全 文 ：第 51 卷 第 4 期
2 0 1 5 年 4 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 4
Apr．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150407
收稿日期: 2014 － 10 － 23; 修回日期: 2014 － 11 － 28。
基金项目: 国家自然科学青年基金项目(31400579) ; 海南省自然科学基金项目(314139)。
* 仇键为通讯作者。
橡胶树 HbMYB20 基因的克隆及其对
拟南芥次生壁发育的调控*
刘 彤1，2 杨文凤2 校现周2 魏 芳2 高宏华2 罗世巧2 吴 明2 仇 键2
(1．海南大学农学院 海口 570228; 2．中国热带农业科学院橡胶研究所 儋州 571737)
摘 要: 【目的】MYB 转录因子是调控植物木质素合成和次生壁形成的重要转录因子之一。本文分离克隆到一
个与拟南芥 AtMYB20 高度同源的橡胶树 MYB 转录因子基因 HbMYB20，并在拟南芥中对其功能进行研究，以期了解
其在橡胶树木质素合成和次生壁发育的分子调控中的作用，为橡胶树木材形成的分子调控机制研究及其遗传改良
奠定基础。【方法】采用 blast 分析从树皮转录组中筛选出与拟南芥 AtMYB20 序列同一性较高的橡胶树 MYB 基因
HbMYB20; 设计 OＲF 区特异性引物，以树皮 cDNA 为模板进行扩增得到该目的基因 cDNA 序列。实时荧光定量
PCＲ 检测该基因在橡胶树叶片、胶乳、茎干以及木质部与韧皮部的相对表达量。构建 HbMYB20 过表达植物载体，
使用农杆菌蘸花法转化拟南芥，获得该基因过表达转基因株系。采用乙酰溴法和间苯三酚染色法，分析转基因、野
生型拟南芥茎的木质素含量以及木质素在拟南芥茎基部横截面中的分布。对转基因、野生型拟南芥茎基部横截面
切片进行甲苯胺蓝染色，并测量分析导管、木质纤维和维管束间纤维细胞的细胞壁厚度。最后，采用实时荧光定量
PCＲ 分析转基因及野生型拟南芥木质素和纤维素合成相关酶基因的表达。【结果】克隆得到 1 个橡胶树 MYB 转录
因子基因 HbMYB20，该基因开放阅读框 (OＲF)为 927 bp，编码 309aa 的蛋白，氨基酸序列分析显示，HbMYB20 与
AtMYB20 /43 和 AtMYB85 /42 同源性较高，属 Ｒ2Ｒ3MYB 转录因子 G8 亚组成员。表达分析显示 HbMYB20 在橡胶树
茎干和木质部中高表达，胶乳中表达最低。对 HbMYB20 过表达拟南芥分析显示，该基因在 3 个转基因株系中均表
达; 相对野生型拟南芥，转 HbMYB20 拟南芥植株生长抑制，木质部和维管束间纤维的木质素染色面积较少、染色程
度变浅，茎的木质素含量和木质纤维、导管及维管束间纤维的细胞壁厚度均显著低于野生型; 同时转基因株系中木
质素合成关键酶基因 4CL1 和 CCoAOMT 的表达量以及纤维素合成关键酶基因 CesA8 的表达显著下调。【结论】橡
胶树 MYB 转录因子 G8 亚组成员 HbMYB20，在茎和木质细胞中高表达。拟南芥中过表达 HbMYB20 导致转基因植
株的矮小，细胞壁变薄，阻碍木质部中木质素的合成和积累，同时木质素和纤维素合成相关酶基因的表达显著下
降。由此推测 HbMYB20 对拟南芥的木质素和纤维素合成都具有负调控作用，可能是 1 个橡胶树次生壁发育的负
调控因子。
关键词: 橡胶树; 次生壁; 木质素; MYB
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)04 － 0052 － 08
Cloning of HbMYB20 from Hevea brasiliensis and Its
Ｒegulation of Secondary Wall Development in Arabidopsis thaliana
Liu Tong1，2 Yang Wenfeng2 Xiao Xianzhou2 Wei Fang2 Gao Honghua2 Luo Shiqiao2 Wu Ming2 Qiu Jian2
(1 ． College of Agriculture，Hainan University Haikou 570228;
2 ． Ｒubber Ｒesearch Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences Danzhou 571737)
Abstract: 【Objective】MYB is one of the major transcription factors ( TF ) involved in regulation of the lignin
