全 文 ：第 51 卷 第 8 期
2 0 1 5 年 8 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 8
Aug．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150803
收稿日期: 2014 － 10 － 08; 修回日期: 2015 － 01 － 21。
基金项目: 国家大学生创新创业训练项目(201210635005) ; 国家蚕桑产业技术体系项目(CAＲS-22-ZJ0102) ; 国家农业部公益性行业(农
业)科研专项(201403064)。
* 赵爱春为通讯作者。
桑树 Na + /H + 逆向转运蛋白基因(MnNHX1)
的克隆与耐盐力表达*
边晨凯 龙定沛 刘雪琴 魏从进 龚加红 赵爱春
(西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室 农业部蚕桑功能基因组与生物技术重点实验室 重庆 400716)
摘 要: 【目的】研究川桑液泡膜型 Na + /H +逆向转运蛋白(NHX)基因的功能，探究桑树耐盐机制，为植物抗
逆基因工程筛选提供优良的候选基因。【方法】以川桑基因组数据库为基础，基于同源基因序列的保守性，以川
桑叶片 cDNA 为模板克隆川桑液泡膜型 NHX 基因; 利用生物学软件和在线公共平台，分析所得基因编码的蛋白
质序列及功能结构域，并构建系统进化树，分析与其他物种的亲缘关系。采用荧光定量 PCＲ 方法研究在 NaCl 胁
迫条件下不同时间段‘湖桑 32 号’根、茎、叶等不同组织中桑树 NHX1 表达量的变化情况; 通过构建超量表达载
体，将其转化到拟南芥中，分析转基因拟南芥在 NaCl 胁迫环境中的种子发芽数，根长、侧根生长情况和幼苗成活
率，并对转基因拟南芥连续浇灌含高浓度 NaCl 的营养液，研究过量表达 NHX 基因对拟南芥的影响。【结果】本
研究得到 1 个液泡膜型 NHX 基因，命名为 MnNHX1 ( GenBank 登录号: KJ720637) ; 该基因 OＲF 长度为 1 644
bp，编码 547 个氨基酸残基，具有 Na + /H +交换泵，且在其上游含有抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点( LFFIYLLPPI)
以及糖基化位点等结构域，TMHMM 在线程序预测 MnNHX1 具有 12 个明显的跨膜结构区 ; 系统进化树分析
结果显示，MnNHX1 具有较高的保守性，先与源于蔷薇科的桃聚合，与桑树形态学和基因组进化分析分类结
果一致。荧光定量 PCＲ 试验表明，在无 NaCl 胁迫条件下桑树 NHX1 在‘湖桑 32 号’根、茎、叶中均有表达 ;
在 NaCl 胁迫处理 12 h 后，根、茎中桑树 NHX1 的表达量显著增加，而后回落 ; 而在胁迫处理 24 h 后，叶中桑
树 NHX1 的表达量显著提高，随后回落。过量表达 MnNHX1 的转基因拟南芥在 NaCl 胁迫环境中，种子发芽
率低于野生型，而根长和侧根生长情况以及幼苗成活率都优于野生型 ; 连续浇灌含高浓度 NaCl 营养液的转
基因拟南芥生长状态更为优良。【结论】MnNHX1 为优良的植物耐盐基因，在桑树中为组成型表达，并受
NaCl 胁迫诱导，表现出组织特异性。过量表达 MnNHX1 的拟南芥耐盐能力显著提高，生存在盐胁迫环境中，
依然具有良好的生长和发育能力。
关键词: 桑树; Na + /H +逆向转运蛋白; 非生物胁迫; 耐盐性; 基因功能
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)08 － 0016 － 10
Cloning and Expression to Salt Stress of Na + /H +
Antiporter Gene (MnNHX1) in Mulberry Tree
Bian Chenkai Long Dingpei Liu Xueqin Wei Congjin Gong Jiahong Zhao Aichun
( State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology Key Laboratory for Sericulture Functional Genomics and
Biotechnology of Ministry of Agriculture Southwest University Chongqing 400716)
Abstract: 【Objective】 To study the function of Na + /H + antiporter (NHX) in vacuolar membrane from mulberry tree
Morus notabilis，and to explore the mechanism of salt tolerance in mulberry，and to provide an excellent candidate gene for
