全 文 ：第 51 卷 第 2 期
2 0 1 5 年 2 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 2
Feb．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150210
收稿日期: 2014 － 04 － 21; 修回日期: 2014 － 05 － 23。
基金项目: 国家“863”项目子项目“白桦、桉树等分子育种与品种创制”(2011AA100202) ; 国家自然科学基金项目“巨桉锌指结构蛋白基
因 EgrZPCT 在抗冷胁迫中功能和调控机制研究”(31270657)。
* 程龙军为通讯作者。
巨桉 EgrDＲEB2A基因结构及表达特性分析*
魏晓玲 程龙军 窦锦青 徐凤华
(浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地 临安 311300)
摘 要: 【目的】从低温条件下巨桉 mＲNA 抑制消减杂交 ( SSH)文库中筛选得到一个受低温诱导的基因
EgrDＲEB2A(Eucgr． G03094)，通过对其蛋白序列特征、亚细胞定位特点以及低温、ABA 和盐胁迫逆境处理条件下基
因表达方式的分析，讨论 EgrDＲEB2A 在巨桉非生物逆境响应中所发挥的作用。【方法】使用 SMAＲT，MatInspector
和 MEGA 等生物信息学软件，分析 EgrDＲEB2A 的序列和编码蛋白特征，搜寻启动子上的重要顺式作用元件并构建
其蛋白序列进化树; 亚细胞定位采用基因枪轰击洋葱表皮的方法; EgrDＲEB2A 组织表达特异性及低温、ABA 和盐
胁迫条件下的基因表达分析分别采用半定量和定量 ＲT-PCＲ 方法进行; 在 4 ℃低温下随处理时间(0. 5，2，6，12，
24，48 h)的基因数字表达谱基础上，用 WGCNA 和 Cytoscape 软件对 EgrDＲEB2A 进行基因共表达分析。【结果】
EgrDＲEB2A 编码的蛋白序列含有 1 个典型的 AP2 结构域，且结构域内部包含 YＲG 和 ＲAYD 2 个保守区，属于
DＲEB2 类基因，进化树构建结果表明该基因属于 DＲEB2 类基因的亚型Ⅰ。EgrDＲEB2A 启动子序列上含有多个与
植物逆境响应相关的顺式作用元件。该基因有明显的核定位区，亚细胞定位结果也表明其编码蛋白主要在核中表
达。正常条件下，根、茎和叶中 EgrDＲEB2A 都有表达，但叶片中表达水平相对较高。在不同低温(0，2，4，6，8 ℃ )下
EgrDＲEB2A 被强烈诱导，4 ℃低温下随处理时间(0. 5，2，6，12，24，48 h)的延长，其表达量呈上升趋势，不同时间处
理下与 EgrDＲEB2A 具有共表达关系的基因多属于参与植物对逆境响应的基因。ABA ( 100 μmol·L － 1 ) 对
EgrDＲEB2A 的表达表现为先促进而后抑制，而 NaCl(200 mmol·L － 1 )的处理则表现为先抑制后促进。昼夜节律同
样影响 EgrDＲEB2A 的表达，光照下基因表达升高，黑暗条件下基因表达降低。【结论】巨桉 EgrDＲEB2A 属于
DＲEB2 类基因，其表达受低温诱导，同时受 ABA、盐和昼夜节律的影响。该基因启动子序列上启动子元件及与其
共表达基因大多与植物逆境响应有关。这些结果表明 EgrDＲEB2A 可能在巨桉抵抗非生物逆境因子的过程中发挥
比较重要的作用。
关键词: 巨桉; EgrDＲEB2A; 基因表达; 非生物胁迫; 昼夜节律
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)02 － 0080 － 10
The Structure and Expression Characteristics of EgrDＲEB2A
Gene in Eucalyptus grandis
Wei Xiaoling Cheng Longjun Dou Jinqing Xu Fenghua
(The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture Zhejiang A＆F University Lin’an 311300)
Abstract: 【Objective】A gene，EgrDＲEB2A，was isolated from the mＲNA suppression subtractive hybridization library
of Eucalyptus grandis ( Eucgr． G03094 ) ． Based on the analysis of structure，subcellular localization of EgrDＲEB2A
