全 文 ：第 6 卷 第 4 期
1 9 9 3 年 8 月
林 业 科 学 研 究
FO R E S T R E SE A R C H
V o l
.
6
,
N o
,
4
A u g
. , 1 9 9 3
锗载体导入人参培养细胞的研究 ’
蒋 晶 王敬文
. 共 野山参在数十年的生长期中富集了大妞的锗 , 药效显著。 人参培养细胞吸收和积象 的
锗t 很少 , 约 8 ~ 17 p p 口 。 制备了对细胞无毒害的载体化合物 y A 、 V B 和 V C , 利用载体把 锗
导入人参培养细胞 , 培养周期28 d , 载体 V 人 、 V B 导入的锗t 分别达到 2 9 78 p p 皿 和48 3 p p ln 。
人参富集锗是成熟细胞的功能 , 在细胞培养的对数期末载体供褚是合理的 。 供锗培养不影响 培养
细胞人参皂贰的生物合成和积累 。
关妞润 人参、 锗、 载体导入
锗元素对人体生理的作用和含锗制剂对人们健康的功能在医药卫生界已引起广 泛 的 重
视 , 富集锗的生物制品也 已进入生活领域。 人参 、 灵芝 、 构祀等名贵中药除各自含有独特的
药化成分外 , 其共同点是都富集锗 。 尤其人参 , 野山参与栽培参不仅价格悬殊 , 野山参的功
效也比栽培参高得多 , 然而二者的人参皂试等成分的含量和组成大致近同 , 可见野 山参还含
有栽培参所缺少的具有高度生理活性的成分 , 国外学者研究认为 , 就在于野山参细胞合成和
积累了大量的有机锗化 合物[ ‘’“1。在自然界 , 植物包括人参吸收和积累锗是相当缓慢而长期的
过程 , 往往需要几年 、几十年甚至更长时间才能积累到显示生理活性的水平。 据张树功等’》研
究 , 一般栽培人参中锗的含量均不超过0 . 1 p p m , 在田间进行的富集锗栽培试验中 , 经 2 年
富锗处理的人参锗含量只达到 3 ~ 4 p p m , 可见单纯通过富锗栽培很难获得浅 井 一 彦 [l] 报
道的含数百 p p m 的富锗人参。
本项研究应用现代生物技术 , 进行人参细胞培养 , 研制相应的化学载体 , 把锗载入人参
培养细胞 , 进行代谢调节和控制 , 使人参细胞大量吸收锗 , 生物合成和积累大量有机锗化合
物 , 使培养的人参细胞具有近似野山参的功效 。
1 材料和方法
1
。
1 试验材料
人参 (P洲a x 9 1: seo g C . A . Me y)种子购自黑龙江省宁安县江山娇实验林场。 干 澡 种子
用1 0 0 0 PPm G A 3 水溶液2 0℃浸种7 2 h , 然后埋藏于湿砂中一8~ 2 0 ℃催芽约 45 d , 种子裂
口后在砂盘中18 ℃继续发芽 , 待苗长到 6 ~ 8 c m 高时取幼茎作为接种材料 , 按蒋晶筹[s. 心] 法
诱导和培养愈伤组织 。 选取松脆的愈伤组织制备悬浮细胞 。
1 9 9 3一0 2一1 5收稿 。
蒋晶助理研究员 , 王敬文(中国林业科学研究院亚热带林业研究所 浙江富旧 3 1 14 0 0 )。
* 国家 自然科学基金资助项 目 。
l) 张树功 , 李焕荣 . 商锗人参及其药理 活性研究 . 全国锗的研究和利用学术会议论文与摘要集 , 19 92 .
4 期 蒋 晶等 : 锗载体导入人参培养细胞的研究
1
.
