[目的] 大巴山区因其地理和气候原因是我国生物多样性也是核桃资源分布最为重要的地区之一。近年来,由于经济利益驱使,种质资源破坏十分严重。本研究针对该区域核桃实生居群现状开展研究,以期探明其种质多样性特点及居群遗传结构,为科学有效利用和保护提供依据。[方法] 选取该区域12个实生居群386个实生单株为试材,单株为1个样本,分别对每个样本坚果(每样本选30个均匀坚果)12个表型性状变异和坚果播种苗(每个样本选1株播种苗)16个等位基因位点遗传多样性进行分析。[结果] 1)大巴山区核桃实生居群坚果表型性状变异系数介于26.75%~34.36%之间,平均为30.60%,小果型(单果质量小于6 g)资源占有一定比例; 居群遗传性状Shannon指数介于1.112~1.546,平均为1.324; 平均期望杂合度介于0.612~0.718,平均为0.688。说明该区域核桃坚果表型和遗传多样性均比较丰富。2)居群间的坚果表型分化和遗传分化系数分别为0.081 5和 0.063 2,说明居群内变异是该区域核桃坚果表型和遗传变异的主要来源。3)聚类分析结果表明该区域核桃坚果表型性状Manhattan距离和遗传相似系数均表现出与地理距离显著正相关的趋势。[结论] 大巴山区核桃在长期的实生繁殖和多样的立地环境中形成了丰富的坚果表型和遗传变异,是我国重要的核桃资源多样性分布区域。研究结果对该区域的实生选种和资源保护策略的制定具有重要的参考意义。
[Objective] Daba mountains is one of the most abundant areas of biodiversity and walnut (Juglans regia) resources because of its unique geography and climate. In recent years, walnut resources lose dramatically in this area due to human intervention. In view of the serious situation, investigations were carried out on the nut phenotypic diversity and genetic diversity of walnut populations originated from seedlings in Daba mountains to know its nut phenotypic variation, germplasm characteristics and genetic structure. [Method] Variation of 12 nut phenotypic traits (30 representative nuts per sample) and 16 gene loci (1 seedling per sample and 16 SSR primers were used) of 386 samples from 12 seedling populations in Daba mountains were analyzed. [Result] 1) The variation coefficient of nut phenotypic traits of 12 seedling populations in Daba mountains was between 26.75%-34.36%, with an average of 30.60%. And the germplasm resource of small nut (less than 6 g) accounted for a certain proportion. The Shannon index of the populations was between 1.112-1.546, with an average of 1.324, and the expected heterozygosity ranged from 0.612 to 0.718, with an average of 0.688, suggesting abundant variations in nut phenotypic and genetic diversity in this area. 2) The phenotypic and genetic differentiation among populations in this area was small, with differentiation coefficients of 8.15% and 6.32% respectively. 3) Cluster analysis showed that the Manhattan distance of nut phenotypic traits and the genetic similarity coefficient were positively related to the geographic distance. [Conclusion] There were large nut phenotypic diversity and genetic diversity in walnut trees in Daba mountains because of long-term regenerations from seedlings and adaptation to diverse site conditions. The Daba mountains is an important area of genetic diversity of walnuts in China. This study would provide an important basis for the walnut breeding and conservation in the region.
全 文 :第 52 卷 第 5 期
2 0 1 6 年 5 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 52,No. 5
May,2 0 1 6
doi:10.11707 / j.1001-7488.20160513
收稿日期: 2015 - 12 - 31; 修回日期: 2016 - 02 - 03。
基金项目: “十二五”科技支撑项目 (2013BAD14B00) ; 湖北省林业科学研究院青年基金(2016YQNJJ01)。
* 韩华柏为通讯作者。感谢四川省林木种苗站、四川省林业科学研究院、四川省广元市林木种苗站、重庆市林业科学研究院及各样品采集
地林业部门对本研究的鼎力相助。
大巴山区核桃实生居群的坚果表型和遗传多样性*
徐永杰1,2 韩华柏3 王 滑4 陈凌娜5 马庆国1 裴 东1
(1. 林木遗传育种国家重点实验室 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091;
2. 湖北省林业科学研究院 武汉 430075; 3. 四川省林木种苗站 成都 610081;
4. 华中农业大学园艺林学学院 武汉 430070; 5. 中国林业科学研究院资源昆虫研究所 昆明 650224)
摘 要: 【目的】大巴山区因其地理和气候原因是我国生物多样性也是核桃资源分布最为重要的地区之一。近
年来,由于经济利益驱使,种质资源破坏十分严重。本研究针对该区域核桃实生居群现状开展研究,以期探明其种