biosynthesis and secondary cell wall formation in plants． A MYB TF gene designated HbMYB20，highly homologous to
AtMYB20 of Arabidopsis thaliana was cloned from Hevea brasiliensis，and its roles in A． thaliana were also studied． This
study was aimed to reveal the important function of HbMYB20 for regulating lignin biosynthesis and secondary cell wall
formation in this species，and also to provide theoretical basis for the genetic improvement of the wood formation in H．
brasiliensis．【Method】HbMYB20 was selected by BLAST analysis of the bark transcriptome in terms of a high identity with
第 4 期 刘 彤等: 橡胶树 HbMYB20 基因的克隆及其对拟南芥次生壁发育的调控
A． thaliana AtMYB20 ． The cDNA fragments were obtained from bark cDNA by PCＲ using the specific primers designed
according to the open reading frame ( OＲF) ． Quantitative real-time PCＲ was employed in to determine the relative
expression of HbMYB20 in different tissues such as leaf， latex，stem，xylem，and phloem in H． brasiliensis． The
overexpression vectors with HbMYB20 were constructed and transformed into A． thaliana by agrobacterium dip methods．
The lignin contents were measured by acetyl bromide method and presence of lignin was visualized by staining the cross
sections with phloroglucinol-HCl． The sections of stem were also stained with toluidine blue，and used for statistical
analysis on the cell wall thickness of interfascicular fiber，vessel and xylary fiber between the transgenic and wild-type A．
thaliana． Finally，the expression level of the genes involved in lignin and cellulose synthesis were analyzed by quantitative
real-time PCＲ．【Ｒesult】A MYB TF gene was cloned from H． brasiliensis and designated HbMYB20，which endowed with
OＲF of 927 bp，encoding 309aa protein． The analysis of amino acid sequence indicated that HbMYB20 belonged to G8
subgroup member of Ｒ2Ｒ3MYB transcription factor family，which had a high identity to AtMYB20 /43 and AtMYB85 /42．