2 人参细胞悬浮培养
将松脆的人参愈伤组织团块放入灭菌的改良MS 培养液中 , 再加入经超滤灭 菌 的果 胶
酶 (自制 ) , 使酶浓度为 0 . 5 % (W / V ) , 调节 p H 至4 . 5 , 30 ℃保温约4 5 m in , 经振摇后愈伤
组织块分散为单细胞和小细胞团 , 用1 20 目尼龙滤布滤去较大细胞团 , 经离心沉降洗涤 后 重
新悬浮于 M S 培养液中 , 在显微镜下计数每毫升细胞数 , 10 个细胞以下的细胞团按单细胞计
数 , 然后接种到培养瓶中 , 使细胞起始密度不小于 1护 个/ m l种 , 培养液中蔗糖浓度为 2 % ,
2
,
4一 D 浓度为0 . s m g /L , 培养温度为20 一25 ℃ , 每分钟往复振荡 90 次 , 定期观测 细 胞 的
生长量 。
1. 3 供褚培养 基
由南京锗厂购来高纯二氧化锗 (含量> 9 9 。 9 9 % ) , 再由二氧化锗合成锗酸钠 、 醋酸 锗 、
柠檬酸锗 、 酒石酸锗和竣乙基锗倍半氧化物 [ (G e C H ZC H : C 0 0 H ) : 0 3 , G e一1 3 2〕, 分 81 按不
同浓度加入改良 M S 培养液中 , 使其浓度 ( 以 G e 计)分别 为 5 、 1 0 、 5 0 、 1 0 0 , 2 0 0 p p m s
经灭菌后接种人参细胞 , 细胞起始密度为1。“个/ m l, 在最适条件下进行振荡培养 , 定 期 取
样观测 , 质壁分离法 [s1 计数死亡细胞数 。
1
。
4 锗的洲定
参照陆龙根等 2 )方法 。
1
.
5 人参皂试的洲定
参照逢焕诚 [“1法。
之.闷翻理界嗽彻堵2 研究结果
2
.
1 人参培养细胞的生长曲线
在改良的M S 培养液中进行人参细胞悬
浮培养 , 培养液蔗搪浓度为 3 % , 2 , 4一 D 浓
度为 1 m g / L , 在室内自然光和20 ~ 25 ℃下
振荡培养 , 每分钟往复振荡9 0次 , 每两天取
样测定培养液细胞密度 , 其结果如图 1 所示。
8 12 1 6 2 0 2 4
培养天数 (d)
人参悬浮培养细胞生 长曲线
2
.
2 2 , 4一 D 浓度对细脸生长和皂伏含里的影晌
在培养液中添加植物激素 , 实验表明所试验过的几种激素中只有2 , 4 一 D 对人 参培 养细
胞的增殖和人参皂贰的生物合成有密切的关系。 在无2 , 4 一 D 培养液中人参细胞增殖缓慢 , 人
参皂贰含量很低 , 随着培养液中2 , 4一 D 浓度的增高 , 皂贰含量也随之增 高。 当 2 , 4一 D 浓 度
达到2 m g / L 时 , 尽管细胞增长量有所减弱 , 而人参皂贰含量仍有增加 。 实验结果表 明 , 使
人参培养物获得最大生长量和最高皂贰含量的最适 2 , 4一 D 浓度 为 。. 5~ 1 . 0 m g / L (表 1 ) 。
2
。
3 各种锗化合物对人参细胞生长的形晌
培养液中分别加入各种形式的锗化合物 , 其浓 度 (以 G e 计 )为 。 、 5 、 10 、 50 、 1 0叭
2 0 0 p p m
, 在最适条件下进行人参细胞悬浮培养。 不同形式的锗化合物对人参细胞表现出不
同的毒害作用 , 尤其二氧化锗对人参细胞有较大的毒害作 用 , 10 p p m 细 胞 生 长 受 阻 , 50
2 ) 陆龙根 , 钱亚玲 , 吴立仁 . 回流下酸硝化和萃取比色侧定大蒜 中锗 . 全 国第一届锗研讨会资料汇编, 1 9 9Q ,
林 业 科 学 研 究 6 卷
表 1 2 , 4 一 O浓度对人参培养细胞生长和皂试含皿的影晌
2 , 魂一 D 浓度 (m g / L ) 0 0 . 0 5 0 . 1 0 2 0 . 5 1 . 0 2 . 0 3 . 0
细胞生长 及(Ig N 〕
人参皂成含 t (% )
5
.