质多样性特点及居群遗传结构,为科学有效利用和保护提供依据。【方法】选取该区域 12 个实生居群 386 个实生
单株为试材,单株为 1 个样本,分别对每个样本坚果(每样本选 30 个均匀坚果)12 个表型性状变异和坚果播种苗
(每个样本选 1 株播种苗)16 个等位基因位点遗传多样性进行分析。【结果】1)大巴山区核桃实生居群坚果表型
性状变异系数介于 26. 75% ~ 34. 36%之间,平均为 30. 60%,小果型(单果质量小于 6 g)资源占有一定比例; 居群
遗传性状 Shannon 指数介于 1. 112 ~ 1. 546,平均为 1. 324; 平均期望杂合度介于 0. 612 ~ 0. 718,平均为 0. 688。说
明该区域核桃坚果表型和遗传多样性均比较丰富。2)居群间的坚果表型分化和遗传分化系数分别为 0. 081 5 和
0. 063 2,说明居群内变异是该区域核桃坚果表型和遗传变异的主要来源。3)聚类分析结果表明该区域核桃坚果表
型性状 Manhattan 距离和遗传相似系数均表现出与地理距离显著正相关的趋势。【结论】大巴山区核桃在长期的
实生繁殖和多样的立地环境中形成了丰富的坚果表型和遗传变异,是我国重要的核桃资源多样性分布区域。研究
结果对该区域的实生选种和资源保护策略的制定具有重要的参考意义。
关键词: 核桃; 居群; 表型性状; 遗传性状; 多样性
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 - 7488(2016)05 - 0111 - 09
Phenotypic and Genetic Diversities of Nuts of Walnut(Juglans regia)
Populations Originated from Seedlings in Daba Mountains
Xu Yongjie1,2 Han Huabai3 Wang Hua4 Chen Lingna5 Ma Qingguo1 Pei Dong1
(1 . State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Research Institute of Forestry,Chinese Academy of Forestry Beijing 100091;
2 . Hubei Academy of Forestry Wuhan 430075; 3 . Sichuan Forest Tree Seeds and Seedlings Service Chengdu 610081;
4 . College of Horticulture and Forestry Sciences,Huazhong Agricultural University Wuhan 430070;
5 . Research Institute of Resource Insects,Chinese Academy of Forestry Kunming 650224)
Abstract: 【Objective】Daba mountains is one of the most abundant areas of biodiversity and walnut ( Juglans regia)
resources because of its unique geography and climate. In recent years,walnut resources lose dramatically in this area due
to human intervention. In view of the serious situation,investigations were carried out on the nut phenotypic diversity and
genetic diversity of walnut populations originated from seedlings in Daba mountains to know its nut phenotypic variation,
germplasm characteristics and genetic structure. 【Method】Variation of 12 nut phenotypic traits (30 representative nuts
per sample) and 16 gene loci (1 seedling per sample and 16 SSR primers were used) of 386 samples from 12 seedling
populations in Daba mountains were analyzed. 【Result】1) The variation coefficient of nut phenotypic traits of 12 seedling
populations in Daba mountains was between 26. 75% – 34. 36%,with an average of 30. 60% . And the germplasm
resource of small nut ( less than 6 g) accounted for a certain proportion. The Shannon index of the populations was
between 1. 112 – 1. 546,with an average of 1. 324,and the expected heterozygosity ranged from 0. 612 to 0. 718,with an
average of 0. 688,suggesting abundant variations in nut phenotypic and genetic diversity in this area. 2) The phenotypic
and genetic differentiation among populations in this area was small,with differentiation coefficients of 8. 15% and 6. 32%
林 业 科 学 52 卷
respectively. 3) Cluster analysis showed that the Manhattan distance of nut phenotypic traits and the genetic similarity
coefficient were positively related to the geographic distance. 【Conclusion】There were large nut phenotypic diversity and
genetic diversity in walnut trees in Daba mountains because of long-term regenerations from seedlings and adaptation to
diverse site conditions. The Daba mountains is an important area of genetic diversity of walnuts in China. This study would
provide an important basis for the walnut breeding and conservation in the region.