the screening of plant resistance gene engineering． 【Method】In this study，a Na + /H + antiporter gene named as MnNHX1
was identified based on the M． notabilis genomic database and other homologous sequences． The MnNHX1 was cloned
using the cDNA from M． notabilis leaves as template． The analysis of the primary structure and functional domains from
MnNHX1 was completed by the bioinformatics analysis． The phylogenetic tree was generated to analyse the relationships
between mulberry NHX1 and other species． Quantitative PCＲ was conducted to analyse the expression profiles of mulberry
第 8 期 边晨凯等: 桑树 Na + /H +逆向转运蛋白基因(MnNHX1)的克隆与耐盐力表达
NHX1 in different tissues of M． multicaulis‘Husang No． 32’and treatment time under NaCl stress． The overexpression
vector was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana． The seed germination rate，the growth of roots and the
survival rate of seedlings of the transgenic A． thaliana were analyzed under NaCl stress． Furthermore，the transgenic A．
thaliana was continuously irrigated with the nutrient solution containing high concentration of NaCl to study the functional
effects of MnNHX1 gene in the transgenic A． thaliana． 【Ｒesult】We cloned a Na + /H + antiporter gene designated as
MnNHX1(GenBank accession No． KJ720637) ． The open reading frame (OＲF) of MnNHX1 is 1 644 bp and encodes a
protein of 547 amino acid with a Na + /H + exchange pump． At the upstream of this pump，there are some domains such as
inhibitors amiloride binding sites (LFFIYLLPPI) and glycosylation sites． The analysis of the online program of TMHMM
showed that MnNHX1 have 12 obvious transmembrane region． Phylogenetic analysis showed that MnNHX1 was firstly
clustered with Prunus persica from the Ｒosaceae family，which is consistent with morphological classification and genomic
phylogenetic analysis of mulberry． Quantitative PCＲ showed that expression of mulberry NHX1 was detected in roots，
stems and leaves of M． multicaulis‘Husang No． 32’without NaCl treatment． The expression levels of mulberry NHX1 were
significantly increased followed by a drop in roots and stems after 12 h salt treatment，and in leaves after 24 h treatment．
The seed germination rate of transgenetic A． thaliana overexpressed MnNHX1 was lower than that of the wild plants under