45
0
.
1 4
5
.
8 3
0
.
6 2
6
.
0 4 6
.
2 2 ‘. 5 4 6 . 8 2 6 . 5 3 6 . 1 7
2
.
2 6 6
.
8 3 1 4
.
7 2 1 7
.
1 3 1 9
.
0 6 1 6
.
7 7
p p m 细胞大批死亡 , 细胞培养物生长量为对照的4 . 7 % 。 锗酸钠 、 醋酸锗 、 柠檬 酸 锗 、 酒
石酸锗在其浓度小于 10 p p m 时对细胞生长略有促进 , 大于 10 p p m 就抑制细胞 生 长 。 狡 乙
基育倍略有促半氧化物
(G e
一 1 3 2) 是一种有机锗化合物 , 在 。~ 2 0 p p m 浓度范围内 , 对细 胞 生 长
进 , 结果如表 2 。
衰 2 各种锗化合钧对人. 培养细自生长的形晌 (单位 : % )
锗化合物浓度
(PP m )
二暇化 锗
锗 徽 钠
困 酸 锗
柠橄故锗
酒石故锗
狡 乙基锗倍半长化物
10 0
1 0 0
1 0 0
1 0 0
1 0 0
1 0 0
9 4
。
6 士 2 . 7
10 6
.
3 士 1 . 6
1 0 8
.
7 士 3 . 2
1 12
.
4 士 3 . 6
1 0 5
.
3 士 2 . 8
1 1 4
.
4 士 4 . 2
8 2
.
3 士 1 . 8
10 2
.
6 士 2 . 1
1 04
.
4 士 2 . 6
1 0 8
.
3 士 2 . 8
10 2
.
4 士 3 . 2
1 17
.
3 士3 . 8
4 4
.
7 士 4 . 2
9 2
.
2 士 1 . 8
9 3
.
4 士 3 . 6
9 4
.
2 士 2 . ‘
9 4
.
6 士 4 . 3
1 08
.
8 士 2 . 6
8 7
.
2 士3 . 3
8 6
.
4 土 2 . 8
8 2
.
5 士 3 . 2
8 8
.
3 土2 . 5
1 02
.
6 士 3 . 2
6 6
.
4 士 2 . 9
6 1
.
7 士 4 . 6
59
.
2 士 4 . 3
62
.
7 士 3 . 7
9 8
.
6 上 4 . 5
2
.
4 人今塘养细胞对褚的吸收和积票
将锗酸钠 、 醋酸锗 、 柠檬酸锗 、 酒石酸锗和狡乙基锗倍半氧化物分别加 入 M S 培 养 液
中 , 使其浓度为 1 0 0 p p m , 在最适条件下进行悬浮培养 , 细胞生长周期(28 d )结束后 , 离心
沉降细胞培养物 , 用0 . 2 N N a CI溶液离心洗涤 3 次 , 然后烘干至恒重 , 按陆龙根法 , ) 测定
细胞培养物的锗含量 。 于悬浮培养的同时 , 还进行了固相培养人参愈伤组织吸收和积累锗的
试验 , 供锗浓度为1 0 p p m , 培养时间为28 d 。 人参培养物吸收和积累锗的数量如表 3 。
衰 3 人 , 培养物对不同形式的褚的吸收和积爪 (单位。 PPm )
培 养 物 狡 乙 非 锗锗 酸 钠 舀 酸 锗 柠 株 被 锗 酒 石 故 锗种 类 倍 半 载 化 物
固 相 培 养
悬 浮 培 养
6
.
2 士 1 . 4
1 0
.
7 士 1 . 8
8
.
8 士 2 . 1
1 3
.
3 士 2 . 3
1 0
.
2 士 1 . 6
1 4
.
3 士 1 . 8
5
.
4 士 1 . 3
8
.
5 士 1 . 7
1 3
.
6 士 2 . 7
1 7
.
8 士 3 . 6
注 : 非供锗培养(对照 )人参培养物 中的锗含址为 O ~ 0 . 01 p p m 。
2
.