Key words: Juglans regia; populations; phenotype traits; genetic traits; diversity
大巴山区地处中国东部一级平原低地与西部二
级高原山地交汇处,是南北气候的分水岭和自然环
境的十字交叉带,世界自然基金会、《中国生物多样
性保护行动计划》、《中国生物多样性研究报告》等
均将此区列为中国生物多样性保护的关键地区和优
先重点保护区域。该区域也是我国核桃 ( Juglans
regia)重要产区。核桃栽培历史悠久,据 20 世纪 70
年代四川省青川县发掘的战国时期墓群 (公元前
307 年)中出土的 14 枚核桃推测,核桃在该区域生
长至少有 2 300 多年的历史(青川县志编纂委员会,
1992)。丰富的生境条件(Peng et al.,2005)和悠久
的栽培历史( Jarvis et al.,2008)以及长期的天然杂
交、实生繁殖更新可能会形成丰富的遗传资源。近
年来,随着核桃产业的不断发展,该区域大力推行良
种化栽培,一些原有的实生农家类型和自然群体被
改接为栽培品种,致使本地种质资源流失和破坏严
重。因此,全面系统地研究该区域核桃实生居群特
点,科学制定该区域核桃资源保护利用策略,对当前
该区域资源开发利用显得尤为迫切和必要。
目前,种质资源的评价研究主要通过形态学标
记、细胞学标记、分子标记和生化标记手段完成
(Pop et al.,2013)。形态标记虽然直观有效,但常
因环 境 影 响 而 使 研 究 结 果 重 复 性 差 ( Kumar,
1999)。分子标记虽不够直观,但不受环境和植物
组织的影响,可以弥补形态标记的不足,是研究核桃
实生居群特点的重要方法(Wang et al.,2015a)。鉴
于分子标记和形态标记各自的优缺点,2 种方法联
用则被认为是行之有效的种质鉴定和分类方法
(Fatahi et al.,2010; Pop et al.,2013; Wang et al.,
2015b)。而分子标记技术中的 SSR 分子标记技术
由于具有稳定性、共显性和信息量大等优点,其效率
远远超越 RFLP 和 RAPD 标记,被广泛运用于核桃
种质鉴定和居群遗传特点的研究中 ( Chen et al.,
2014; 王滑等,2007)。
由于实生居群在遗传变异和自然选择的双重作
用下会产生多样的遗传信息,以实生居群作为试验
材料,在居群水平进行多样性比较,可了解和掌握某
一区域核桃资源的遗传背景和亲缘关系 (王滑等,
2007; Wang et al.,2015b)。到目前为止,对我国西
部的新疆核桃实生居群(李超等,2011)、陕西核桃
实生居群(李国田等,2011)和西南核桃实生居群
(Wang et al.,2015b)的遗传特点均已有相关研究,
而对南北结合部的大巴山区核桃实生居群坚果和遗
传特点报道较少。因此,本文以该区域 12 个实生居
群 386 株单株的坚果和叶片为试材,利用 12 个坚果
表型性状和 16 对 SSR 引物进行居群多样性、遗传
结构和居群间聚类分析,以期获得该区域核桃实生
居群的坚果表型和遗传多样性特点,为制定该区域
核桃资源保护与利用策略提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试材采集地的概况
根据国家质量监督检验检疫总局第 78 号《地
理标志产品保护规定》和中国经济林协会《中国经
济林之乡命名工作暂行办法》授予“地理标志产品”
和“核桃之乡”注重原产地的原则,本研究试材确定
在大巴山区“中国核桃之乡”和“地理标志产品”所
在县(市)及其周边县(市)中选取 12 个核桃实生居
群采集[商洛居群( SL)位于秦岭与大巴山交界区,
本研究暂将该居群归入大巴山区],单株为 1 个样
本。12 个核桃实生居群名称和采集样本容量见
表 1。
1. 2 试材采集与处理
20 世纪 80 年代以前,我国核桃繁殖多以实生
繁殖为主,到 90 年代嫁接技术才获得明显突破并应
用于生产(冯连芬等,2006),因此树龄 30 年以上的
大树基本上都是实生繁殖而来。本研究根据试验样
品采集地林业部门相关资料,在核桃资源相对集中
的区域,采取走访当地群众获取树龄、果实特异性等
相关信息的方式,选择有特异性状树龄 30 年以上的
原生实生核桃树为试材。每个样本采集 40 个大小
基本一致、饱满的坚果,其中 30 个坚果用于表型性
状测定,另外 10 个果实于当年 10 月经沙藏翌年 3
月播种,每样本播种 5 株,于 5 月上旬采集其中 1 株
嫩叶作为提取 DNA 的试材。
211
第 5 期 徐永杰等: 大巴山区核桃实生居群的坚果表型和遗传多样性
表 1 本研究采样点生态和地理信息及样本容量
Tab. 1 The ecological and geographical information and sample size of populations in this study
居群
Poulation
居群代码
Population
code
经度
Langitude
(E)
纬度
Latitude
(N)
年降雨量
Annual
rainfall /mm
海拔 Elevation /m
范围
Range
均值
Mean
样本容量
Sample
size
四川省青川县
Qingchuan county,Sichuan
QC 105°1348″ 32°3448″ 1 021. 7 590 ~ 1 550 908. 7 27
四川省朝天区
Chaotian county,Sichuan
CT 105°5248″ 32°390″ 980. 0 730 ~ 1 347 1 097. 5 60