protein and gene expression under different treatments of low temperature，ABA and salt，the roles of EgrDＲEB2A in the
resistance to abiotic stresses of Eucalyptus grandis were discussed． 【Method】SMAＲT and MatInspector softwares were
used to analyze the protein structure of EgrDＲEB2A and the cis-elements in promoter sequence of the gene． Phylogenetic
tree of DＲEB proteins was constructed by MEGA software． Subcellular localization of EgrDＲEB2A was characterized with
the method of introducing EgrDＲEB2A-GFP fused genes into onion epidermal cells via gene gun bombardment． And，gene
expression analysis in different tissue，under treatments of low temperature，ABA，salt and circadian rhythm were carried
out by semi-quantitative and quantitative ＲT-PCＲ method respectively． For the gene co-expression of EgrDＲEB2A under
different time treatment at 4 ℃，WGCNA and Cytoscape softwares were used． 【Ｒesult】EgrDＲEB2A was classed into
第 2 期 魏晓玲等: 巨桉 EgrDＲEB2A 基因结构及表达特性分析
DＲEB2 group because the protein it encodes containing one AP2 domain which including a YＲG and a ＲAYD conserved
regions． The phylogenetic tree based on homology comparison showed it belonging to subtypeⅠof DＲEB2 group． Several
cis-elements related with plant stress response were found in the EgrDＲEB2A promoter sequence． Nuclear localization with
DＲEB2 merged protein with GFP implied EgrDＲEB2A mainly located in the nucleus． qＲT-PCＲ result of EgrDＲEB2A
under 0 ℃，2 ℃，4 ℃，6 ℃ and 8 ℃ revealed it was induced． Time course (0. 5，2，6，12，24，48 h) treatments to
E． grandis seedlings at 4 ℃ also increased its expression as the time delayed． The genes co-expressed with EgrDＲEB2A
under different time treatment at 4 ℃ were mostly associated with plant response to abiotic stresses． EgrDＲEB2A
expression increased at the first and then decreased under 100 μmol·L － 1 ABA treatment． However，under the salt stress
(200 mmol·L － 1 )，it was inhibited firstly and then induced． Circadian rhythm also regulates the EgrDＲEB2A expression，