Gene expressions suggested that HbMYB20 had a higher expression in stems and xylem but less in latex． When
overexpressing in A． thaliana，HbMYB20 was detected in three transgenic lines but not in wild-type plants． The transgenic
A． thaliana showed obvious growth inhibition，smaller areas and less depth of lignin strain in the vessels and fiber
compared to wild-type plants． The lignin contents of stem and cell wall thickness of interfascicular fiber，vessel and xylary
fiber were significantly lower than those in the control． Furthermore，the genes expression of lignin biosynthetic genes
( 4CL1 and CCoAOMT ) and cellulose biosynthetic gene CesA8 were significantly repressed in transgenic plants．
【Conclusion】 The experimental data confirmed that HbMYB20，a MYB transcription factor G8 subgroup member from
H． brasiliensis，which was highly-expressing in the stem and xylem． Functional analysis showed that the over-expression of
HbMYB20 in A． thaliana has led to dwarfism in the transgenic plants，a significant thinning in vessels and fiber cell wall，
an obvious decrease in lignin contents． And also，the expression inhibition of the genes related to lignin and cellulose
biosynthesis were found． It is reasonable to infer that HbMYB20 plays a negative role in lignin and cellulose biosyntheses，
indicating that it is a negative regulation factor for secondary wall development in H． brasiliensis．
Key words: Hevea brasiliensis; secondary wall development; lignin; MYB
木质素是由单木质醇聚合而成，与纤维素、半纤
维素相互交联组成植物细胞的次生壁。在植物体
内，木质素含量仅次于纤维素，主要沉积在输导组织
(如导管或管胞)、机械组织(如纤维、厚壁组织等)
和保护组织(如表皮)的细胞次生壁中，是被子植物
纤维和导管的基本骨架，在机械支撑、抵抗逆境、保
证水分运输等方面有重要作用( Fratzl et al．，2008;
Cao-delgado et al．，2003; 于明革等，2003)。在农
作物中，细胞壁中木质素含量高有利于植物抗倒伏、
抗病虫害; 在木材工业中，木质素含量高表明木材
具有较强的机械强度( Fratzl et al．，2008; 李伟等，
2003)。因此，对植物木质素及其相关的次生壁形
成机制和分子调控的研究将有助于通过生物技术手
段，选择和培育出更便于人类利用的植物材料。
单木质醇合成途径是植物苯丙酸代谢的一个主
要分支，涉及多种酶的共同作用，例如苯丙氨酸解氨
酶(PAL)、4 － 香豆酸辅酶 A 连接酶(4CL)、咖啡酰
辅酶 A 甲基转移酶(CCoAOMT)、肉桂酰辅酶 A 还
原酶(CCＲ)和肉桂醇脱氢酶 ( CAD) (Marie et al．，
1998; Ｒaes et al．，2003; 魏建华等，2001; 范丙友
等，2007)。近年研究结果表明，许多 Ｒ2Ｒ3-MYB 转