四川省剑阁县
Jiange county,Sichuan
JG 105°3112″ 32°1648″ 1 039. 4 659 ~ 825 723. 0 10
四川省旺苍县
Wangcang county,Sichuan
WC 106°1648″ 32°1348″ 1 209. 0 500 ~ 1 400 832. 0 10
四川省巴中市 (包括通江县和南江
县 ) Bazhong city ( including Tongjiang
county and Nanjiang county),Sichuan
BZ 106°4612″ 31°510″ 1 150. 0 786 ~ 1 207 1 025. 9 19
重庆市城口县
Chengkou county,Chongqing
CK 108°4012″ 31°570″ 1 261. 4 850 ~ 1 685 1 432. 5 62
重庆市巫溪县
Wuxi county,Chongqing
WX 109°3748″ 31°240″ 1 349. 0 1 233 ~ 1 812 1 527. 9 28
湖北省建始县 Jianshi county,Hubei JS 109°4348″ 30°360″ 1 480. 0 517 ~ 1 456 852. 0 10
湖北省巴东县 Badong county,Hubei BD 110°1948″ 31°30″ 1 093. 2 250 ~ 1 565 1 088. 2 47
湖北省兴山县 Xingshan county,Hubei XS 110°450″ 31°210″ 956. 0 180 ~ 1 480 1 068. 1 24
湖北省保康县 Baokang county,Hubei BK 111°150″ 31°5248″ 934. 6 298 ~ 1 483 873. 2 66
陕西省商洛市(包括洛南县、商南县、
柞水县、丹凤县和山阳县)
Shangluo city( including Luonan county,
Shangnan county, Zhashui county,
Danfeng county and Shanyang
county),Shaanxi
SL 109°5548″ 33°5212″ 800. 5 460 ~ 1 210 840. 3 23
合计 Total 386
1. 3 试验方法
1. 3. 1 坚果表型性状测定 6 个坚果表型质量性状
参照“核桃属特异性、一致性和稳定性(DUS)测试指
南”(UPOV,1999)进行特征描述和赋值,测试指南中
未列出的特征用“其他”表示(表 2)。坚果数量性状
纵径、横径、侧径、单果质量、果壳厚及出仁率用游标
卡尺、千分尺和天平(精度 0. 01 g)测得,计算坚果圆
度。坚果圆度 = (侧径 +横径) /(2 ×纵径)。
表 2 核桃坚果表型特征描述及赋值
Tab. 2 The description and assignment of nut phenotype traits for walnut accessions
坚果表型特征
Nut phenotype traits
描述及赋值
Description and assignment
9. 沿缝合线纵切面形状
Shape in longitudinal section
through suture
1:圆; 2: (阔)椭圆; 3: (阔)卵圆; 4:三角形; 5: (阔)梯形; 6:其他
1:Circular; 2: Broad elliptic / elliptic; 3: Broad ovate / ovate; 4: Triangular; 5: Broad trapezium /
trapezium; 6: Others
10.垂直缝合线纵切面形状
Shape in longitudinal section
perpendicular to suture
1:圆; 2:三角形; 3:(阔)卵圆; 4:(阔)梯形; 5: (阔)椭圆; 6:心形; 7: 其他
1: Circular; 2: Triangular; 3: Broad ovate / ovate; 4: Broad trapezium / trapezium; 5: Broad elliptic /
elliptic; 6:Cordate; 7: Others
11. 坚果横切面形状
Shape in cross section
1:扁圆; 2:圆; 3:椭圆; 4:其他 1: Oblate; 2: Circular; 3: Elliptic; 4:Others
13.果底形状
Shape of base perpendicular to suture
1:楔形; 2:圆; 3:平; 4:顶端微凹 1:Cuneate; 2:Circular; 3:Truncate; 4:Emarginate
14.果肩形状
Shape of apex perpendicular to suture
1:溜; 2:圆; 3:平; 4:耸 1:Pointed; 2:Circular; 3:Truncate; 4: Emarginate
15. 果尖
Prominence of apical tip
1:强; 2:中; 3:弱 1:Strong; 2:Medium; 3:Weak
1. 3. 2 SSR等位变异检测 1)DNA 提取 参照王滑 等(2007)的方法。2)PCR 扩增与毛细管电泳 利用
311
林 业 科 学 52 卷
NCBI 数据库全部已知核桃 Mbol 基因组 BAC文库克隆
中下载的 22 740 条末端序列设计合成 50 对引物(陈凌
娜等,2014),从中筛选出多态性较高的 16对 SSR引物