5 . 段体导入人今培养细胞
为了增加培养细胞对锗的吸收和积累 , 减少无机锗对细胞的毒害作用 , 增加细胞培养物
的生物量 , 制备了 3 种化合物 V A 、 V B 和 V C 作为锗化合物的载体 , 将锗导入人参培 养细
胞 。 试验证明 , 这 3 种载体化合物对细胞是无毒害作用的 , 进入细胞后可以被细 胞 代 谢 降
解 , 不影响培养细胞的正常生长 (表 4 ) 。 将锗酸钠以 l : 2摩尔数与 V A 、 V B 、 V C 分 别混合
后 , 在酸性条件下进行结合反应 , 然后按不 同的锗浓度配入细胞培养液中。 实验表明 , 锗与
载体结合后 , 细胞对锗的吸收是个主动吸收过程 , 从而富集更多量的锗 。 在这种情况下 , 供
4 期 蒋 晶等 : 锗载体导入人参培养细胞的研究 4 5 9
锗浓度是次要的 , 细胞富集锗的量取决于细胞生理状态和载体的理化性质 (表 5 ) 。
表 4 载体化合物种类和浓度对人参培养细胞生长的影晌 (单位 : % )
载体化合物 浓 度 (m M )
种 类 0 1 0 5 0 1 0 0 2 0 0
V A 1 0 0 1 0 2 士 3 . 7 1 0 0 . 0 士4 . 3 1 0 3 . 3 士2 . 8 9 8 . 7 土 4 . 7
V B 1 0 0 9 9
.
2 士 4 . 2 1 02 士2 . 8 1 0 0 . 6 士 4 . 6 1 0 4 . 2 士4 . 8
V C 10 0 1 0 3 士 2 . 6 9 8 . 4 士3 . 6 1 0 2 . 3 土3 . 5 9 7 . 7 士5 . 2
表 5 各救休化合物在不同供锗浓度下对人今培养细胞积泉锗的作用 (单位 : P m )
载体化合物 浓 度 (p p m )
种 类 5 1 0 5 0 1 0 0 2 0 0
V A 5 2 1
.
7 士8 8 . 7 1 72 0 . 8 士 1 6 2 . 6 2 9 7 8 . 8 士1 5 2 . 6 2 9 1 7 . 7 士 1 2 9 . 2 2 8 8 4 . 6 士 1 3 3 . 4
V B 7 4
.
4 土1 3 . 4 18 2 . 3 士 2 1 . 8 2 8 6 . 3 士2 9 . 2 3 1 7 . 3 士 3 3 . 5 3 2 2 . 4 士4 6 . 2
V C 1 5 1
.
6 士2 6 . 6 33 2 . 7 士 5 3 . 3 4 8 3 . 7 士8 1 . 6 4 7 7 . 4 士 6 7 . 3 4 6 4 . 7 士 7 8 . 7
注 : 非供锗培养(对照 )人参培养物中的倩含置为 。~ 。. 01 p p m 。
2
.
6 培养细胞不同生长期对锗的吸收和积累
尽管人参细胞能够吸收和积累锗 , 但尚未证实锗是人参细胞生长的必需元素。 人参悬浮
细胞培养周期约28 d , 大致可划分 4 个阶段 , 即滞缓期 , 约4~ 6 d ; 增长期 , 约7 山 对数
期 , 约10 一 12 d ; 休止期 , 约4 ~ s d 。 分别在各个阶段开始时添加与载体 V A 结合的 锗酸
钠 1 0 0 p p m , 培养周期结束后测定细胞培养物的含锗量 , 结果表明 , 分别在各个生长阶段供
锗都能够达到最大富集锗量(表 6 )。
表 6 不同时间供锗对人参培养细脸积爪锗的影晌 (单位 : PPm )
开始供 锗时间 第 1 天 第 6 天 第 12 天 第 23 天
锗 含 量 2 8 92 。 4 士1 3 3 . 7 2 9 7 8 . 3 士 14 6 . 7 2 9 0 7 . 6 士 1 8 3 . 3 2 8 8 0 . 4 士 15 6 . 6
2
.