and the transcription level of it was promoted under light and hampered in the darkness． 【Conclusion】EgrDＲEB2A is a
transcriptional factor which was classified into DＲEB2 group． The expression of it was induced by low temperature and
ABA，salt treatments and circadian rhythm also changed its transcription level． Most of cis-elements found in the promoter
of EgrDＲEB2A and genes co-expressed with it were all associated with plant stress response． All these results showed
EgrDＲEB2A possibly played an important role in the process of resistance to aboitic stresses in E． grandis．
Key words: Eucalyptus grandis; EgrDＲEB2A; gene expression; abiotic stress; circadian rhythm
低温、干旱、高盐以及高温等非生物逆境因子是
影响植物生长和发育的重要限制因子。为应对这些
逆境胁迫，植物在长期进化中逐渐形成了复杂的调
控系统，使其面对逆境胁迫时能够通过逆境响应基
因的表达调节，实现在生理生化和发育等方面的适
应性改变，提高其对非生物逆境胁迫的抵抗能力。
在逆境响应的生物学过程中，转录因子发挥着重要
作用，如 ABF(ABＲE binding factor)，NAC，MYB 等
(Nakashima et al．，2009)，它们往往处于逆境信号或
者生理代谢响应及调控的核心位置。
DＲEB ( dehydration responsive element binding
protein)是其中一类重要的转录因子，它通过与干旱
应答元件 DＲE(dehydration responsive element) /CＲT
(C-repeat)结合，广泛参与植物对低温、干旱、高盐
等非生物胁迫的应答和响应(Agarwal et al．，2006)。
DＲEB 基因编码的蛋白都含有一个由 50 ～ 70 个氨
基酸组成的 AP2 /EＲEBP 保守结构域，属于植物中
所特有的转录因子 AP2 /EＲF 基因家族的成员。根
据氨基酸序列差异，DＲEB 家族又分为 6 个子群A1
至 A6，而参与逆境胁迫响应的基因主要集中在 A1
和 A2 两个子群中(Mizoi et al．，2012; Sakuma et al．，
2002)。A1 子群中的基因又称为 DＲEB1 类基因，该
类基因最早在拟南芥( Arabidopsis thaliana)中发现，
参与低温逆境响应的 CBF1，CBF2 和 CBF3 都属于
该类基因。这些转录因子通过与低温诱导的下游基
因(如 COＲ，LT1，ＲD 和 KIN 等 ) 启动子区域的
DＲE /CＲT 元件结合，调控它们的表达，应对逆境胁
迫 ( Jaglo-Ottosen et al．，1998; Novillo et al．，2007;
Stockinger et al．，1997; Zhao et al．，2007)。除了参
与植物低温逆境响应外，DＲEB1 类基因还参与干
旱、高盐等其他非生物逆境因子的响应。如巨桉
(Eucalyptus grandis)中 EgrCBF1，EgrCBF2 除了受低
温强烈诱导外，还参与了高盐和干旱的胁迫响应
(王 京京 等，2012 )。拟南 芥 中 组 成 型 超 表 达
DＲEB1 类基因的转基因植株对低温、干旱和高盐的
耐受力都得到了有效提高。A2 子群中的基因又称
为 DＲEB2 类基因，依据拟南芥和水稻(Oryza sativa)
中发现的 DＲEB2 类基因编码蛋白保守性，该类基因
分为 3 个亚型(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)(Matsukura et al．，2010)。
大多数 DＲEB2 类基因与干旱、高盐胁迫逆境有关。
在拟南芥中，DＲEB2A 和 DＲEB2B 被干旱、高盐和高