进行 DNA 分 析,引 物 WJR007,WJR031,WJR061,
WJR069,WJR073,WJR100,WJR115,WJR202,WJR265,
WJR281特征信息参见 Chen 等(2014),WJR291特征信
息参见陈凌娜等(2014),其他 6对引物特征信息见表 3。
PCR反应扩增和毛细管电泳参照 Chen等(2014)方法。
表 3 6 对 SSR 引物特征
Tab. 3 Profile of 6 SSR primers used in this study
引物
Primer
重复单元
Repeat motifs
退火温度
Annealing temperature /℃
片段大小
Fragment size / bp
引物序列
Primer sequence(5—3 )
WJR014 (TA) n 57 236
F:ACATGATGAGTAGGGCAGGG
R:GCTTATTGATCAAGATTGGACG
WJR041 (ATAC) 8 60 160
F:ATCTGCCTTCCCATAAGGCT
R:TTCTCCCATTGTCGGATCTC
WJR065 (GATGA) 5 56 210
F:CAGCCATTCGAGTTAAGACTTG
R: TTCGATTAAGAGCTCGTTTGG
WJR226 (TAGA) 6 59 162
F:TCGAAGATCGATCAACGCTA
R:GATAAGATGGATGGGTGCGT
WJR291 (CT) 15 60 116
F:TTGGCACCAACACGTTAGAA
R:TTGCAGAGATCTCATCATTTGTC
WJR297 (AG) 18 59 248
F:TTTCGGAAAAGCTGAGGAGA
R:ATGTGCCTGTGGATGTGAAA
1. 4 数据统计
运用 EXCEL 和 SAS 8. 1 软件统计坚果表型性
状的平均值和标准差,用类平均法计算居群间的
Manhattan 距离并进行聚类分析。用性状的变异系
数 CV 表示居群表型多样性水平(徐斌等,2015),
并对其做 Duncan 检验; 对各性状观测值采用巢式
设计方差分析比较居群间和居群内的差异显著性
(李斌等,2002); 用表型分化系数反映居群间表型
分化程度(葛颂等,1988)。
用 GenAlEx6 软 件 计 算 等 位 基 因 数,用
POPGENE version 1. 32 软件分析居群遗传多样性、
遗传结构及各居群的遗传相似系数; 用 NTSYS2. 1
软件对遗传相似系数进行聚类分析。
2 结果与分析
2. 1 坚果表型和遗传多样性
2. 1. 1 坚果表型多样性 大巴山区核桃坚果 4 个
数量性状多样性分析结果(表 4)表明: 该区域坚果
圆度为 0. 58 ~ 1. 11,平均 0. 89; 单果质量为 4. 11 ~
22. 87 g,平 均 11. 67 g; 出 仁 率 为 27. 42% ~
70. 95%,平均 47. 50% ; 壳厚为 0. 55 ~ 2. 38 mm,平
均 1. 19 mm。由表 5 可知: 10 个表型性状变异程度
存在显著差异(P < 0. 05),其中变异程度最大的是
沿缝合线纵切面形状,变异程度为 55. 57% ; 其次是
垂直于缝合线纵切面形状,变异程度为 51. 94% ; 变
异程度最小的为坚果圆度,为 8. 98%。12 个居群内
10 个坚果表型性状变异系数平均值介于 26. 75% ~
34. 36%之间,平均为 30. 60%,其中变异程度最大
的是 QC 居群,为 34. 36%,显著高于 JG 和 XS 居群
(分别为 26. 68%和 26. 75% )(P < 0. 05)。
2. 1. 2 遗传多样性 部分样品毛细管电泳图见图
1。12 个核桃实生居群的遗传多样性分析见表 6。
大巴山区核桃实生居群观察等位基因数(N a )介于
4. 94 ~ 8. 13,平均为 6. 27; 有效等位基因数(N e )介
于 2. 93 ~ 3. 96,平均为 3. 28。 Shannon 指数介于
1. 112 ~ 1. 546,平均为 1. 324; 观察杂合度介于
0. 391 ~ 0. 453,平均为 0. 437; 期望杂合度介于
0. 612 ~ 0. 718,平均为 0. 688。各居群丰富度和均
匀度差异不大。其中 BD 居群观测等位基因数、
Shannon 指数、观察杂合度、期望杂合度均高于其他
居群,说明其遗传多样性相对较高。
表 4 大巴山区 386 份样本坚果数量性状的
最大值、最小值、平均值和标准差①
Tab. 4 Maximum,minimum and mean values,standard
deviations (SD) of phenotypic traits for 386 genotype
nuts in Daba mountains
表型性状代码
Code of phenotypic traits
最大值
Max.
最小值
Min.
平均值
Mean
标准差
SD
IR 1. 11 0. 58 0. 89 0. 08
MN / g 22. 87 4. 11 11. 67 3. 03
KR(% ) 70. 95 27. 42 47. 50 6. 66
ST /mm 2. 38 0. 55 1. 19 0. 25
①IR:坚果圆度;MN:单果质量;KR:出仁率;ST:壳厚。下同。
IR: Index of roundness of nut; MN: Mass of single nut; KR: Kernel
rate; ST: Shell thickness. The same below.