the salt condition，but root length，growth of lateral roots and survival rate of seedlings were higher than those of the wild
plants ． When the transgenetic A． thaliana seedlings irrigated with high concentration NaCl，they grew better than the wide
type plants． 【Conclusion】MnNHX1 is a excellent candidate gene for improving the salt tolerance and can be constitutively
expressed in mulberry tree． However， its induced expression pattern showed tissue specificity under salt condition．
Furthermore，overexpression of MnNHX1 in A． thaliana can significantly improve the salt tolerance of the transgenic A．
thaliana．
Key words: Morus; Na + /H + antiporter; abiotic stress; salt tolerance; gene function
土壤盐渍化影响着植物的生存与生长，使作物
的产量和品质大幅度下降，耕地面积不断减少，对农
业生产和生态环境都有很大影响，已成为一个世界
性的资源与生态难题 ( Shabala et al．，2008)。盐胁
迫会导致大量的 Na + 积累在植物细胞中，影响细胞
的 pH 值和渗透压，破坏离子平衡，影响吸收其他必
需元素，导致植物代谢紊乱，破坏植物正常的发育和
生长(Zhu，2001; Leidi et al．，2010);而植物细胞会
采用 Na + 的区隔化、Na + 的外排以及渗透调节等方
式来降低胞质中 Na +的浓度，避免过高浓度的 Na +
对细胞产生的毒害作用，维持细胞内环境的稳定
(Brini et al．，2012)。研究表明，植物 Na + /H + 逆向
转运蛋白(Na + /H + antiporter，NHX)在耐盐调控中
发挥着重要作用(Qiu，2012)。
根据 NHX 家族蛋白在细胞中分布和作用位置
的不同，可将 NHX 家族蛋白分为 3 类(Bassil et al．，
2012): 位于质膜 ( plasma membrane) 的 NHX 通过
消耗能量的逆向转运方式将 Na + 从胞质中排出胞
外，减弱其对细胞产生的盐害作用 (Munns et al．，
2008); 位于内体膜 ( endosomal membrane)的 NHX
调节细胞器中 Na + 的浓度，维持细胞器的 pH 值和
离子平衡，影响细胞器内蛋白质的分选和细胞的应
激反应(Bassil et al．，2011); 位于液泡膜 ( vacuolar
membrane)的 NHX 通过产生的 H + 电化学梯度将
Na +运输进入液泡，可将排入的 Na + 作为离子渗透
调节剂，避免细胞水分的进一步流失 ( Blumwald，
2000)，影响植物的生长和发育(Apse et al．，2003)。
研究表明，过量表达液泡膜型 NHX 可提高植株耐盐
能力 ( Liu et al．，2010 )。在 拟 南 芥 ( Arabidopsis
thaliana) 中 首次 克 隆得 到高 等植 物 液泡膜 型
AtNHX1(Apse et al．，1999)，其将 Na +区隔进入叶的
液泡中，在拟南芥、番茄 ( Solanum lycopersicum )
(Zhang et al．，2001)中过量表达后得到在高盐环境
中正常生长的转基因植株;棉花 ( Gossypium spp． )
(Wu et al．，2004)、大麦(Hordeum vulgare)(Vasekina
et al．，2005)、玉米(Zea mays) (Zoerb et al．，2005)、
大豆( Glycine max) ( Sun et al．，2006 )等液泡膜型
NHX1 的功能也相继得到验证。
桑树(Morus)是多年生木本植物，一直以来都
是家蚕饲料的主要来源，同时因其具有耐旱、耐盐等
生态价值，也是滨海滩涂等盐碱地治理的重要树种
(秦俭等，2010; 刘雪琴等，2014 )。川桑 (Morus
notabilis)基因组测序的完成 (He et al．，2013)为桑
树抗逆分子生物学研究奠定了坚实的基础，但目前
只有 MnMAPKs 等(Wei et al．，2014)少数关于桑树
抗逆分子生物学的研究报道。为了了解桑树抗盐性
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林 业 科 学 51 卷
的分子机制，本研究以川桑为材料，克隆得到了桑树
液泡膜型 NHX 基因 MnNHX1; 利用荧光定量 PCＲ
方法研究‘湖桑 32 号’(Morus multicaulis‘Husang