温诱导，DＲEB2C 也被高温诱导，但诱导时间迟于
DＲEB2A 和 DＲEB2B ( Sakuma et al．，2002)。另外，
DＲEB2C，DＲEB2D 和 DＲEB2F 都能被高盐逆境诱
导，DＲEB2F 的表达还受 ABA(脱落酸)的促进(Lim
et al．，2007 )。尽管多种逆境条件都能强烈上调
DＲEB2A 的表达，但研究发现，转全长 DＲEB2A 的拟
南芥转基因植株在植株生长、下游调控基因表达和
逆境响应方面与野生型相比并没有明显的变化; 而
将该基因中表达负调控结构域 (NＲD)的序列删除
后，重新进行转基因组成型超表达，转基因植株表现
出生长迟缓，脱水响应基因表达上调，对干旱、高盐
逆境条件抵抗能力提高等现象，表明 DＲEB2A 存在
转录后调控 ( Sakuma et al．，2006 )。目前发现的
DＲEB2A 的转录后调控主要有泛肽降解、蛋白磷酸
化途径以及选择性剪切 3 种途径，不同植物中转录
后调控模式也不同(Agarwal et al．，2007; Egawa et
al．，2006; Matsukura et al．，2010; Qin et al．，2008;
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林 业 科 学 51 卷
Sakuma et al．，2006)。
由此可见，DＲEB2 类基因与逆境因子之间的关
系非常复杂，不同植物中 DＲEB2 类基因的作用和调
控可能有很大不同。目前，DＲEB2 类基因功能及其
与逆境响应之间关系的研究主要集中在模式植物
中，木本植物中这类研究的报道很少。桉树是一种
重要的经济林木，既可以用材，在海岸防护林构建中
也发挥了一定的作用，但低温和高盐胁迫是限制其
栽培范围和作为海岸防护林树种的一个重要因子。
从分子层面上研究其抵抗逆境环境的能力对将来利
用分子生物技术手段提高其种植范围具有重要意
义。本文以巨桉为材料，对 1 个 EgrDＲEB2A 基因结
构特征及其在不同逆境环境下的表达规律进行了分
析，为进一步对其功能的研究及利用奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
巨桉幼苗取自浙江临安浙江农林大学的苗圃
地。幼苗在生长室中培养，培养条件: 日照 16 h，日
温 28 ℃，夜温 22 ℃，光强 150 μmol·m － 2 s － 1，相对湿
度 70%，种植在 3 L 塑料盆里。根、茎和叶取材于 3
月龄的巨桉幼苗，并迅速放入液态氮中冷冻以便用
于 ＲNA 的提取和植物组织特异性表达的分析。
1. 2 DＲEB2A 基因、蛋白序列及启动子元件分析
将序列在 http:∥ www． phytozome． net / search．
php 网站上与巨桉基因组序列数据库进行 blast 比
对，获得基因的全长序列及基因编号。利用蛋白质
保守结构域推测工具 SMAＲT ( http:∥ smart． embl-
heidelberg． de)分析 EgrDＲEB2A 蛋白的结构，并将
该基因氨基酸序列与网站数据库中其他物种基因进
行 blast 分析，搜寻其同源序列。对不同植物的
DＲEB 类蛋白序列与巨桉 DＲEB2A 蛋白序列进行多
序列 联 配，并 用 MEGA4. 0 软 件 ( http: ∥ www．
megasoftware． net /)构建 1 000 个自举重复的无根邻
接树。
启动子元件分析则根据基因 EgrDＲEB2A 在基
因组上所在的位置，以起始密码子 ATG 为起点，截
取其上游 1. 5 kb 序列作为 EgrDＲEB2A 的启动子序
列，利 用 在 线 软 件 MatInspector ( http: ∥ www．
genomatix． de / cgi-bin∥matinspector _prof)对序列进
行分析。
1. 3 冷胁迫
对于不同低温胁迫下的诱导，分别以 25 ℃生长
条件下的幼苗作为对照(CK)。不同低温处理试验
中将巨桉幼苗分不同处理组，每组 3 个重复，分别于
8: 00 开始置于 0，2，4，6，8 ℃ 的低温培养箱
(Microclima1000，Snijders) 中黑暗培养。处理 2 h
后，取 3 株处理组幼苗叶片，提取 ＲNA 备用。在
4 ℃低温下不同处理时间试验中，于 8: 00 开始将
处理苗放入 4 ℃低温培养箱中，随后间隔 24，40，
44，46，47. 5 h 再依次放入处理苗分别作为 48，24，
8，4，2，0. 5 h 的低温处理组，每组处理 3 个重复。处
理完成后统一提取处理苗的 ＲNA 作进一步的基因
表达分析。