411
第 5 期 徐永杰等: 大巴山区核桃实生居群的坚果表型和遗传多样性
表 5 大巴山区 12 个实生居群坚果表型性状变异系数与多重比较①
Tab. 5 Variation coefficients (CV) and multiple comparisons of phenotypic traits in 12 populations in Daba mountains %
表型性状代码
Code of
phenotypic traits
居群 Population
QC CT JG WC BZ CK WX JS BD XS BK SL
均值 Mean
9 56. 05 67. 80 44. 99 47. 19 63. 01 50. 60 59. 15 46. 36 48. 44 48. 50 64. 28 70. 42 55. 57 a
10 58. 48 66. 41 40. 39 64. 61 58. 10 45. 85 53. 61 51. 68 37. 52 52. 19 45. 27 49. 16 51. 94 ab
11 58. 00 33. 15 27. 64 33. 36 23. 42 48. 94 31. 89 35. 14 50. 34 28. 82 35. 57 25. 23 35. 96 c
13 26. 35 29. 66 26. 64 25. 33 43. 20 33. 02 47. 10 10. 90 30. 99 19. 99 29. 36 33. 98 29. 71 d
14 52. 65 49. 12 49. 95 63. 96 46. 06 39. 52 44. 92 63. 01 40. 70 37. 59 49. 91 44. 48 48. 49 b
15 24. 23 16. 32 20. 55 13. 74 29. 13 22. 99 19. 55 29. 13 28. 84 26. 55 21. 92 19. 54 22. 71 e
IR 10. 05 6. 81 8. 74 7. 91 10. 06 10. 57 9. 50 8. 23 10. 89 7. 89 7. 05 10. 11 8. 98 g
MN 26. 45 21. 34 18. 20 17. 75 14. 10 22. 94 25. 22 26. 09 28. 60 17. 36 23. 56 17. 48 21. 59e
KR 13. 87 12. 34 11. 55 12. 61 12. 10 12. 14 14. 97 9. 42 16. 55 12. 78 17. 12 10. 86 13. 03 fg
ST 17. 48 20. 67 18. 15 15. 15 17. 85 18. 70 21. 16 9. 28 25. 12 15. 79 17. 13 20. 18 18. 05 ef
均值 Mean 34. 36 a 32. 36 ab 26. 68 b 30. 16 ab 31. 71 ab 30. 53 ab 32. 71 ab 28. 92 ab 31. 80 ab 26. 75 b 31. 12 ab 30. 14 ab 30. 60
① 表型性状代码见表 2。“均值”行不同字母表示居群间在 0. 05 水平上差异显著,“均值”列不同字母表示性状间在 0. 05 水平上差异显
著。Codes of phenotypic traits see Tab. 2. Paired populations with the different letters are significantly different (P < 0. 05) shown in‘Mean’line,and
Paired traits with the different letters are significantly different (P < 0. 05) shown in‘Mean’column.
图 1 WJR291 引物样品 BD027(上)和 QC07(下)毛细管电泳
Fig. 1 Capillary electrophoresis spectrum diagram at WJR291 primer of BD027 ( above) and QC07( below)
表 6 大巴山区 12 个核桃实生居群的遗传多样性①
Tab. 6 Genetic diversity of the 12 seedling walnut populations in Daba mountains
居群 Population N a N e I H o H e
QC 6. 13 3. 14 1. 290 0. 413 0. 638
CT 7. 25 3. 07 1. 326 0. 434 0. 639
JG 4. 31 2. 80 1. 112 0. 445 0. 612
WC 4. 75 2. 91 1. 175 0. 400 0. 626
BZ 5. 94 3. 44 1. 318 0. 391 0. 649
CK 8. 06 3. 53 1. 452 0. 447 0. 676
WX 6. 38 3. 13 1. 325 0. 482 0. 653
JS 4. 94 3. 35 1. 295 0. 439 0. 693
BD 7. 81 3. 96 1. 546 0. 460 0. 718
XS 5. 81 3. 46 1. 342 0. 430 0. 667
BK 8. 13 3. 67 1. 472 0. 452 0. 685
SL 5. 69 2. 93 1. 230 0. 453 0. 626
平均 Mean 6. 27 3. 28 1. 324 0. 437 0. 657
①N a : 观察等位基因数; N e : 有效等位基因数; I: Shannon 信息指数; H o : 观察杂合度; H e : 有效杂合度。N a : Observed number of alleles;
N e : Effective number of alleles; I: Shannon’s information index; H o : Observed heterozygosity; H e : Expected heterozygosity.
511
林 业 科 学 52 卷
2. 2 居群坚果表型和遗传分化
2. 2. 1 坚果表型分化 对 12 个核桃实生居群的
10 个表型性状进行巢式方差分析,计算出各分量占
变异的比例(表 7)。其中居群内方差分量占总变异
的 91. 85%,居群间方差分量占 8. 15%。居群间 10
个表 型 性 状 的 表 型 分 化 系 数 范 围 1. 38% ~
24. 20%,平均为 8. 15%。10 个表型性状分化最大
的是单果质量,最小的是出仁率。10 个性状的居群
间变异均大于居群内,说明居群内变异是该区域坚
果表型变异的主要来源。
表 7 大巴山区核桃坚果表型方差分量和表型分化系数
Tab. 7 Variance components and phenotypic differentiation coefficients of nut phenotypic traits of
walnut populations in Daba mountains
表型性状代码
Code of phenotypic traits
方差分量
Variance component
方差分量百分比
Percentage of variance component (% )
居群间 Among
populations
居群内 Within
population
居群间 Among
populations
居群内 Within
population
表型分化系数
Phenotypic
differentiation
coefficient
