壤微生物群落的结构与功
能(Fanish et al．，2013; Vallejo et al．，2012; Ｒivest et
al．，2013)。然而，目前有关农林复合生态系统中微
生物多样性和群落结构的研究并不多见。对根际真
菌多样性及其群落结构的研究将有助于深入了解其
生态功能。由于许多真菌在实验室条件下不能培
养，因此传统的培养方法往往会低估土壤真菌菌
群多样性。此外，培养方法费时费力也限制了其
在真菌群落分析中的应用。近年来，为克服传统
培养方法的缺陷，真菌生态学家开发出一系列基
于 PCＲ 技术的分析方法，如变性梯度凝胶电泳
(DGGE)、末端限制片段长度多态性( T-ＲFLP)、单
链构象多态性 ( SSCP) 等。这些方法中的 PCＲ-
DGGE 技术已被广泛应用于微生物多样性研究并
已取得重要进展(Broeckling et al．，2008; Ketema et
al．，2014; Manici et al．，2010 )。本研究采用 18S
rDNA PCＲ-DGGE 及克隆技术分析了苦楝 (Melia
azedarach) － 小麦 ( Triticum aestivum)农林复合生
态系统根际及非根际土壤真菌群落结构，以期揭
72
林 业 科 学 51 卷
示农林复合生态系统中伴生树种对作物根际真菌
群落的影响，为农林复合经营实践提供一定的理
论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验点自然概况
试验点设在江苏射阳林场(33°3330″—33°3730″ N，
120°2435″—120°3035″ E)。该林场位于江苏中部
沿海的淤泥质海岸线上，面积约 2 000 hm2，其中林
地 1 500 hm2，疏林及灌木林地 100 hm2，森林覆盖率
达 80%以上。射阳林场属于北亚热带海洋性季风
湿润气候，年平均气温 14. 5 ℃，1 月平均最低气温
8. 0 ℃，7 月平均最高气温 27. 1 ℃，平均气温≥
10 ℃ 的 平 均 日 数 为 221 天。年 均 降 水 量 为
1 069. 0 mm，年均蒸发量为 1 407. 4 mm。年均日照
时数为 2 218. 8 h。地下水位一般为 1. 5 ～ 2. 0 m，水
质多为弱矿水，pH 值 8. 0。
1. 2 试验设计
本研究农林复合经营模式为苦楝 － 小麦间作，
并以单作小麦作为对照。苦楝 －小麦间作田和纯小
麦田于 2010 年建立。苦楝株行距为 3 m × 4 m，小
麦栽培时距离树行两侧各 1 m。单作和间作的生产
管理方式相同。
1. 3 土壤样品采集
2012 年 5 月，分别在苦楝 － 小麦间作田和纯小
麦田中建立标准样地，大小均为1. 3 hm2。为了减少
土壤空间异质性带来的误差，每个样地内设定 3 个
2 m × 2 m 的小样方，各样方间相距 50 m。根际与非
根际土壤均采用 5 点混合采样法。根际土壤采样
时，挖取距地表 10 ～ 15 cm 细根(直径 ＜ 5 mm)，保
留距根表 4 mm 左右的细粒土壤;非根际土壤采样
距地表 10 ～ 15 cm，过 80 目筛。将采集的细根和非
根际土壤装入无菌聚乙烯塑料袋中，编号后放入低
温样品采集保温盒中带回实验室，放入 － 80 ℃冰箱
保存备用。根际土壤采用洗涤法获得。
1. 4 土壤 DNA 提取及 PCＲ 扩增
土壤总 DNA 的提取采用 Omega 公司的 E． Z．
N． A． TM Soil DNA Kit 试剂盒，提取方法参照试剂盒
说明进行操作。为获得根际真菌 DNA，将 5 g 细根
放入 50 mL 0. 85%的无菌 NaCl 溶液中振荡30 min，
弃去细根后 1 000 r·min － 1离心 10 min，所得沉淀用
于提取根际真菌 DNA( Teixeira et al．，2010)。提取
的 DNA 存放于 － 80 ℃冰箱待用。真菌群落多样性
评估按照 Vainio 等(2000)报道的方法，采用通用引
物 GC-FＲ1(5-CCC CCG CCG CGC GCG GCG GGC
GGG GCGGGG GCA CGG GCC GAI CCA TTC AAT
CGG TAI T-3) 和 FF390 ( 5-CGA TAA CGA ACG
AGA CCT-3)扩增 18S rDNA 基因目的片段，其中引
物 FＲ1 的 5末端添加 40 bp 的 GC 序列。PCＲ 采用
50 μL 反应体系，扩增条件:95 ℃ 8 min;95 ℃ 30 s，
50 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30 次循环; 72 ℃ 延伸
10 min。PCＲ 产物先用 Omega 公司的 E． Z． N． A． 
Cycle-Pure Kit 试剂盒纯化，再进行 DGGE 分析。
1. 5 DGGE 分析
变性梯度凝胶电泳 ( DGGE)采用 CBS 公司的
DGGE-2001 突变检测系统进行，使用 8% 的聚丙烯
酰胺凝胶，变性剂浓度范围为 40% ～ 60% (100%变
性剂指 40%去离子甲酰胺 + 7 mol·L － 1尿素)。电泳