1. 4 共表达分析
将 4 ℃不同处理时间中提取的 ＲNA 送诺禾致
源公司进行数字表达谱 ( DGE)测序，所获结果用
WGCNA 软件分析 EgrDＲEB2A 基因与其他基因的
共表达关系，根据获得的与 EgrDＲEB2A 具有共表达
特性的相关基因皮尔森相关系数 ( Parson)进行排
序，取包括 EgrDＲEB2A 基因在内的 20 个基因用
Cytoscape(Version 2. 8. 3)软件构建共表达模式图。
1. 5 昼夜节律、盐胁迫和 ABA 处理
昼夜节律试验中，将桉树幼苗放生长箱中培养，
培养条件为: 白天 25 ℃12 h，晚上 22 ℃ 12 h，相对湿
度 80%。以光照开始为起点，分别在 0，4，8，12，16，
20，24 h 时间点收获处理植株叶片。盐处理试验根据
Kayal 等(2006)的方法进行。从巨桉幼苗完整的完全
展开的叶片上剪下直径 1. 5 cm 的叶盘，在 200 mmol·
L － 1 NaCl 溶液中处理 2，6，12，24 h，以去离子水培养
的同一无性系幼苗叶盘作为对照。ABA 处理试验，
叶盘获得和培养条件与 NaCl 处理一致，同样参考
Kayal 等(2006)的方法。ABA 浓度为 100 μmol·L － 1
(DMSO 作为 ABA 溶剂，终浓度为 10% )，并且将叶盘
浸入含有 10% DMSO 的蒸馏水作为对照，处理时间段
为 2，6，12，24 h。以上所有处理均在结束后提取叶片
ＲNA，逆转录后用于基因表达的研究。
1. 6 ＲNA 的提取、cDNA 合成及基因定量表达
分析
根据王亚红等(2010)的方法进行材料 ＲNA 的
提取采样。提取的 ＲNA 的浓度和质量通过琼脂糖
凝胶电泳检测和分光光度计检测，检测成功的 ＲNA
反转录成 cDNA 通过 PrimeScript  ＲT reagent Kit
(TaKaＲa，大连，中国)试剂盒合成。
定量表达分析中，反应通过使用荧光染料
SYBＲ-Green ( TaKaＲa，大 连，中 国 ) 和 BIO-ＲAD
CFX96 实 时 PCＲ 系 统 ( Bio-Ｒad，USA ) 进 行。
Egr18SrＲNA 的扩增作为该试验的内参。所有生物
学样品均做 3 个重复，并且每个重复均做 3 次定量
分析。根 据 BIO-ＲAD CFX96 的 Bio-Ｒad CFX
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第 2 期 魏晓玲等: 巨桉 EgrDＲEB2A 基因结构及表达特性分析
Manager ( Version 1. 5. 534)计算基因相对表达量。
引物序列见表 1。
表 1 实时荧光定量、半定量所用的引物序列
Tab． 1 List of primer sequences used in
ＲT-PCＲ and qＲT-PCＲ
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
Egr18SrＲNA-qＲT-F 5-CGCGCTACACTGATGTATTC-3
Egr18SrＲNA-qＲT-Ｒ 5-GTACAAAGGGCAGGGACGTA-3
EgrDＲEB2A-qＲT-F 5-CGACATTGTCCAGTCAGTCAGA-3
EgrDＲEB2A-qＲT-Ｒ 5-ATTCGTCCACATCGAACAGGTC-3
1. 7 EgrDＲEB2A 蛋白表达的亚细胞定位
利用 PCＲ 扩增包含已经去掉终止密码子的
EgrDＲEB2A 基因完整开放阅读框的序列，并插入到
35S-sGFP 载体 (插有 pS1aGFP-8 的 sGFP 片段的
pCAMBIA1300 载体 ) 上。以反转录获得的巨桉
cDNA 为模板进行 PCＲ 扩增(表 2)。回收扩增的片
段，酶切后连入载体，挑取含有 EgrDＲEB2A 插入序
列的阳性克隆，测序验证正确后，提取质粒做亚细胞
定位。通过 PDS-1000 /He 型基因枪法 ( Xu et al．，
1998)转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞，转化细胞用
激光共聚焦扫描显微镜观察，成像。
表 2 亚细胞定位所用引物
Tab． 2 The primers used in subcellular localization
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
EgrDＲEB2A-sGFP-F 5-cgc GGATCCGGAGCGGAAAAGGCGAAGG-3