No． 32’)在 NaCl 胁迫条件下，在不同时间、不同组
织中 NHX1 表达量的变化情况，利用植物过量表达
载体，探索了 MnNHX1 在转基因拟南芥中过量表达
对植株抗盐性的影响，为 MnNHX1 进一步的开发利
用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为野生川桑 (取自四川雅安)的嫩叶
(用于提取克隆 MnNHX1 的 mＲNA)和鲁桑 (Morus
multicaulis)品种‘湖桑 32 号’约 20 cm 高苗木的根、
茎和叶(种子收获于西南大学桑树种质资源圃，种
子萌发后移栽控温植物箱得到桑苗，所取不同组织
用于提取 qＲT-PCＲ 试验的 mＲNA)。野生 Columbia
型拟南芥(西南大学罗克明教授惠赠)用于遗传转
化; 拟南芥超量表达载体为 pLGNL (本实验室保
存)，该载体含有 GUS 和 Kan 双重筛选标记以及由
CaMV35S 启动子控制目的基因表达元件; EHA105
型根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens) (本实验
室保存)用于介导拟南芥的遗传转化。
反转 录 酶 M-MLV 及 ＲNA 酶 抑 制 剂 购 自
Promega 公司，BamHⅠ和 EcoＲⅠ限制性内切酶、
ＲNA 提取试剂 ＲNAiso Plus、pMD19-T 载体、荧光定
量试剂、pBI121 和 DNA 聚合酶购自 TaKaＲa 公司，
T4 -DNA 连接酶购自成都天泰生命科技有限公司，大
肠杆菌(Escherichia coli)DH5α 感受态细胞购自北京
全式金生物技术有限公司，Murashige ＆ Skoog 基础
盐混合物(MS)购自重庆升博科技有限公司。华大
基因公司完成引物合成和测序任务。
1. 2 MnNHX1 克隆及序列分析
将 － 80 ℃冻存的川桑叶片置于研钵中，加入液
氮，研磨为粉状，根据 ＲNAiso Plus 使用说明书提取
总 ＲNA，使用 NANODＲOP2000 仪器检测 ＲNA 的浓
度和纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测 ＲNA 的完整
度。根据反转录试剂盒，以 3 μg 提取的总 ＲNA 为
模板，体外反转录合成川桑 cDNA。
将各物种 NHX1 蛋白序列从 NCBI(http:∥www．
ncbi． nlm． nih． gov /)网站上下载，根据 tblastn 比对结
果，从川桑基因组中获得一个预测的 NHX1 基因。根
据预 测 序 列 设 计 引 物 (上 游 引 物 序 列: 5-
ATGACTGGAGTTTTGAGCTATGCCG-3; 下游引物序
列: 5-TCATTCCCATTGAGCAGGAGGAG-3)，以反转
录得到的 cDNA 为模板扩增得到川桑 NHX1 基因条
带。反应体系为 25 μL，反应程序为: 94 ℃预变性
5 min; 94 ℃变性 40 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸
90 s，30 个循环; 72 ℃ 延伸 10 min。扩增产物用
1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收目的基因片段
并与 pMD19-T 载体连接，连接产物转化至大肠杆菌
DH5α 感受态细胞，37 ℃培养后挑选阳性克隆送华大
基因公司测序验证，将获得的该基因命名为 MnNHX1
(GenBank 登录号: KJ720637)。
MnNHX1 编码氨基酸翻译使用 BioEdit 软件，蛋
白质基本理化性质预测使用 ExPASy 在线程序
(http:∥web． expasy． org /)，蛋白质跨膜结构域预测
使用 TMHMM 在线程序 ( http:∥www． cbs． dtu． dk /
services /TMHMM)，蛋白质结构域预测使用 SMAＲT
在线程序(http:∥smart． embl-heidelberg． de /)。
1. 3 MnNHX1 蛋白多重序列比对及进化分析
使用 ClusatalX 软件对其他物种的 NHX1 蛋白
序列和 MnNHX1 序列进行多重序列比对，使用
GENEDOC 软件分析比对结果。应用 MEGA5. 1 软
件构建 NJ 系统进化树，bootstrap 值设置为 1 000，分
析 MnNHX1 与其他物种 NHX1 之间的进化关系。
1. 4 桑树 NHX1 表达分析
将使用无菌水清洗过的‘湖桑 32 号’种子在
4 ℃春化 2 ～ 3 天，选取饱满的种子置于铺有湿润滤
纸的培养皿中，然后转入人工智能培养箱中培养，待
种子萌发后播种于混合土中(营养土 ∶ 蛭石 ∶ 珍珠岩
的体积比为3∶ 1 ∶ 1)。2 个月后，选取生长情况相似
的幼苗浇灌含有 200 mmol·L － 1 NaCl 的营养液 200
mL 。分别在高盐溶液处理 0，12，24，48 h 后，取‘湖
桑 32 号’根、茎、叶等组织，液氮速冻，置于 － 80 ℃
冰箱中备用。以提取处理不同时间、不同组织材料
的 cDNA 为模板，进行荧光定量 PCＲ 试验(上游引