条件:1 × TAE 电泳缓冲液，先用 20 V 恒压电泳
15 min，再用 100 V 恒压、60 ℃恒温电泳 16 h。电泳
结束后，凝胶用 SYBＲ Green I(1 ∶ 10 000 稀释)染色
30 min。染 色 后 的 凝 胶 用 Bio-Ｒad 公 司 的
ChemiDOC XＲS 凝胶成像系统拍照。
DGGE 条带图谱用 Quantity One 1-D 软件分析，
不同处理间微生物群落结构的相似性采用非加权组
算术 平 均 法 ( unweighted pair-group method with
arithmetic means，UPGMA) 分析比较。各样品真菌
多样性采用物种丰富度( species richness，S)、香侬
(Shannon-Wiener)多样性指数 ( H)和均匀度指数
(equitability index，E)3 个指标评价。香侬多样性指
数和均匀度指数的计算公式如下:H = － ∑Pi lnPi;
E = H / lnS。其中，Pi = ni /N，ni是第 i 条带的强度，N
为样品中所有条带的总强度(Yu et al．，2004)，S 为
某个样品中的条带总数。主成分分析参照 Ogino 等
(2001)的方法采用 Canoco 软件。
1. 6 DGGE 条带序列测定及系统发育树构建
在紫外灯下将 DGGE 凝胶上的条带切下后放
入盛有 E． Z． N． A． TM Poly-Gel DNA(Omega 公司生
产)提取试剂的无菌 EP 管中，按试剂操作说明纯化
凝胶中的 DNA 片段。纯化的 DNA 片段再次用
FF390 /FＲ1-GC 引物对进行 PCＲ 扩增，之后再次进
行 DGGE 凝胶电泳(变性剂浓度 40% ～ 60% )以确
定所切片段的纯度。再次割胶并用不含 GC 序列的
FF390 /FＲ1 引物对进行 PCＲ 扩增。将 PCＲ 产物与
pEASY-T1 Simple Cloning 载体(北京全式金公司)连
接后转化大肠杆菌(Eescheria coli)感受态细胞。采
用 M13F 和 M13Ｒ 引物进行 PCＲ 扩增，鉴定阳性重
组子，送上海英骏生物技术有限公司进行测序。所
测得序列在 NCBI 上进行比对，并用 MEGA 软件采
用邻接法 ( neighbor-joining method ) 构 建系统发
82
第 10 期 张 敏等: 苦楝 －小麦农林复合生态系统土壤真菌群落结构分析
育树。
图 1 苦楝 －小麦农林复合生态系统根际和非根际土壤真菌 DGGE 指纹图谱
Fig． 1 DGGE profiles of rhizosphere and bulk soil in M． azedarach-T． aestivum agroforestry ecosystem
Wr:纯小麦根际土壤 Ｒhizosphere soil of wheat;WMr:苦楝 － 小麦间作模式中小麦根际土壤 Ｒhizosphere soil of wheat in M． azedarach-T．
aestivum agroforestry ecosystem;;Mr:苦楝根际土壤 Ｒhizosphere soil of M． azedarach;;Ws:纯小麦非根际土壤 Non-rhizosphere soil of wheat;;
WMs:苦楝 +小麦间作模式中小麦非根际土壤 Non-rhizosphere soil of T． aestivum in M． azedarac-T． aestivum agmforestry ecosystem;;Ms:苦楝非
根际土壤 Non-rhizosphere soil of M． azedarach．
1. 7 统计分析
数据分析采用 SPSS17. 0 统计分析软件，组间差
异采用单因素方差分析(One way ANOVA)。数据
以平均值 ± SE 表示，P≤ 0. 05 表示存在显著性
差异。
2 结果与分析
2. 1 根际及非根际土壤真菌群落相似性分析
如图 1 所示，DGGE 电泳图谱中可见数量众多
强度不一的条带。其中，根际土壤样品电泳图谱中
只有几条优势条带，更多的是强度较弱的条带。与
根际土壤样品的 DGGE 图谱相比，非根际土壤样品
DGGE 电泳图谱中优势条带更少，仅有条带 1 和 8
两条优势条带。非根际土壤样品 DGGE 图谱的复
杂度也较根际土壤样品小。条带 1 和 8 在根际和非
根际土壤中均能检测到，且条带强度在各处理组中
变化不大，表明它们所对应的真菌受环境影响较小。
与之相比条带 4 和 6 在根际土壤 DGGE 图谱中强度
较高，而在非根际土壤中变弱，说明它们所对应的真
菌受植物根系影响较大。此外，还有一些条带如 3
和 5 仅存在于根际土壤 DGGE 图谱中。
进一步利用 UPGMA 进行聚类分析发现，所有
样品明显聚为 3 簇(图 2)。第 1 组包括小麦根际土
壤、小麦非根际土壤以及苦楝 － 小麦农林复合系统
中的小麦根际土壤样品，相似度为 68%，表明在此
农林复合系统中小麦根际真菌群落受伴生树种苦楝
的影响较小。第 2 组的相似度为 65%，包括苦楝 －
小麦农林复合系统中的小麦非根际土壤样品和苦楝