7 供锗培养对人参细胞皂试含量的影响
在培养液中添加不同剂量的锗酸钠 , 在最适条件下进行人参细胞悬浮培养 , 培养周期结
束后分析细胞培养物人参皂贰的含量 , 实验结果(表 7 )表明 , 供锗培养包括载体供锗培养不
影响人参细胞中的皂贰含量。
表 7 供锗培养与人参培养细旅中皂伏含母 (单位 : % )
锗 浓 度 (PPm ) 1 0 5 0 1 0 0
锗 破 钠
V A 十 锗酸钠
1 4
.
6 士 ! . 8
1 5
.
2 土 1 . 2
15
.
6 士 0 . 6
1 4
。
2 士 1 。8
1召. 1 士 1 。 7
1 6
.
1 士 0 . 7
1 5
.
2 士1 , 3
15
,
6 土 0 。 8
1 4
.
3 士 1 . 9
1 4
.
8 士 1 . 7
注 , 培养液 中2 , 4 一 D 浓度为 0 . 5 功 g /I 与
林 业 科 学 研 究 6 卷
3 讨 论
野山人参 、 灵芝 、 拘祀等药效很强 , 保健功能卓著 , 它 们的 共同点是都能 富集大量的
锗 。 锗在地球上是稀散元素 , 由于其化学性质 , 植物富集锗是个长期而缓慢的过程 , 这些名
贵中药材只是在野生环境条件下才能富集多量的锗 。 在人工栽培条件下 , 由于生长期短 , 栽
培土城中由于常年耕作锗很贫乏 , 因而植物富集的锗量低微 , 药效也随之减弱 。 由于植物富
集锗是个长期而缓慢的过程 , 锗又是一种稀散的贵重元素 , 试图在栽培条件下通过施锗肥而
达到富集锗的 目的 , 从经济上考虑是行不通的 。 利用现代生物技术 , 通过培养细胞在短时间
内富集大量的锗 , 通过代谢调节提高药化成分的含量 , 在人工条件下获取具有野生药材功效
的制品 , 将可获得巨大的经济效益 。
野山参含锗量约7 6 7 p p m 〔’〕, 栽培参含锗量约为。. 1 p p m , 施锗肥的栽培参含锗量 约 3
~ 4 p p m
, )
。 供锗培养的人参细胞培养物含锗量约 8~ 18 p p m (表 3 ) , 仍远低于野山参 含锗
量 。 本项研究采用载体将锗导入人参培养细胞 , 在28 d 的培养周期内富集锗量达到 2 9 78 p p m
(表 5 ) , 比浅井一彦报道的野 山参含锗量高约2 . 87 倍 。 人参细胞培养物的人参皂试含量 , 通
过培养液组分的变化进行代谢调节 , 也显著提高(约16 % ) , 比栽培参(约4 % )高约 3 倍 。 实
验研究证明 , 人参细胞培养物富集的锗在细胞中不是以离子状态游离存在的 , 而是与多搪 、
皂贰元等成分结合着的。 有关锗在人参细胞中存在的形式以及其对药效的作用 , 另文报道。
锗对于人参生长发育不是必需的 , 在土壤中或非载体供锗培养的人参细胞培养液中, 主
要靠顺着化学势的扩散作用进入人参细胞 , 由于锗是以无机离子形式进入细胞 , 在锗浓度较高
时对细胞产生毒害作用 。 锗与载体化合物结合后可以稳定结构元素[v1 , 锗上的电荷可以中和 ,
因而能够把锗带入膜脂相达到原来不能达到的浓度 。 锗离子反应活性特别是其氧化势 , 由于
通过载体配合基的变化而受到广泛的调节。 载体化合物 V A 、 V B 和 V C 的稳定性以及 通过
携带向心配位体的变化而引起的稳定性的改变 , 使得锗能够在细胞中得以大量富集 。 锗从培
养液中逆着化学势梯度进入细胞 , 这是一种主动运输 、 吸收的过程 , 使得细胞中积累锗的浓
度高出培养液中的浓度近 30 倍 。 本研究中制备的载体化合物对人参细胞是没有毒害的 , 是可
以被细胞代谢和利用的。
人参细胞生物合成皂试 , 和吸收、 转化 、 积累锗是相对独立的代谢过程(表 7 ) , 可以通
过不同的方式进行调节和控制 。 人参皂贰的合成与植物激素的水平紧密相关 , 尤其2 , 4一 D 对
皂贰的生物合成有直接的调控作用t’l 。 利用现代生物技术 , 进行人参组织和细胞培养, 通过
代谢调节和控制 , 能够获得药效成分含量高的具有野山参功效的产品 , 具有重要的经济价值 。
今 考 文 献
浅井一彦 . 夕力甲 二 巾 人 乏打万人生 . 东京 . 玄同社 , 1 9“ .