物序列: 5-GCGACCTTGTCATTTGTTG-3; 下游引
物序列: 5-TTCCAGGACTATCACTCACGT-3)，并分
析试验结果(反应条件为: 95 ℃预变性30 s; 95 ℃
变性 5 s，60 ℃延伸 30 s，40 个循环)。
1. 5 构建 MnNHX1 超量表达载体及转化拟南芥
在 MnNHX1 上游、下游引物分别加上 BamHⅠ
酶切位点、EcoＲⅠ酶切位点，进行 PCＲ 反应，回收目
的片段与 pMD19-T 载体连接，连接产物转化至大肠
杆菌 DH5α 感受态细胞中，37 ℃培养后挑选出阳性
克隆送华大基因公司测序验证。用 BamHⅠ和
EcoＲⅠ对超量表达载体 pLGNL 和 pMD19-MnNHX1
进行双酶切，T4 -DNA 连接酶连接回收的目的片段和
pLGNL 骨 架，将 构 建 的 超 量 表 达 载 体 pLGNL-
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第 8 期 边晨凯等: 桑树 Na + /H +逆向转运蛋白基因(MnNHX1)的克隆与耐盐力表达
MnNHX1 转入农杆菌感受态细胞，28 ℃培养后挑选
阳性菌斑。
采用蘸花法将构建的超量表达载体 pLGNL-
MnNHX1 转入处于开花期的拟南芥中，黑暗环境中
培养 1 天后转入人工培养箱，收取成熟种子。种子
在 1 /2MS 培养基(1 /2MS 2. 17 g·L － 1 + 蔗糖 30 g·
L － 1 +琼脂 7 g·L － 1，pH6. 0)使用卡那霉素(Kan)筛
选转基因幼苗，筛选后转入营养土中种植。
1. 6 转基因拟南芥耐盐性的鉴定
提取生长 1. 5 个月的转基因拟南芥幼苗叶片总
ＲNA，并体外反转录为 cDNA。以拟南芥 ACTIN2 基
因(Gene ID: 821411)为内参基因(McDowell et al．，
1996 )，通 过 ＲT-PCＲ ( 上 游 引 物 序 列: 5-
ATCGGAAGAGCAGCATTTATT-3; 下游引物序列:
5-TGAGTATGACCTGCCCTTGTA-3) 检测 MnNHX1
在转基因拟南芥叶片中的表达情况 (反应条件为:
94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 40 s，60 ℃退火 30 s，
72 ℃延伸 30 s，30 个循环; 72 ℃延伸10 min)。根
据 ＲT-PCＲ 试验结果筛选 MnNHX1 表达差异的转基
因植株，收取种子并种植得到 T3 代种子用于耐盐性
鉴定试验。
取野生型 (WT)和转基因系 T3 代种子各 100
粒，分为 2 组，消毒(种子消毒液: 500 μL 漂渍液加
5 μL 吐温 － 20 定容于 10 mL)后均匀涂布于含有
100 mmol·L － 1 NaCl 的 MS 培养基(蔗糖 30 g·L － 1 +
MS 4. 33 g·L － 1 + 琼脂 7 g·L － 1，pH6. 0)上，于人工
培养箱中培养 6 天后记录其发芽数。
取野生型和转基因系 T3 代生长 1 周幼苗各 10
株，分为 2 组，平行放置于含有 150 mmol·L － 1 NaCl
的培养基中，垂直生长 10 天后观察其根长长度和侧
根数目。再取生长 1 周的幼苗各 100 株，分为 2 组，
放置于含有 200 mmol·L － 1 NaCl 的培养基中，每天
记录其死亡数。将野生型和 3 株转基因系种植到同
一盆中，并做 3 次重复，生长 4 周后，每隔 3 天浇灌
含有 200 mmol·L － 1 NaCl 的营养液 150 mL，浇灌 1. 5
个月后，观察其生长状况。
2 结果与分析
2. 1 MnNHX1 的克隆及序列特征
经克隆分析得到产物长度为 1 644 bp 的基因序
列(图 1)，该基因共编码 547 个氨基酸残基(图 2)，
将其与预测的川桑 NHX1 基因序列比对分析发现，
该基因即为目的基因 MnNHX1。ExPASy 在线程序
预测 MnNHX1 编码蛋白的分子质量为 60. 46 kDa，
等电点为 8. 66。TMHMM 在线程序对其跨膜结构域
的分析表明，MnNHX1 为一个典型的跨膜转运蛋
白，具有 12 个明显的跨膜结构区，其中包括 2 个未
完全跨膜区(图 3)，其为 NHX 重要结构域，与 Na +
结合(张雨良等，2009)。
NHX1 蛋白质序列的 ClustalX 比对结果显示，
NHX1 蛋白序列具有高度保守区，MnNHX1 蛋白序
列中含有 Na + 和 H + 转运的关键结构域———Na + /
H +交换泵，这为 NHX 的典型特征;且在 Na + /H +交
换泵上游含有 NHX 抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点
(LFFIYLLPPI)(Gaxiola et al．，2001)以及糖基化位
点等结构域(图 4)。
图 1 MnNHX1 的 PCＲ 扩增结果
Fig． 1 PCＲ amplification of MnNHX1
M: Trans 2K marker;1 － 2: MnNHX1 片段 MnNHX1 DNA fragment．
2. 2 MnNHX1 的进化分析