非根际土壤样品。第 2 组为苦楝根际土壤样品，其
与第 1，2 二组的相似度为 51%。说明苦楝根际真
菌组成与其他处理相差较大。此外，同一处理的 3
个重复间相似性较大，除苦楝根际土壤样品外均在
70%以上。
92
林 业 科 学 51 卷
图 2 苦楝 －小麦农林复合生态系统真菌群落结构相似性的聚类分析
Fig． 2 Cluster analysis of fungal community structure similarity in M． azedarach-T． aestivum agroforestry ecosystem
2. 2 根际及非根际土壤真菌多样性
本研究中根际及非根际土壤真菌丰富度及多样
性采用 S，H 和 E 3 个指标进行综合评价，结果如图
3 所示。由图 3A 可知，就根际真菌丰富度而言，苦
楝 －小麦农林复合系统中的小麦根际真菌丰富度最
高为 23. 33，而非根际土壤中小麦非根际土壤真菌
丰富度最高为 20. 67，苦楝非根际土壤真菌丰富度
最低为 15. 33，3 组处理根际真菌之间以及非根际真
菌间丰富度差异均不明显。进一步对同一处理组根
际真菌与非根际真菌比较发现，小麦根际与非根际
真菌丰富度无明显差异，而小麦 － 苦楝农林复合系
统中的小麦及苦楝根际真菌丰富度显著高于非根际
真菌(图 3D)。根际真菌的 H 值存在显著差异，H
值最高的是小麦 －苦楝农林复合系统中的小麦根际
真菌 ( 3. 04 )，最低的是 苦楝非根 际 土 壤 真 菌
(2. 48);非根际真菌的 H 值差异不显著。与丰富度
结果相似，小麦 －苦楝农林复合系统中的小麦及苦
楝根际真菌与非根际真菌的 H 值均存在显著差异。
根际真菌各组间以及非根际真菌各组间 E 值差异
不大，E 值最高的是苦楝根际土壤真菌 (0. 97)，最
低的是苦楝非根际土壤真菌 (0. 92)。而小麦 － 苦
楝农林复合系统中的小麦根际真菌 E 值明显高于
非根际真菌，同样苦楝根际真菌与非根际真菌 E 值
也存在明显差异。以上结果表明，小麦 － 苦楝农林
复合生态系统中根际真菌多样性显著高于非根际真
菌，这可能是系统中苦楝和小麦联合作用的结果。
2. 3 主成分分析
引入主成分分析方法从而对复杂的 DGGE 图
谱进行分析。如图 4 所示，每个图标代表一个样品
的菌群结构，图标之间的距离代表 2 个菌群间的差
异，距离越大差异越大。 PCA 图在 X 轴解释了
43. 7%的变异度，在 Y 轴解释了 17. 9% 的变异度。
主成分分析进一步验证了聚类分析结果。由图 4 可
以看出，所有样品明显分为 3 个聚类群，其中苦楝非
根际土壤真菌单独聚为一群。主成分分析结果进一
步验证了聚类分析所得结果，即苦楝对小麦根际真
菌群落的影响不大。
2. 4 DGGE 优势条带的 DNA 序列测定
对 DGGE 凝胶上的 11 条优势条带(图 1)进行
割胶测序，并使用 NCBI 的 BLAST 工具与数据库内
基因进行比对。如表 1 和图 5 所示，11 条条带中有
3 条为不能培养的真菌，其余 8 条条带对应的同源
性最高的序列分别属于球囊菌门(Glomeromycota)、
担子菌门 ( Basidiomycota)、子囊菌门 ( Ascomycota)
和半知菌亚门(Deuteromycota)。
03
第 10 期 张 敏等: 苦楝 －小麦农林复合生态系统土壤真菌群落结构分析
图 3 根际与非根际土壤真菌多样性分析
Fig． 3 Diversity analysis of fungi in the rhizosphere and non-rhizosphere soil
图 4 DGGE 指纹图谱的主成分分析
Fig． 4 Principal component analysis of DGGE profiles
3 讨论
农林复合经营是一种环境友好的可持续土地利
用方式，可以改变土壤的物理性状并能改善土壤质
量(Ｒivest et al．，2013; Ketema et al．，2014)。土壤
状况的改变进而会影响定居于此的各类微生物
(Vallejo et al．，2012)。尽管已有一些研究涉及到土
壤微生物对这种土地利用方式的反应，但这些研究
主要集中在农林复合经营对微生物生物量的影响
(Vallejo et al．，2012; Tangjang et al．，2009)。目前，
尚未见将 PCＲ-DGGE 技术应用到农林复合生态系
统土壤微生物群落组成与结构的相关报道。本研究
中，笔者采用 18S rDNA PCＲ-DGGE 技术分析了苦
13
林 业 科 学 51 卷
楝 －小麦农林复合生态系统根际及非根际土壤真菌
群落结构与真菌组成。结果表明，在这一复合生态
系统中根际与非根际土壤真菌群落结构间存在差
异，特别是苦楝根际真菌群落结构与非根际土壤差
异显著。此外，研究还发现小麦根际真菌与小麦 －
苦楝农林复合系统中的小麦根际真菌群落结构具有
较高的相似性，表明苦楝对小麦根际真菌群落结构
未造成较大影响。
表 1 DGGE 条带测序结果
Tab. 1 Sequencing results of excised bands from DGGE profiles