森下敬一夕沙甲 二 亡人 乏健康 . 东京 : 神谷株式会社出版 , 19 85 .
蒋晶 , 王敬文 . 人 , 组织和细饱 培养的研究 皿 . 形响 t 伤组帆 中人参皂贰生物合 成的因素 . 林业科学研究 , 1 9 89 ,
2 (2 ): 19 8~ 2 0 1
.
蒋晶 , 王敬文 . 人今组织和细胞培养的研究 工 . 环境因子对人参 t 伤 组织生长的形晌 . 林业科学研究 , 19 8 8 , 1 (6) .
6吕1 ~ 6 8 7 .
蒋 晶等 : 锗载体导入人参培养细胞的研究 透百1涌
辞应龙 . 植物生理学实验手册 . 上海 : 科技出版社 ,
逢焕诚 . 人参 . 北京 : 科学普及 出版社 , 1 9 86 .
Pr iee C A
.
M o l
e e u la r A PP r o a e he s to Pla n t
1 9 7 0
.
19 89
。
Ph y s五o lo g y . M e G ra w 一H Ill B o o k C o m P a n y , N e w Y o rk
S tu d 夕 o n In tr o d u e tio n o f G e r m a n fu m in to Pa n a x s in s e n 夕
C u ltu r e d C e lls v fa C he m ic a l 犷e e to rs
Jia n g jin g W a n g Jin g w e n
A b s tr a et A g r e a t q u a n tity o f g e r ma
n iu m w a s a bo u n ds d in w ild P
a n
ax
g in se n g du
r in g it s g r o w in g Pe r io d fo r d e e a d e s
, a n d it s m e d ie a l effee t s w e r e
v e r y s tr o n g
。
T he e o n t e n t o f g e r m a n iu m a b s o r b ed a nd
a e e u m u la te d in P a n ar
g in se n g e u ltu r e d e e lls wa
s abo u t s ~ 1 7 PPm
。
C h e m ica l v ec to r e o m Po u n d s
V A
,
V B
, a
nd V C
o f fr e e to x ie ity fo r e e lls w e r e p r e p a r e d
, a n d g e r ma
n ium
w a s in tro d u e e d in to P a ”ax g 滋n ￡en g e u ltu r e d c e lls th r o u g h u s i鳍 th e s e v e e to r s 。
D u r in g a g r o w th Pe r io d o f 2 8 da y
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n iu m in tr o du
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v ia V A
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V B
, o r V C a t ta in ed lP t
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, 2 8 6
, a n d 4 8 3 PPm r e o Pe e tiv ely
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A bo u n d o f g e r m a n iu m in P
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-
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Su p e r ad iti
o n o f g e r ma
n ium i
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mu l
a t io n o f P a nax g f
n s e忍9 sa Po n in
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K e y , 犷o r d s P a n ax 9 1作sen g
,
g e r rna n iu m
, v e e to r in tr o d u e tio n
Jia n g jin g
,
A ss ista n t Pr o fe ss o r
,
W
a n g Jin g w e n (T h e R e se a r ch In s titu te o f S u b tr o p ie a l Fo r e s tr y
,
C A F Fu y a n g
,
Z he ji
a n g 5 1 1‘00 ) .