录因子通过调节上述木质素合成相关酶基因的表
达，参与植物次生壁发育的调控(Deluc et al．，2006;
Zhong et al．， 2010 )。例 如，拟 南 芥 ( Arabidopsis
thaliana ) 中 AtMYB26，AtMYB46 /83，MYB103，
MYB85 /42，MYB52 /54 都被证实是次生壁形成和木
质素合成的调控因子 (Yang et al．，2007)。而在其
他林木中，一些木质素合成调控相关的 Ｒ2Ｒ3-MYB
转录 因 子 也 被 鉴 定 出 来，如 巨 桉 ( Eucalyptus
grandis)的 EgMYB2、毛白杨(Populous tomentosa)的
PtMYB4，PvMYB4，PttMYB21a 等(Shen et al．，2012)。
橡胶树(Hevea brasiliensis)是一种能生产天然橡
胶的高大乔木树种，同时橡胶木也是胶林经济的重
要组成。随着橡胶树更新面积不断增加以及天然橡
胶价格的持续低迷，人们逐渐重视橡胶木的开发利
用，并开始关注橡胶树的材性改良。木质素作为植
物次生壁的重要组成成分，与林木的木材形成密切
相关，研究橡胶树的木质素合成调控，对橡胶木材性
改良和定向培育具有重要意义。近期，印度学者首
先开展了橡胶树木质素代谢与木材质量的早期预
测，通过比较不同品系橡胶树芽条的 CAD 活性，筛
选出 6 个种质用于橡胶树优质材性改良育种
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林 业 科 学 51 卷
(Ｒeghu，2011)。马来西亚报道了橡胶树基因组草
图的绘制，将木质素代谢作为仅次于橡胶合成途径
进行阐述，凸显了木质素代谢在橡胶树生物学研究
中的重要性(Ｒahman et al．，2013)。但总体上橡胶
树木质素代谢调控研究还处于起步阶段，基因功能
和转录调控方面还处于空白。
本研究从橡胶树转录组中分离克隆出 1 个木质
素合成相关的 G8 亚组 MYB 转录因子，命名为
HbMYB20，并利用模式植物拟南芥对其进行功能分
析，探讨 HbMYB20 在橡胶树木质素形成过程中的作
用，为揭示橡胶树木材形成过程中木质素合成和次
生壁形成的分子调控机制及其遗传改良奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 植物材料与试剂药品
橡胶树选取种植在中国热带农业科学院试验场
五队的 3 年生无性系热研 7-33-97。拟南芥为生态
型 Columbia (Col-0)，栽培于光照培养箱。大肠杆
菌(Escherichia coli)感受态 DH5α 购自北京全式金
公司; 质粒提取与胶回收试剂盒购自 OMEGA 公
司; ＲNA 提取试剂盒购自百泰克公司; 反转录试剂
盒购自 Thermo 公司; 聚合酶与实时荧光定量 PCＲ
试剂盒 SYBＲ Green I 购自 Takara 公司; 农杆菌
(Agrobacterium) EHA105 为本实验室保存; 其他试
剂为进口或国产分析纯。
1. 2 橡胶树 HbMYB20 克隆与生物信息学分析
参照 ＲNA 提取试剂盒说明书提取橡胶树树皮
ＲNA。采用特异引物 HbMYB20-F: 5-GAGGAAGAT
GGGTAGACAACC-3和 HbMYB20-Ｒ: 5- TTACAGG
ATCCCATATGTCCA-3扩增基因片段，PCＲ 反应程
序为: 95 ℃预变性 3 min; 94 ℃变性30 s，55 ℃退火
30 s，72 ℃延伸 90 s，30 个循环; 72 ℃延伸 8 min，
基因片段连接到 pMD-18T 载体上测序。运用 NCBI
网站上的 OＲF finder 查找基因的开放读码框
(OＲF)，根据 OＲF 推导氨基酸序列，进行 blast、进化
树等生物信息学分析。分子进化树的构建使用
MEGA5 软件完成。
1. 3 橡胶树 HbMYB20 表达分析
提取橡胶树叶片、胶乳、茎干以及木质部与韧皮
部 ＲNA，反转录成 cDNA。使用 CFX96(Bio-Ｒad 公
司)实时荧光定量 PCＲ 检测系统分析 HbMYB20 在
不同部位的基因表达。扩增反应程序为: 95 ℃预
变性 3 min; 95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 10 s，72 ℃延
伸 30 s，39 个循环。相对表达水平以橡胶树 18S 为
内参进行归一化，用 2 － △△CT法表示基因的相对定
量。所用引物 HbMYB20-QTF: 5-GCATTACCGAAG