条带 Bands 最相似菌株 Closest relative 相似度 Identity (% ) 登录号 Accession No．
1 Diversispora sp． W3033 99 FＲ686934. 1
2 Uncultured eukaryote isolate DGGE gel band BS12-1-5 99 JX406395. 1
3 Sporobolomyces roseus 95 KJ534285. 1
4 Uncultured eukaryote clone D1P01A02 99 EF100203. 1
5 Pyrenophora phaeocomes strain DAOM 222769 99 JN940960. 1
6 Phoma sp． fMP1d 99 KJ467775. 1
7 Acremonium antarcticum strain CBS 987. 87 100 JX158487. 1
8 Acremonium sp． A104 99 KC987179. 1
9 Uncultured Ceratobasidium isolate DGGE gel band F4 99 HM453874. 1
10 Acremonium sp． A109 100 KC987184. 1
11 Volutella ciliata 99 AJ301966. 1
图 5 DGGE 条带的系统发育树
Fig． 5 Phylogenetic tree of sequences derived from DGGE bands
方括号内为序列的 GenBank 登录号 GenBank numbers for the sequences were listed in square brackets．
本研究发现一些根际真菌的相对丰富度有所增
加，具体表现为一些在非根际土壤样品 DGGE 谱图
中较弱的条带在根际土壤样品 DGGE 谱图中强度
明显增加，如条带 4 和 6。笔者的研究结果与根际
细菌群落的变化一致(Smalla et al．，2011)。这种根
际效应在玉米(Zea mays)根际真菌群落的变化过程
中也已发现(Gomes et al．，2003)。究其原因，这种
根际真菌的富集效应可能归因于植物根系分泌物。
根系分泌物富含矿质离子、酶以及各种含碳化合物，
这些物质可能在根际微生物种群富集过程中起重要
作用(Berg et al．，2009; Uren，2000)。也有研究认
为，这种根际效应是由于植物从土壤中选择特定的
微生物到根际造成的( Singh et al．，2007)。还有学
者推测，某些微生物种群在根际的富集不是由于植
物的主动选择作用，而是因为这些微生物为避免被
掠食而进入根际( Turner et al．，2013)。此外，笔者
的研究结果显示，非根际土壤样品 DGGE 谱图中的
优势条带明显少于根际土壤。大多数土壤中的微生
物种群缺乏碳源供给(Garbeva et al．，2011)，而植物
将 40% 左右的光合产物分泌到根际( Bais et al．，
2006)，因此根际的微生物群落密度远远高于周围
的非根际土壤。
23
第 10 期 张 敏等: 苦楝 －小麦农林复合生态系统土壤真菌群落结构分析
植物根系会以一个物种特异的方式影响根际微
生物群落(Berg et al．，2009)，即不同植物会对其根
际微生物产生不同影响。本研究结果表明苦楝根际
真菌群落结构与小麦根际存在较大差异 (相似度
51% )。植物可以通过分泌一些物质选择性刺激或
抑制某些微生物种群从而影响根际微生物群落结构
(Doornbos et al．，2012)。此外，植物还可以通过分
泌次生代谢产物抑制根际某些微生物的生长，如禾
本科(Gramineae)作物的根部可以分泌苯并噁唑嗪
酮类化合物抑制根际某些微生物(Berendsen et al．，
2012)。因此，本研究中苦楝与小麦根际真菌群落
结构的差异可能是由于两者根系分泌物的成分不同
造成的。
PCＲ-DGGE 分析技术已被广泛应用于环境微生
物群落研究。该技术克服了传统微生物培养方法费
时费力及对群落多样性的低估等缺陷。此外，
DGGE 技术可以在同一块凝胶上同时对多个样品进
行分离和比较，分离的条带还可用来克隆测序
(OCallaghan et al．，2006)。尽 管 有 诸 多 优 点，
DGGE 技术也存在一定缺陷。DGGE 分析技术的第
一步是 DNA 的提取，此过程中如果微生物细胞裂解
不充分会影响 DNA 产量，土壤中某些丰富度很低的
种群可能会因此而被低估。PCＲ 扩增过程中引物
的选择会对 DGGE 结果有一定影响，而且不同批次
凝胶电泳结果会有差异，从而造成试验重复稳定性
较差。最近有研究者将焦磷酸测序技术引入森林生
态系统土壤微生物群落研究 ( Hartmann et al．，
2012)，与 DGGE 技术相比焦磷酸测序可以对核酸
序列进行快速准确的测定并且具有较高的覆盖度
(Vaz-Moreira et al．，2011; Leite et al．，2012)。今后
在农林复合生态系统菌群结构分析中可以将 DGGE