EgrDＲEB2A-sGFP-Ｒ 5-tgc TCTAGAATGCTCCATCTTGACATCTGA-3
2 结果与分析
2. 1 EgrDＲEB2A 基因及蛋白序列分析
通过对巨桉低温 ( 4 ℃ ) 条件下 mＲNA SSH
( suppression subtractive hybridization)文库的构建，
从中筛选到一个低温条件下特异表达的 EST 序列。
在 http:∥www． phytozome． net / search． php 网站上与
巨桉基因组序列数据库进行 blast 比对，发现该序列
对应的巨桉基因序列号为 Eucgr． G03094，该基因转
录本长度为 1 355 bp，开放阅读框长 762 bp，编码只
含有 1 个 AP2 结构域包含 253 氨基酸残基的蛋白。
通过蛋白序列结构分析和同源比对，发现该基因编
码蛋白的 AP2 结构域为 69—127 位氨基酸，有一个
较为典型的核定位序列 VEＲKＲSＲSＲKE; 其含有典
型的 YＲG 和 ＲAYD 2 个保守区，在 YＲG 保守区有
V 和 E 2 个与 DＲE 顺式作用元件结合的重要氨基
酸位点，是与 DＲE 元件结合的关键位点。AP2 结构
域的 C 末端即 ＲAVD 区域则含有一个由 16 个氨基
酸组成的双亲性 α 螺旋( Liu et al．，1998; Okamuro
et al．，1997)。编码蛋白结构特点表明该基因属于
AP2 基因家族中 DＲEB 类亚家族(图 1);同时该基
因编码蛋白氨基酸序列与其他物种中 DＲEB 类蛋白
序列的比对及系统进化树的构建表明，该基因编码
的蛋白属于 DＲEB 类亚家族中的 DＲEB2 类子群，因
此该基因命名为 EgrDＲEB2A。在系统进化树中，
EgrDＲEB2A 与 毛 白 杨 ( Populus tomentosa ) 中 的
PtDＲEB2A 氨基酸序列相似程度最高，达到了 52%，
与其他序列氨基酸相似程度均在 43%以下(图 2)。
2. 2 EgrDＲEB2A 启动子顺式作用元件分析
通过对启动子上顺式作用元件(表 3)的分析，
结果发现在分析序列中含有 1 个 TATA-box 序列、2
个脱落酸 (ABA)响应元件(ABＲE)、1 个油菜素内
酯响应元件(BＲＲE)、1 个干旱应答元件(DＲEB)、1
个 AP2 /EＲEBP 转录因子结合元件(EＲEF)、1 个热
击响应元件(HSF)和 3 个昼夜节律相关的顺式作用
元件(CCA);另外，还有 4 个 MYB、2 个 NAC、3 个
WＲKY 转录因子结合的顺式作用元件序列。该启
动子序列中含有多个与植物逆境胁迫响应相关的顺
式作用元件，暗示 EgrDＲEB2A 基因的表达与逆境因
子有密切的关系，同时多种不同转录因子结合序列
的存在也说明该基因的表达受复杂因素的影响。
表 3 EgrDＲEB2A 启动子的顺式作用元件
Tab． 3 List of cis-element in the promoter of EgrDＲEB2A
可能元件
Putative element
位置
Position
序列
Sequence
数量
Number
ABＲE － 493— － 509 ttctcacACGTgtcgcc 2
－ 440— － 456 tgggatgaCGTGgcggg
BＲＲE － 1478— － 1494 ccccaCGTGtggatctc 1
DＲEB － 881— － 901 cgtaatgtCCGAcgctttaac 1
EＲEF － 903— － 921 aTCGAaatatccaacgtca 1
HSF － 511— － 527 aggaagCTTCccgaagc 1
MYB － 1123— － 1139 tcttctATCCaatgtgg 4
－ 991— － 1 007 accattATCCacaaact
－ 719— － 735 tagggtATCCtttcttt
－ 615— － 631 tatttaCTGTtatgcca
NAC － 1443— － 1469 agcatgcgccgccgtggCACGcaaacc 2
－ 864— － 890 ctatttcgatggtgtTACGtaatgtcc
WＲKY － 968— － 984 ccgtgTTGAcgaatctc 3
－ 911— － 927 tagatTTGAcgttggat
－ 604— － 620 caagtTTGActtattta
CCA － 855— － 841 aacttcaaAATCttt 3
－ 344— － 330 aaaaaaaaAATCcag
－ 334— － 320 tccagaAATAtctag
TATA-box － 317— － 303 atgcTATAaatattc 1