AAGCCAAG-3和 HbMYB20-QTＲ: 5-TGAAGGCGA
AGAAGTTGTCG-3。
1. 4 HbMYB20 过表达载体构建及其拟南芥的
转化
植物表达载体 PCXSN 采用 XcmⅠ酶切后，回收
大片段，将 HbMYB20 的 PCＲ 扩增片段与 PCXSN 大
片段用 T4 连接酶连接后转化 DH5α，利用引物 35S-
F: 5-ATGACGCACAATCCCACT-3 和 特 异 引 物
HbMYB20-Ｒ 筛选阳性克隆测序，即为过表达载体
HbMYB20-OE。电激转化将上述载体导入农杆菌
EHA105，扩大培养后收集菌体，重悬于 1 /2MS 液体
培养基( OD600为 0. 8 左右)，加入 0. 02% 的 Silwet
L-77后喷施生长旺盛的拟南芥花序，收集种子置于
附加 25 mg·L － 1潮霉素的 1 /2MS 培养基上筛选阳性
抗性 植 株，并 利 用 特 异 引 物 ( HbMYB20-F 和
HbMYB20-Ｒ)PCＲ 验证，阳性结果即为 T1 代转基因
植物。
1. 5 转基因拟南芥中 HbMYB20 表达分析
收集 T1转基因植物种子，在含潮霉素的培养基上
筛选阳性植株，并移栽到花盆，即 T2 转基因植物。将
T2转基因和野生型拟南芥在 22 ℃、光照 16 h /暗 8 h
条件下培养 50 天左右后，比较株高并采集花序茎备
用。提取上述拟南芥茎的总 ＲNA，反转录成 cDNA。以
拟南芥 EF1a 基因为内参，检测 HbMYB20 在拟南芥各
系转基因株系及野生型中的表达量，方法同 1. 3。EF1a
基 因 引 物 为 5-GGTAAGGAGATTGAGAAGGA-3，
5-CGCTCTTAATAACACCAACA-3; HbMYB20 基因引
物 为 5-GCATTACCGAAGAAGCCAAG-3，5-TGAAGG
CGAAGAAGTTGTCG-3。
1. 6 木质素含量测定
拟南芥茎用液氮研磨后冷冻干燥，称量 30 mg
冻干粉末或 5 mg 木质素标准品加入 5 mL 25%乙酰
溴。50 ℃条件下处理 4 h 后取上清，加入 10 mL
2 mol·L － 1 NaOH 和 12 mL 冰醋酸混匀，之后加入
1 mL 0. 5 mol·L － 1盐酸羟胺终止反应，测定 280 nm
下吸光度，根据样品和木质素标准品吸光值计算木
质素含量。
1. 7 木质素分布和细胞壁厚度分析
参照传统的石蜡切片方法切取拟南芥茎基部横
截面，用 5%间苯三酚染色 5 min 后显微观察木质素
分布。用 0. 3% 甲苯胺蓝对横截面切片进行染色
后，显微观察木质部细胞壁厚度，并使用 imageJ 软
件测量导管、木质纤维和维管束间纤维细胞壁厚度，
统计 100 个细胞的平均细胞壁厚度。
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第 4 期 刘 彤等: 橡胶树 HbMYB20 基因的克隆及其对拟南芥次生壁发育的调控
1. 8 木质素和纤维素合成相关酶基因的表达分析
采用实时荧光定量 PCＲ 检测拟南芥中 4CL1，
CCoAOMT，CesA7(纤维素合酶 7)和 CesA8 (纤维素
合酶 8)基因的表达量，方法同 1. 5。4CL1 基因所
用 引 物 为: 5-GGTTACCTCAACAATCCGGCA-3，
5-ACGCGACAACAGCAACATCAG-3; CCoAOMT1 基
因所用引物为: 5-TCGTTGATGCTGACAAAGACA-3，
5-ACTGATCCGACGGCAGATAG-3; CesA7 基因所
用 引 物 为: 5-TTGTTGCAGGCATCTCAGATG-3，
5-GCAGTTGATGCCACACTTGGA-3; CesA8 基因所
用 引 物 为: 5-TGAGCTTTACATTGTCAAATG-3，
5-GCAATCGATCAAAAGACAGTT-3。
2 结果与分析
2. 1 橡胶树 HbMYB20 克隆和生物信息学分析
对橡胶树树皮转录组序列进行 blast 分析，筛选
出与拟南芥 AtMYB20 序列同一性较高的橡胶树
MYB 基因，根据该基因序列设计包含完整基因编码
区的特异引物，以树皮 cDNA 为模板进行扩增，获得
了 1 000 bp 左右的特异片段，测序表明该片段的核
苷酸序列与转录组结果基本一致，含有 927 bp 的开
放阅读框 ( OＲF )，编 码 309aa 的蛋 白，命 名 为
HbMYB20。通 过检 索 NCBI 的 CDD 数 据 发 现，
HbMYB20 基因编码蛋白含有 2 个 SANT 保守结构
域，为典型的 Ｒ2Ｒ3MYB 转录因子。氨基酸序列分