9 8. 67 × 10 - 2 1. 63 5. 06 94. 94 5. 06
10 1. 65 × 10 - 1 5. 45 2. 94 97. 06 2. 94
11 5. 26 × 10 - 2 3. 65 × 10 - 1 12. 62 87. 38 12. 62
13 2. 73 × 10 - 2 5. 93 × 10 - 1 4. 40 95. 60 4. 40
14 1. 34 × 10 - 2 9. 63 × 10 - 1 1. 38 98. 62 1. 38
15 1. 41 × 10 - 2 3. 34 × 10 - 1 4. 05 95. 95 4. 05
IR 7. 85 × 10 - 4 6. 52 × 10 - 3 10. 74 89. 27 10. 74
MN 2. 27 7. 10 24. 20 75. 80 24. 20
KR 8. 20 × 10 - 5 4. 36 × 10 - 3 1. 85 98. 15 1. 85
ST 8. 90 × 10 - 3 5. 36 × 10 - 2 14. 24 85. 76 14. 24
均值 Mean 2. 64 × 10 - 1 1. 65 8. 15 91. 85 8. 15
2. 2. 2 遗传分化 从表 8 可以看出,居群间近交系
数(F IS )介于 - 0. 024 ~ 0. 898,平均为 0. 319,其中
WAG-281 位点表现出杂合子过剩现象。居群间遗
传分化系数 ( F ST )介于 0. 033 4 ~ 0. 149 1,平均为
0. 063 2,说明有 6. 32%的遗传变异来源于居群间。
各位点均存在基因流,平均为 3. 708,其中 WAG-065
位点基因流最大,为 7. 224,WAG-297 位点基因流最
小,为 1. 426。
表 8 大巴山区 12 个实生居群间遗传分化与基因流估计①
Tab. 8 Relative measurements of genetic differentiation and the estimates of gene flow among 12 populations in Daba mountains
位点 Locus F IS F IT F ST Nm
WAG-007 0. 225 0. 260 0. 045 5. 337
WAG-014 0. 898 0. 905 0. 063 3. 744
WAG-031 0. 456 0. 505 0. 090 2. 517
WAG-041 0. 044 0. 097 0. 056 4. 215
WAG-061 0. 527 0. 556 0. 062 3. 795
WAG-065 0. 047 0. 079 0. 033 7. 224
WAG-069 0. 257 0. 306 0. 067 3. 506
WAG-073 0. 287 0. 313 0. 037 6. 605
WAG-100 0. 372 0. 421 0. 077 3. 003
WAG-115 0. 216 0. 240 0. 032 7. 694
WAG-202 0. 694 0. 709 0. 050 4. 758
WAG-226 0. 186 0. 231 0. 056 4. 248
WAG-265 0. 096 0. 134 0. 042 5. 672
WAG-281 -0. 024 0. 029 0. 052 4. 596
WAG-291 0. 156 0. 224 0. 080 2. 880
WAG-297 0. 469 0. 548 0. 149 1. 426
均值 Mean 0. 319 0. 362 0. 063 3. 708
①F IS : 居群内繁殖系数; F IT : 总居群内繁殖系数; F ST : 居群分化系数; Nm : 基因流,Nm = 0. 25 ( 1 - F ST ) / F ST . F IS : Inbreeding
coefficient at the population level; F IT : Inbreeding coefficient at the total sample level; F ST : Proportion of differentiation among populations; Nm : Gene
flow,Nm = 0. 25 (1 - F ST ) / F ST .
611
第 5 期 徐永杰等: 大巴山区核桃实生居群的坚果表型和遗传多样性
2. 3 居群间聚类分析
利用核桃实生居群表型性状的 Manhattan 距
离进行 UPGMA 聚类分析 (图 2A)。从图中看出,
当居群间 Manhattan 距离为 0. 75 时,12 个居群分
为 3 类,QC,WC,JG 聚为一类,WX 单独聚为一类,
其他 8 个居群聚为一类。利用核桃实生居群间的
遗传相似系数进行 UPGMA 聚类分析 (图 2B),当
遗传相似系数为 0. 910 时,12 个居群分为 4 类,
QC,CT,SL,BD,JG,WC 6 个居群聚为一类,BZ,
XS,CK,BK 4 个居群聚为一类,WX 居群和 JS 居群
分别单独为一类。2 种聚类分析结果不完全一致,
但均呈现出了与地理距离显著正相关的趋势
( r(A) = 0. 523 21,r ( B ) = 0. 480 81,r ( AB ) =
0. 638 4,P < 0. 05)。
图 2 12 个实生居群基于表型性状平均 Manhattan 距离(A)和 Nei’s 相似系数(B)的 UPGMA 聚类分析
Fig. 2 Cluster analyses of 12 walnut populations based on average Manhattan distance of nut phenotypic traits(A)
and Nei’s similarity coefficients(B) using the UPGMA method
3 讨论
3. 1 资源多样性
前人对核桃坚果表型性状进行赋值后计算变异
系数并进行比较的论述较少,而对坚果数量性状的
研究较多,数量性状中变异幅度最大的多认为是单
果质量(王金星等,2012; 王滑,2010)。据报道,我
国广泛种植的国家首批审定的 16 个核桃早实品种
单果质量介于 9. 4 ~ 16. 4 g 之间(冯连芬等,2006;
裴东等,2011),川西高山峡谷核桃单果质量介于
6. 07 ~ 20. 7 g 之间(吴万波等,2007),西藏核桃单
果质量变异幅度为 6. 5 ~ 22. 5 g(王滑,2010),伊朗
中部核桃单果质量 6. 0 ~ 15. 2 g ( Arzani et al.,
2008),罗马尼亚西南部实生种群核桃单果质量介
于 6. 8 ~ 18. 4 g(Cosmulescu et al.,2012),以上这些
区域均未报道单果质量小于 6 g 的坚果资源,而本
研究区域坚果单果质量 4. 11 ~ 22. 87 g 之间,小于
6 g的坚果具有一定比例。我国现行国标《核桃坚果
等级》(GB /20398—2006)中要求单果质量越大等级
越高,加之近年来无性系品种的推广,必然会导致小
果型资源的流失,因此为维持核桃资源多样性,加快
该区域小果型资源的保护显得尤为必要和迫切。
期望杂合度是反映种质资源遗传多样性的重要
参考指标(徐刚标,2011)。本研究区域平均期望杂
711
林 业 科 学 52 卷
合度(H e)为 0. 688,高于来自中国山西、四川、重庆
和云南等地 9 个核桃居群平均水平 ( H e = 0. 525 )
(Wang et al.,2008)和西藏核桃居群(H e = 0. 586 4)
(Wang et al.,2015a),而低于黑核桃 ( J. nigra )
(H e = 0. 793) ( Victory et al.,2006 ) 和核桃楸 ( J.