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林 业 科 学 51 卷
图 1 巨桉 EgrDＲEB2A 蛋白序列与其他植物同源蛋白序列的比对
Fig． 1 Multiple alignment of DＲEB2A in E． grandis and its homologus proteins from other plants
CsEＲF1: 甜橙 Citrus sinensis(KC215407. 1) ; StDＲEB1: 马铃薯 Solanum tuberosum(HM641796) ; PtDＲEB2A: 毛白杨
Populus tomentosa(HQ665006. 1) ; AtDＲEB2A: 拟南芥 Arabidopsis thaliana(BA33794) ; OsDＲEB2A: 水稻 Oryza sativa
(Os01g0165000) ． 黑色下划线表示 AP2 结构域，大括号分别表示 YＲG 和 ＲAYD 基序，黑色方框内为核定位序列，双
亲性 α 螺旋结构用 * 号标明。AP2 signature motif is marked with a line，YＲG and ＲAYD motif are marked with two
braces． The nuclear localization signal sequence is boxed and the amphiphilic α helix structure is marked with asterisk．
图 2 植物 DＲEB 蛋白的系统发育树
Fig． 2 Phylogenetic tree of DＲEB protein in different plants
2. 3 EgrDＲEB2A 蛋白表达的亚细胞定位
目前在其他植物中发现的 DＲEB 类基因均为转
录因子，它们的编码蛋白主要在细胞核中表达，为此
构建了 EgrDＲEB2A∷GFP 表达载体，利用基因枪轰
击洋葱表皮的方法对 EgrDＲEB2A 表达蛋白的亚细
胞定位特性进行了研究。结果表明在洋葱细胞中，
EgrDＲEB2A 蛋白主要在细胞核中表达，间接证明了
其转录因子的特性(图 3)。
2. 4 巨桉 EgrDＲEB2A 的组织特异性表达分析
半定量 ＲT-PCＲ 分析结果 (图 4)表明，正常条
件下 DＲEB2A 基因在叶、茎、根中都有一定程度的表
达，但叶中表达量相对较高。
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第 2 期 魏晓玲等: 巨桉 EgrDＲEB2A 基因结构及表达特性分析
图 3 EgrDＲEB2A 的亚细胞定位
Fig. 3 Subcellular localization of EgrDＲEB2A
图 4 巨桉 EgrDＲEB2A 基因在根、茎、叶中的表达分析
Fig. 4 Analysis of EgrDＲEB2A gene expression in root，
stem and leaf in E． grandis
2. 5 低温条件下 EgrDＲEB2A 的表达分析
EgrDＲEB2A 是从低温诱导的 mＲNA 差异表达
文库中筛选出来的，因此对不同低温 ( 0，2，4，6，
8 ℃ )条件下该基因的表达特性进行了分析(图 5)，
结果发现与正常温度条件(25 ℃ )下生长的植株相
比，在不同低温条件下，该基因都被强烈的诱导。同
时，在 4 ℃条件下不同时间梯度(0. 5，2，6，12，24，48
h)处理的试验结果(图 6)也表明，随着处理时间的
延长，EgrDＲEB2A 基因的表达受诱导的程度越强
烈，在处理 48 h 时，表达强度达到最高点，为处理最
初该基因表达量的 113. 2 倍，表明在巨桉中，
EgrDＲEB2A 基因参与了低温逆境胁迫的响应，在低
温环境中，其表达受到强烈诱导，并随处理时间的延
长这种效应得到强化。
2. 6 4 ℃不同处理条件下，基于数字表达谱的
EgrDＲEB2A 基因共表达分析
4 ℃条件下，对不同处理时间下的数字表达谱
中差异表达(差异表达倍数 ＞ 2)的基因进行共表达
分析，Parson 相关系数大于 0. 20 的 19 个基因中(图
7)，包括 3 个 NAC ( Eucgr． I00059，Eucgr． I00100，
Eucgr． G02486 )、1 个 MYB ( Eucgr． F00031 )、1 个
C2H2 锌指结构( Eucgr． B02395)类转录因子基因。
NAC 类转录因子中，相当一部分成员参与了非生物