析显示，HbMYB20 与 AtMYB20 /43 和 AtMYB85 /42
类似，其 C 端含有 KKKL［ＲI］KMGIDPVTH［KQ］保
守结构(图 1)，该序列为 MYB 转录因子 G8 亚组特
征，而拟南芥、玉米(Zea mays)和杨树的全基因组分
析表明 G8 亚组中的部分 MYB 参与了植物的木质
素代谢和次生壁发育( Stracke，2001; Zhao et al．，
2014)，这也暗示 HbMYB20 可能与次生壁发育相关。
图 1 HbMYB20 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig． 1 The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of HbMYB20
下划线为 G8 亚组 C 端保守结构。The underlined represents the conserved domains in C terminal ends of G8 subgroup．
为进一步分析 HbMYB20 与 G8 亚组 MYB 转
录因子的进化关系，选取拟南芥、杨树、玉米和水
稻( Oryza sativa)MYB 家族转录因子进行进化树
分 析 ( 图 2 )，结 果 显 示 HbMYB20 与 杨 树
POPTＲ0004s08480、POPTＲ0017s02850 和 拟 南 芥
AtMYB20 /43具有较高的同源性，聚在同一分支上，与
玉米和水稻的同源 MYB 以及拟南芥AtMYB85 /42进
化关系较远。
2. 2 橡胶树中 HbMYB20 基因的表达分析
通过实时荧光定量 PCＲ 检测 HbMYB20 在橡胶
树不同部位的表达情况。由图 3 可知，HbMYB20 在
橡胶树叶片、茎干、韧皮部、木质部以及胶乳中均表
达，其中在木质部表达最高，其次是茎干，胶乳中表
达最低。
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图 2 HbMYB20 与不同植物的 G8 亚组 MYB 转录因子的进化分析
Fig． 2 The evolution analysis of MYB transcription factor G8 subgroup in HbMYB20 and different plants
POPTＲ0004s08480，POPTＲ0017s02850: 杨树 Populus; AtMYB20，AtMYB42，AtMYB43，AtMYB85:拟南芥 Arabidopsis thaliana;
ZmMYB012，ZmMYB113，ZmMYB115: 玉米 Zea mays; Os09g23620，Os12g03150: 水稻 Oryza sativa．
图 3 HbMYB20 在橡胶树不同组织的表达分析
Fig． 3 Expression analysis of HbMYB20
in various tissues of H． brasiliensis
2. 3 转基因拟南芥分子鉴定和株高表型分析
过表达载体 HbMYB20-OE 采用花序浸染法转
化拟南芥，获得 3 个转基因株系。PCＲ 检测结果显
示 3 个转基因株系中都扩增出目的片段，而野生拟
南芥未检测到目的基因，表明 3 个转基因株系均为
阳性转化系 (图 4B)。实时荧光定量 PCＲ 检测显
示，HbMYB20 在 3 个转基因株系中均有表达，株系 3
表达量最高，而野生型拟南芥中未检测到该基因的
表达(图 4C)。对比野生型和转 HbMYB20 拟南芥，
在一致的生长条件下，转基因植物株型较野生型矮
小(图 4A)。
2. 4 转基因拟南芥茎中的木质素含量和分布
拟南芥茎横截面的间苯三酚染色结果显示，
相对野生型拟南芥 (图 5A，E)，转 HbMYB20 基因
拟南芥(图 5B，C，D，F，G，H)木质部和维管束间纤
维的染色面积较少、染色程度变浅，主要集中木质
纤维部位，表明转基因拟南芥茎中木质素的积累
可能受到抑制。为验证上述推测，进一步测定了
转基因和野生型拟南芥茎的木质素含量，结果表
明转基因拟南芥茎的木质素显著低于野生型，其
中株系 3 木质素含量最低，较对照减少了 12. 5%
(图 6A)。
2. 5 转基因拟南芥茎的细胞壁厚度
拟南芥茎横截面的甲苯胺蓝染色结果显示，
相对野生型拟南芥 (图 5I，M)，转 HbMYB20 基因
拟南芥(图 5J，K，L，O，P，Q)在木质纤维、导管和
维管束间纤维的细胞壁均变薄。通过对木质纤
维、导管和维管束间纤维细胞的细胞壁统计分析，
发现转 HbMYB20 基因拟南芥木质纤维、导管和维