mandshurica)(H e = 0. 806) (Wang et al.,2008),与
中国西藏泡核桃( J. sigillata)居群(H e = 0. 705 7)
(Wang et al.,2015a)相近,说明该区域核桃资源遗
传多样性较高。
较高的表型和遗传丰富度得益于该区域特异的
地理位置。该区域位于我国东部一级平原和西部二
级高原的过渡地带,降雨量在 700 ~ 1 500 mm 之间,
核桃资源在该区域垂直分布范围在 250 ~ 1 800 m
之间,多样的立地和气候环境形成的小气候是维持
该区域资源多样性平衡( Lerner,1954)的重要原因
之 一。另 外 核 桃 是 雌 雄 同 株 的 风 媒 花 树 种
(Gleeson,1982),传粉距离仅仅 300 m 左右 (韩唐
则等,1996),因此,片段化分布会导致一定水平的
遗传漂变(Wang et al.,2008),而居群内自花授粉也
可能 是 居 群 间 遗 传 多 样 性 稳 定 的 重 要 因 素
(Charlesworth et al.,1987)。
3. 2 表型与遗传分化
本研究区域 12 个居群间表型分化系数为
0. 081 5,遗传分化系数为 0. 063,说明居群内分化是
该区域核桃资源变异的主要途径。其中居群间遗传
分化系数低于中国 8 个核桃居群(F ST = 0. 196) (王
滑等,2007)、西藏核桃居群(F ST = 0. 103)和泡核桃
居群(F ST = 0. 111) (Wang et al.,2015a),说明该区
域核桃居群间的遗传分化水平较低。本研究检测到
居群间较强的基因流(Nm = 3. 708),远高于王滑 等
(2007)检测的 Nm = 1. 603。徐刚标(2011)认为种
子扩散和花粉传播是植物基因流最主要的形式。由
于大巴山区自古就是巴蜀文化与荆楚文化、巴蜀文
化与汉中文化交流通道(邓先瑞,2002),核桃常作
为馈赠亲友的礼物,因此种子传播可能是该区域核
桃居群间分化较小的主要原因之一。除了种子传播
外,人为驯化也是导致遗传分化系数 ( F ST )低下的
重要原因(Krutovsky et al.,2009)。作为我国传统的
农业区(邓先瑞,2002),该区域的核桃多分布在田
埂边、河流边或者房前屋后,较强的人为干扰也许是
该区域核桃居群间分化较小的另一个重要原因。
近年来,良种无性系苗在该区域得到了广泛栽
培,致使本地资源流失严重。为更好地保护现有核
桃资源,建议尽快开展以核桃迁地保护或遗传改良
为目的的种质资源保护收集工作。居群间变异反映
居群对各种环境的适应性(庞广昌等,1995),因此,
对于表型变异比较丰富的区域如 QC 居群,应及时
采取就地和迁地相结合的保护策略。
由于本研究区域交通不便,采集实生大树样品
提取 DNA 难以实现,本研究采用了实生大树种子播
种苗叶片提取 DNA 的办法。采样过程中规避了近
年来引种的已知核桃品种,并尽力规避通过“经济
贸易、品种交换”等途径引入的本区域的实生种,但
无法规避近几年来引入本区域已经始花的早实品种
花粉对采样果实的影响,这也是本研究的局限之处。
若加快本区域资源收集,并在资源收集基础上研究
本区域资源多样性,其开发利用意义将更为明确。
4 结论
大巴山区核桃资源丰富,坚果变异最丰富的区
域是青川(QC)居群,坚果表型性状中变异程度最大
的性状是沿缝合线纵切面形状,而遗传变异最丰富
的是巴东(BD)居群; 大巴山区核桃实生居群间坚
果表型分化系数 0. 081 5,遗传分化系数0. 063 2,说
明居群内变异是该区域坚果表型和遗传变异的主要
来源。利用坚果表型性状的 Manhattan 距离和遗传
相似系数进行居群间聚类,结果不完全一致,但都呈
现出与居群间地理距离正相关的趋势。
参 考 文 献
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(责任编辑 徐 红)
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