从 MnNHX1 和其他物种的 NHX1 蛋白序列构
建的系统进化树(图 5)中可以看出，NHX1 可明显
分为单子叶植物 ( monocotyledons) 和双子叶植物
(dicotyledons)两大类。川桑的 NHX1 与来自蔷薇科
(Ｒosaceae)的桃 (Prunus persica)首先聚在一起，序
列相似度为 86%，表明 NHX1 家族在进化上具有较
高的保守性。这一结果与桑树 APGⅢ的分类结果
(The Angiosperm Phylogeny Group，2009)以及桑树
基因组进化分类结果(He et al．，2013)是一致的。
2. 3 桑树 NHX1 的表达分析
通过荧光定量 PCＲ 试验研究‘湖桑 32 号’在
NaCl 胁迫条件下，在不同时间、不同组织中桑树
NHX1 表达量的变化情况 (图 6 )。结果表明: 无
NaCl 胁迫诱导条件桑树 NHX1 在不同的组织中均
有表达，但表达不存在显著性差异; 200 mmol·L － 1
NaCl 胁迫处理 12 h 后，叶中表达量无显著变化，但
根、茎中桑树 NHX1 的表达量显著增加; 胁迫处理
24 h 后，叶中桑树 NHX1 的表达量显著升高，基因的
表达量提高约 40 倍; 之后所有组织中表达量都出
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林 业 科 学 51 卷
图 2 MnNHX1 序列和编码的蛋白氨基酸序列
Fig． 2 The coding sequence and deduced amino acid sequence of MnNHX1
方框为氨氯吡嗪脒结合位点，双下划线为糖基化位点，单下划线为跨膜结构域; “* ”表示终止密码子。
The coding sequence and deduced amino acid sequence of MnNHX1 amiloride binding sites in box; Glycosylation sites in double
underline; Transmembrane domains sites in single underline; “* ”indicates stop codon．
现回落，但叶中表达量依然最高。以上现象表明，在
NaCl 胁迫条件下，桑树 NHX1 在‘湖桑 32 号’根、茎
和叶中的表达均受到 NaCl 胁迫的诱导，但叶中的表
达量变化最为显著。
2. 4 转基因拟南芥株系的构建及 ＲT-PCＲ 检测
采用蘸花法将超量表达载体转化至拟南芥中，
通过抗生素筛选种子得到 27 株 T1 代转基因拟南芥
株系。从 中 随 机 挑 选 7 株 转 基 因 株 系，检 测
MnNHX1 在不同转基因拟南芥植株中的表达情况
(图 7)。为进一步确定阳性植株，对筛选得到的转
基因植株进行 GUS 染色验证(图 8)。结果显示，在
不同转基因株系中，MnNHX1 的表达量并不相同，
T1、T2 号植株表达量较低，T6 号植株表达量最高，
而 T7 号植株可能由于转入了空载载体没有检测到
基因表达。
2. 5 转基因拟南芥耐盐性的增强
统计种子的发芽率是分析盐胁迫应答的一种有
效且快速的方法，植物的低发芽率是一种对高盐环
境的适应性表现(Verslues et al．，2006)。图 9A 所
示为野生型和转基因拟南芥 T3 代种子的发芽情况，
在相同条件培养 7 天后，野生型拟南芥 (WT)发芽
数最多，6 号转基因系发芽数最少; 统计学分析结
果显示，2 号和 6 号转基因系的发芽率与野生型存
在显著性差异(图 9D)。研究结果说明转基因拟南
芥种子与野生型种子相比，对高盐环境的适应性
更强。
根长和侧根数显示了植物在受到 NaCl 胁迫时
获得水源的能力。图 9B 所示为野生型和转基因拟
南芥 T3 代植株幼苗在同一盐处理的 MS 培养基中
根长和侧根生长情况，在垂直生长 10 天后，转基因
株系相对于野生型株系在根长和侧根数上都表现出
了一定的生长优势，根长和侧根数均大于野生型;
统计学分析结果显示，虽然转基因拟南芥株系与野
生拟南芥在根长上没有显著性差异，但是 6 号转基
因株系侧根数显著增多(图 9E)。研究结果说明转
基因拟南芥株系在高盐环境中拥有更强获取水源、
提供自身生长的能力。
幼苗在 NaCl 胁迫环境中的成活率是验证植株耐
盐性最为直接、有效的方法。图 9C 所示为野生型和
转基因拟南芥幼苗在同一高盐处理的 MS 培养基中
的生长情况。在培养 6 天后，野生型拟南芥植株发
白、变黄严重，存活株系叶泽发暗，生长状况差; 而转
基因拟南芥有些植株仍缓慢生长，整体成活率较高;
统计学分析结果显示，转基因株系的死亡率均低于野
02
第 8 期 边晨凯等: 桑树 Na + /H +逆向转运蛋白基因(MnNHX1)的克隆与耐盐力表达
图 4 桑树和其他物种 NHX1 的多重序列比对
Fig． 4 Multiple sequence alignment of NHX1 from mulberry and other species
单下划线为氨氯吡嗪脒结合位点，方框为 Na + /H + 交换泵，双下划线为糖基化位点。The amiloride binding sites is shown in single underline． The