管束间纤维的细胞壁厚度均显著低于野生型，所
有株系平均分别减少 19. 4%，22. 5% 和 29. 1%
(图 6B)。
2. 6 拟南芥木质素和纤维素合成的关键酶基因的
表达分析
为确定 HbMYB20 对拟南芥的次生壁发育相关
基因表达的影响，采用荧光定量 PCＲ 分析了次生壁
形成密切相关木质素和纤维素合成的关键酶基因的
表达(图 7)。结果显示，3 个转基因株系中木质素
合成关键酶基因 4CL1 和 CCoAOMT 的表达量显著
低于野生型，表明 HbMYB20 转录因子基因负调控
木质素合成基因的表达。同时纤维素合成关键酶基
因 CesA8 的表达下调，表明 HbMYB20 转录因子基因
对纤维素的合成同样具有抑制作用。
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第 4 期 刘 彤等: 橡胶树 HbMYB20 基因的克隆及其对拟南芥次生壁发育的调控
图 4 转基因拟南芥检测
Fig． 4 Identification of transgenic Arabidopsis thaliana plants
A． WT: 野生型拟南芥 Wild-type Arabidopsis thaliana; HbMYB20-OE-1，HbMYB20-OE-2，HbMYB20-OE-3: 转基因植
株 1，2，3 Transgenic plant line 1，2，3． B，C． M: DNA marker ( DL2000) ; CK: 野生型拟南芥 Wild-type Arabidopsis
thaliana; 1，2，3: 转基因植株 1，2，3 Transgenic plant line 1，2，3．
图 5 过表达 HbMYB20 拟南芥次生壁的变化
Fig． 5 Variation of secondary wall by overexpression of HbMYB20 in Arabidopsis thaliana
标尺 Bar A － D: 156 μm; E － H: 59 μm; I － P: 5 μm．
co: 皮层; ph: 韧皮部; if: 维管束间纤维; xy: 木质部; ve: 导管; xf: 木质纤维 ．
B，F，J，N: HbMYB20-OE-1 茎段; C，G，K，O: HbMYB20-OE-2 茎段; D，H，L，P: HbMYB20-OE-3 茎段; A，E，I，M:
野生型茎段。A － H 茎段间苯三酚染色(红色)表明木质素在维管束间纤维和木质部; I － Q 茎段为甲苯胺蓝染色( I － L:
木质部;M － P:维管束间纤维)。
co: Cortex; ph: Phloem; if: Interfascicular fiber; xy: Xylem; ve: Vessel; xf: Xylary fiber．
B，F，J，N: Stem section of HbMYB20-OE-1; C，G，K，O: Stem section of HbMYB20-OE-2; D，H，L，P: Stem section of
HbMYB20-OE-3; A，E，I，M: Stem section of Wild Type． A － H: Phloroglucinol-HCl staining ( red color) of stem section
showing the lignin deposition in the walls of interfascicular fibers and xylem cells． I － P: Stem sections were stained with toluidine
blue( I － L: Xylem; M － P: Interfascicular fiber) ．
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林 业 科 学 51 卷
图 6 拟南芥木质素含量和细胞壁厚度测定
Fig． 6 Measurement of lignin contents composition and cell wall thinckness in Arabidopsis thaliana
1，2，3: HbMYB20-OE 系 HbMYB20-OE lines; CK: 野生型 Wild type． * 拟南芥野生型和转基因植株差异显著(P ＜ 0. 05)
Significant differences between wild-type and transgenic Arabidopsis thaliana at P ＜ 0. 05．