与焦磷酸测序技术相结合以获得更为准确的试验结
果。本研究中采用了物种丰富度、香农多样性指数
和均匀度指数 3 个指标对土壤真菌群落的遗传多样
性进行综合评价，结果发现小麦 － 苦楝农林复合系
统中的小麦根际真菌丰富度、多样性指数和均匀度
均比单纯小麦根际真菌高，表明此复合系统中伴生
的苦楝增加了小麦根际真菌的多样性。这一研究结
果可为农林复合经营生产实践提供一些新的参考。
参 考 文 献
Bais H P，Weir T L，Perry L G，et al． 2006． The role of root exudates in
rhizosphere interactions with plants and other organisms． Annual
Ｒeview of Plant Biology，57: 233 － 266．
Berendsen Ｒ L， Pieterse C M J， Bakker P A H M． 2012． The
rhizosphere microbiome and plant health． Trends in Plant Sciences，
17 (8) : 478 － 486．
Berg G，Smalla K． 2009． Plant species and soil type cooperatively shape
the structure and function of microbial communities in the
rhizosphere． FEMS Microbiology Ecology，68(1) :1 － 13．
Broeckling C D，Broz A K，Bergelson J，et al． 2008． Ｒoot exudates
regulate soil fungal community composition and diversity． Applied
and Environmental Microbiology，74 (3) :738 － 744．
Doornbos Ｒ F，van Loon L C，Bakker P A H M． 2012． Impact of root
exudates and plant defense signaling on bacterial communities in the
rhizosphere． A review． Agronomy for Sustainable Development，32
(1) : 227 － 243．
Fanish S A，Priya Ｒ S． 2013． Ｒeview on benefits of agroforestry system．
International Journal of Education and Ｒesearch，1(1) :1 － 12．
Finlay Ｒ D． 2008． Ecological aspects of mycorrhizal symbiosis: with
special emphasis on the functional diversity of interactions involving
the extraradical mycelium． Journal of Experimental Botany， 59
(5) : 1115 － 1126．
Garbeva P，Hol W H G，Termorshuizen A J，et al． 2011． Fungistasis
and general soil biostasis － a new synthesis． Soil Biology and
Biochemistry，43 (3) : 469 － 477．
Gomes N C M，Fagbola O，Costa Ｒ，et al． 2003． Dynamics of fungal
communities in bulk and maize rhizosphere soil in the tropics．
Applied and Environmental Microbiology，69 (7) : 3758 － 3766．
Haichar F Z，Marol C，Berge O，et al． 2008． Plant host habitat and root
exudates shape soil bacterial community structure． The ISME
Journal，2(12) : 1221 － 1230．
Hartmann M，Howes C G，VanInsberghe D，et al． 2012． Significant and
persistent impact of timber harvesting on soil microbial communities
in Northern coniferous forests． The ISME Journal，6(12) : 2199 －
2218．
Hinsinger P，Bengough A G，Vetterlein D，et al． 2009． Ｒhizosphere:
biophysics，biogeochemistry and ecological relevance． Plant and
Soil，321 (1) :117 － 152．
Ketema H，Yimer F． 2014． Soil property variation under agroforestry
based conservation tillage and maize based conventional tillage in
Southern Ethiopia． Soil and Tillage Ｒesearch，141: 25 － 31．
Khan A L，Hamayun M，Kang S M，et al． 2012． Endophytic fungal
association via gibberellins and indole acetic acid can improve plant
growth under abiotic stress: an example of Paecilomyces formosus
LHL10． BMC Microbiology，12: 3．
Leite A M O，Mayo B，Ｒachid C T C C，et al． 2012． Assessment of the
microbial diversity of Brazilian ker grains by PCＲ-DGGE and
pyrosequencing analysis． Food Microbiology，31 (2) : 215 － 221．
Manici L M，Caputo F． 2010． Soil fungal communities as indicators for
replanting new peach orchards in intensively cultivated areas．
Europe Journal of Agronomy，33 (3) :188 － 196．
Mendes Ｒ， Garbeva P， Ｒaaijmakers J M． 2013． The rhizosphere
microbiome: signicance of plant benecial，plant pathogenic，and
human pathogenic microorganism． FEMS Microbiology Ｒeviews，37:
634 － 663．
O Callaghan M，Lorenz N，Gerard E M． 2006． Characterization of
phylloplane and rhizosphere microbial populations using PCＲ and
denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)∥Cooper J E，Ｒao
33
林 业 科 学 51 卷
J Ｒ． Molecular approaches to soil， rhizosphere and plant
microorganism analysis． CABI International， Oxfordshire， UK，
99 － 115．
Ogino A， Koshikawa H， Nakahara T， et al． 2001． Succession of
microbial communities during a biostimulation process as evaluated
by DGGE and clone library analyses． Journal of Applied
Microbiology，91 (4) : 625 － 635．
Ｒivest D，Lorente M，Olivier A，et al． 2013． Soil biochemical properties
and microbial resilience in agroforestry systems: Effects on wheat
growth under controlled drought and ooding conditions． Science of
The Total Environment，463，464: 51 － 60．
Saito A，Ikeda S，Ezura H，et al． 2007． Microbial community analysis of
the phytosphere using culture-independent methodologies． Microbes
and Environments，22 (2) : 93 － 105．
Singh B K，Munro S，Potts J M，et al． 2007． Inuence of grass species
and soil type on rhizosphere microbial community structure in
grassland soils． Applied Soil Ecology，36 (2 /3) : 147 － 155．