Na + /H + exchange pump is shown in box． The glycosylation sites is shown in double underline．
Hv: 大麦 Hordeum vulgare (AAS17948); Os: 稻 Oryza sativa (BAA83337); Zm: 玉米 Zea mays (AAP20428); At: 拟南芥 Arabidopsis thaliana
(AAT95387); Bn: 欧洲油菜 Brassica napus (AAO38856); Ag: 北滨藜 Atriplex gmelini (BAB11940); Mn: 川桑 Morus notabilis (KJ720637);
Gh: 陆地棉 Gossypium hirsutum (AAM54141); Gm: 大豆 Glycine max (AAY43006); Vv: 葡萄 Vitis vinifera (AAV36562); Pe: 胡杨 Populus
euphratica (ACU01852); Ta: 普通小麦 Triticum aestivum (AAK76738) ．
图 3 MnNHX1 跨膜结构域预测
Fig． 3 Transmembrane domains forecast of MnNHX1
生型，其中 5 号和 6 号转基因株系与野生型株系相
比，死亡率显著降低(图 9F)。转基因拟南芥株系高的
成活率表明其在高盐环境中能保持更为优良的性状。
图 9G 所示为野生型和转基因拟南芥连续浇灌
含高浓度 NaCl 营养液的生长状态。野生型拟南芥生
长出现明显抑制，茎秆短小，叶子发黄、失水萎缩; 而
转基因拟南芥植株性状优良，茎秆高长，其中转基因
拟南芥 6 号植株不仅叶子呈嫩绿色、花序完整，而且
还结出饱满的种子荚，具有良好的生长和发育能力。
研究结果说明转基因拟南芥植株在持续受 NaCl 胁迫
时能保持良好的生存能力。
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林 业 科 学 51 卷
图 5 桑树和其他物种 NHX1 的进化分析
Fig． 5 Phylogenetic analysis of NHX1 in mulberry and other plants
节点值是 1 000 次重复抽样分析的支持百分率。The numbers at each node represent the bootstrap values based on 1 000 repetitions．
图 6 桑树 NHX1 在 NaCl 胁迫条件下的
荧光定量 PCＲ 分析
Fig． 6 Quantitative PCＲ analysis under salt stress of NHX1 of mulberry
运用 LSD 方法检验各处理间的差异显著性，柱形图上的字母不同表
示有 显 著 性 差 异 ( P ≤ 0. 05 )。 Significance of difference between
treatments was determined by LSD method． Different letters above the bars
indicate significant difference at P≤0. 05．
3 讨论
通过重建离子平衡提高植株忍受盐胁迫的能力
是许多物种的耐盐机制 ( Guan et al．，2011)，因此
NHX 基因成为广泛研究并具有开发价值的植物耐
盐基因之一。本研究从野生川桑的 cDNA 中克隆得
到 1 个液泡膜型 NHX 基因 MnNHX1，对其编码的蛋
白质预测显示，MnNHX1 具有典型的跨膜结构，跨
膜区数目与已报道的 NHX 跨膜区数目相似 (10 ～
12)，具有典型的 Na + /H +交换泵结构域。系统进化
分析表明，MnNHX1 属于液泡膜型 NHX，与双子叶
植物聚为一类，亲缘关系较近，表明单、双子叶植物
NHX 在进化上存在差异(唐欣等，2014)。
在单盐胁迫环境中，液泡膜 NHX 将 Na +区隔进
入液泡中，重建细胞中的离子平衡，达到耐盐效果。
本研究发现在对‘湖桑 32 号’进行 NaCl 胁迫处理
时，其根、茎 NHX1 在处理早期表达量高于叶中的表
达量，随着时间的推移，叶中的表达量上升; 对
ZmNHX1( Zoerb et al．，2005 )，ThNHX1 (Wu et al．，
2009)，VrNHX1(Sagarika et al．，2014)的研究也出现
类似结果。由于根系是吸收水分或 Na +进入植株体
的最主要器官，而茎是运输离子的主要器官，因此推
22
第 8 期 边晨凯等: 桑树 Na + /H +逆向转运蛋白基因(MnNHX1)的克隆与耐盐力表达
图 7 MnNHX1 在转基因拟南芥叶片中表达的 ＲT-PCＲ 检测
Fig． 7 ＲT-PCＲ analysis of MnNHX1 expression in
leaves of transgenic Arabidopsis thaliana
WT: 野生型拟南芥; 1 － 7: 转 MnNHX1 拟南芥株系。