图 7 拟南芥中木质素和纤维素合成关键酶基因表达量
Fig． 7 The expression of lignin and cellulose biosynthetic
genes in Arabidopsis thaliana
4CL1: 4 － 香豆酸辅酶 A 连接酶 4-Coumarate coenzyme A ligase;
CCoAOMT: 咖 啡 酰 辅 酶 A 甲 基 转 移 酶 Caffeoyl-CoA-3-O-methyl
transferase; CesA7: 纤维素合酶 7 Cellulose synthase 7; CesA8: 纤维素
合酶 8 Cellulose synthase 8．
3 结论与讨论
MYB 转录因子作为植物苯丙烷类物质代谢调
控因子之一，参与木质素生物合成与沉积，在次生细
胞壁形成中具有重要的调控作用 ( Hussey et al．，
2013; Stracke，2001)。近年来研究表明次生壁形成
相关的 MYB 转录因子具有较高的同源性，在不同物
种间的结构和生物学功能较为保守。Du 等(2012)
对 157 个玉米 MYB、125 个拟南芥 MYB 以及部分已
知功能的 MYB 序列和功能开展进化和结构域分析，
获得 37 个亚组，其中 4 个亚组的 MYB 与木质素合
成以及次生壁增厚相关，分别为 G3，G8，G30 和
G21。Zhao 等(2014)采用类似方法对拟南芥、水稻、
玉米、杨树以及柳枝稷 (Panicum virgatum)MYB 转
录因子进行功能分组，发现 5 个物种的 MYB 转录因
子可分成 48 个亚组，其中次生壁形成相关的 MYB
同样聚在上述 4 个亚族中。可见，基因的同源性及
相似性分析在木质素合成以及次生壁增厚相关
MYB 基因功能推测和鉴定中具有重要的参考价值。
本研究从橡胶树中克隆到一个 MYB 转录因子 G8
亚组成员，即 HbMYB20，该基因的表达与 G8 亚组类
似，在茎和木质细胞中高表达，暗示 HbMYB20 与木
质素合成和次生细胞壁形成相关。
次生壁形成调控的 MYB 转录因子大多为激活
因子，但一些 MYB 负调控因子也被鉴定出来，如金
鱼草(Antirrhinum majus) AmMYB308 和 AmMYB300，
拟南芥 AtMYB4 和 AtMYB32，以及桉树 EgMYB1 等，
它们的过表达均能抑制木质素的合成和次生细胞壁
形成 ( Fornalé et al．，2006; Preston et al．，2004;
Tamagnone et al．， 2003 )。在 G8 亚 组 成 员 中，
AtMYB85 的过表达导致木质素的异常沉积，而沉默
OsMYB42 /85 导致植株矮化，该亚组成员普遍被认
为是次生壁形成调控的激活因子;但 AtMYB20 的功
能存在异议，虽然 AtMYB20 可以被次生细胞壁 NAC
掌控开关 SND1 和 NST1 激活，但未有任何遗传学证
据表明其为次生细胞壁合成的激活因子 ( Zhong et
al．，2008)。本研究中 HbMYB20 与 AtMYB20 序列的
同一性最高，在拟南芥中过表达 HbMYB20 导致了转
基因植株的矮小，细胞壁变薄，并且阻碍了木质部中
木质素的合成和积累。分子检测也证实转基因植物
中木质素和纤维素合成相关酶基因的表达显著下
降。该结果与桉树 EgMYB1 异源过表达结果类似，
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第 4 期 刘 彤等: 橡胶树 HbMYB20 基因的克隆及其对拟南芥次生壁发育的调控
桉树 EgMYB1 在木质部中表达最高，却对拟南芥和
和杨树的次生壁发育具有负调控作用 ( Sylvain
et al．，2007)。由此推测 HbMYB20 对拟南芥的木质
素和纤维素合成都具有负调控作用，可能是一个橡
胶树次生壁发育的负调控因子。
次生细胞壁在植物生命活动中扮演重要角色，
同时也对人类的生产生活具有重要意义，例如造纸、
木材利用等。橡胶树是胶木两用经济林木，其胶木
材性和抗风特性都涉及次生壁发育。本研究中克隆
到 1 个橡胶树木质素代谢和次生壁发育相关的
MYB 转录因子基因 HbMYB20，通过模式植物拟南芥
对其功能进行了初步鉴定，将有助于了解橡胶树木
质素合成和次生壁的调控机制，为其相关的木材改
良和抗风育种奠定基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 徐 红)
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