Smalla K，Wieland G，Buchner A，et al． 2011． Bulk and rhizosphere
soil bacterial communities studied by denaturing gradient gel
electrophoresis: plant-dependent enrichment and seasonal shifts
revealed． Applied and Environmental Microbiology， 67 ( 10 ) :
4742 － 4751．
Tangjang S，Arunachalam K，Arunachalam A，et al． 2009． Microbial
population dynamics of soil under traditional agroforestry systems in
northeast India． Ｒesearch Journal of Soil Biology，1 (1) : 1 － 7．
Teixeira L C Ｒ S，Peixoto Ｒ S，Cury J C， et al． 2010． Bacterial
diversity in rhizosphere soil from Antarctic vascular plants of
Admiralty Bay，maritime Antarctica． The ISME Journal，4 ( 8 ) :
989 － 1001．
Turner T Ｒ，Ｒamakrishnan K，Walshaw J，et al． 2013． Comparative
metatranscriptomics reveals kingdom level changes in the rhizosphere
microbiome of plants． The ISME Journal，7(12) : 2248 － 2258．
Urbanová M，najdr J，Baldrian P． 2015． Composition of fungal and
bacterial communities in forest litter and soil is largely determined by
dominant trees． Soil Biology and Biochemistry，84: 53 － 64．
Uren N C． 2000． Types，amounts and possible functions of compounds
released into the rhizosphere by soil grown plants∥Pinton Ｒ，Varani
Z， Nanniperi P． The rhizosphere: biochemistry， and organic
substances at the soil interface． Marcel Dekker Inc．，New York，
19 － 40．
Vainio E J，Hantula J． 2000． Direct analysis of wood-inhabiting fungi
using denaturing gradient gel electrophoresis of amplied ribosomal
DNA． Mycological Ｒesearch，104 (8) : 927 － 936．
Vallejo V E， Arbeli Z， Terán W， et al． 2012． Effect of land
management and Prosopis juliora ( Sw． ) DC trees on soil microbial
community and enzymatic activities in intensive silvopastoral systems
of Colombia． Agriculture， Ecosystems ＆ Environment， 150:
139 － 148．
Vaz-Moreira I，Egas C，Nunes O C，et al． 2011． Culture-dependent and
culture-independent diversity surveys target different bacteria: a case
study in a freshwater sample． Antonie van Leeuwenhoek，100 (2) :
245 － 257．
Yu Z T，Morrison M． 2004． Comparisons of different hypervariable
regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities
by PCＲ-denaturing gradient gel electrophoresis． Applied and
Environmental Microbiology，70 (8) : 4800 － 4806．
(责任编辑 朱乾坤)
43