WT: Wild-type A． thaliana; 1 － 7: Transgenic A． thaliana lines．
图 8 转基因拟南芥的 GUS 染色
Fig． 8 GUS staining of transgenic A． thaliana
图 9 转基因拟南芥功能验证
Fig． 9 Functional verification of transgenic A． thaliana
A: 种子萌发状况; B: 根长和侧根生长状况; C: 高盐生长状况; D: 发芽数和发芽率统计; E: 根长和侧根数统计; F: 死亡数和死亡率统计;
G: 转基因拟南芥盐水浇灌。
Line2，Line5，Line6: 转基因拟南芥株系。运用 LSD方法检验各处理间的差异显著性，柱形图上的字母不同表示有显著性差异(P≤0. 05)。
A: Seed germination conditions; B: Ｒoot length and lateral root growth conditions; C: Growth under high salt conditions; D: Statistics of germination and
germination rate; E: Statistics of root length and number of lateral roots; F: Statistics of number of deaths and mortality; G: Irrigate salt water to transgenic A．
thaliana．
Line2，Line5，Line6: Transgenic A． thaliana lines． Significance of difference between treatments was determined by LSD method，and different letters
above the bars indicate significant difference at P≤0. 05．
32
林 业 科 学 51 卷
测这可能是根和茎在短时间 NaCl 胁迫条件下细胞
中桑树 NHX1 表达量上调的主要原因。而叶片是液
泡集中和发挥区隔化作用的主要器官，随着处理时
间增长，大量 Na +进入叶片，这是桑树 NHX1 在叶中
表达量明显提高最主要的原因。
在植株的不同组织中，NaCl 胁迫对 NHX1 诱导
的表达模式相似，都是先升高后缓慢降低，诱导表达
水平的高低具有组织差异性。本研究发现，在高盐
处理 12 h 后，‘湖桑 32 号’根中 NHX1 表达量提高
了近 4 倍，而叶中 NHX1 表达量出现了下调; 随着
处理时间的增长，处理 24 h 后，叶中 NHX1 表达量
大幅度提高，而根、茎中 NHX1 表达量出现回落，茎
中 NHX1 表达量水平甚至低于对照。研究结果表明
NaCl 胁迫诱导不同组织中 NHX1 表达量高低是存
在差异的，这与 AtNHX1 ( Quintero et al．，2000 )，
GhNHX1(Wu et al．，2004)的研究结果相似。
NHX 在植物中存在组成型表达和诱导性表达 2
种形式(张智俊等，2011)。其中诱导型表达受外界
环境的影响，只有存在盐胁迫诱导时，才能检测到
NHX 蛋白的活性; 但组成型表达不受外界环境干
扰，在任何条件下都能检测到 NHX 蛋白持续表达，
其中受盐胁迫后 NHX 蛋白的表达量显著提高。研
究发现，拟南芥、水稻(Fukuda et al．，1999)、玉米、大
豆等植物中 NHX 都为组成型表达。桑树 NHX1 未
进行 NaCl 胁迫时，在‘湖桑 32 号’根、茎、叶中都检
测到了 NHX 蛋白的活性，经高盐环境诱导后，表达
量显著提高，表明桑树 NHX1 也为组成型表达。
在高盐胁迫条件下，高发芽率并不与随后生长
过程的耐盐性直接相关 ( Almansouri et al．，2001;
Saleki et al．，1993)。在大多数情况下，通过 ABA 抑
制种子萌发和初期生长是一种适应性的应答表现，
这种机制延迟了早期种子的萌发和生长，减少蒸腾
水的丢失，保持自身更好的生长状态( Verslues et
al．，2006)。
AtNHX1 在拟南芥 ( Apse et al．，1999 )、番茄
(Zhang et al．，2001)、荞麦 ( Fagopyrum esculentum)
(Chen et al．，2008)中过量表达，AeNHX1(Qiao et al．，
2007)、MsNHX1(An et al．，2008)和 DmNHX1(Zhang
et al．，2012)在拟南芥中过量表达，可使转基因植株
在高盐环境中正常生长，显著提高了植株的耐盐性。
本研究结果也显示，将 MnNHX1 在拟南芥中过量表
达后，在连续浇灌含 200 mmol·L － 1 NaCl 的营养液
时，转基因拟南芥表现出良好的生长发育能力。因
此，转单一基因能使转基因植株在高盐环境中更好
地发育和生长。
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(责任编辑 徐 红)
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