逆境响应调节 ( Puranik et al．，2012; Nakashima et
图 5 不同低温下 EgrDＲEB2A 的表达
Fig. 5 Ｒelative expression of EgrDＲEB2A under
different low temperatures
图 6 4 ℃不同时间 EgrDＲEB2A 的相对表达差异
Fig. 6 Ｒelative expression of EgrDＲEB2A
under time course treatment at 4 ℃
al．，2012)，部分 MYB 转录因子在 ABA 介导的逆境
响应中发挥重要的作用(Chinnusamy et al．，2004);
而最近的研究则表明，巨桉中某些编码具 C2H2 型
锌指结构蛋白的基因表达也被低温和高盐逆境因子
所促进 (Wang et al．，2014 )。水苏糖合成酶基因
(Eucgr． H00997)、 海 藻 糖 合 成 酶 基 因
58
林 业 科 学 51 卷
图 7 4 ℃不同处理时间下的数字表达谱中差异表达基因的共表达分析
Fig. 7 Co-expression analysis of the EgrDＲEB2A with the data from digital gene expression profiling under time course treatment at 4 ℃
Eucgr． I00059，Eucgr． I00100，Eucgr．G02486: NAC 类转录因子基因 NAC-like transcriptional factor genes; Eucgr． B03984: 植物中性转化
酶家族类基因 Plant neutral invertase family gene; Eucgr．K02611: NDＲ1 /HIN1 类基因 NDＲ1 /HIN1-like; Eucgr． A01061: 生长素响应基
因 Auxin-responsive family gene; Eucgr．G03106: 衰老相关基因 Senescene associated gene; Eucgr． F00031: myb 类转录因子基因 myb-like
transcriptional factor gene; Eucgr．H02454: WD40 重复家族基因 Transducin /WD40 repeat-like superfamily gene; Eucgr． F04257: 组氨酸脱
羧酶基因 Histidine decarboxylase gene; Eucgr．C00201: 海藻糖磷酸酶 /合酶基因 Trehalose phosphatase / synthase gene; Eucgr．D00640: 天
冬酰胺合成酶基因 Asparagine synthetase; Eucgr． J01950: 母体效应显性胚胎发育停滞基因 Maternal effect embryo arrest genes; Eucgr．
B02273: 硫胺素 C 基因 Thiamin C gene; Eucgr．B02395: C2H2 型锌指结构转录因子基因 C2H2 type zinc finger gene; Eucgr．H00997: 水
苏糖合成酶基因 Stachyose synthase gene; Eucgr．G02098: F-box 转录因子类基因 F-box gene; Eucgr． E00330: 淀粉酶基因 Beta-amylase
gene; Eucgr． J00449: 多药抗性基因 6 Pleiotropic drug resistance gene 6．
(Eucgr． C00201)、天 冬酰胺合成酶基因 ( Eucgr．
D00640)也与 EgrDＲEB2A 有密切的共表达关系。这
几类基因编码蛋白在细胞内参与催化合成的产物，
一方面通过影响植物糖代谢过程调节细胞渗透胁
迫，甚至可以进而改变细胞壁的组成成分来应对逆
境环境，如海藻糖(Avonce et al．，2004; Paul et al．，
2008)、水苏糖(Usadel et al．，2008); 另一方面，则
通过改变逆境条件下的氮代谢过程来协调植物的抗
逆效应，如天冬酰胺(Herrera-Ｒodriguez et al．，2007;
Wang et al．，2005)。
2. 7 ABA、盐和昼夜节律对 EgrDＲEB2A 表达的
影响
从图 8 可以看出，100 μmol·L － 1 ABA 处理条件
下，处理早期，ABA 对 EgrDＲEB2A 的表达有一定的
促进作用，处理 2 h 后，基因表达量是对照的 1. 99
倍; 但 6 h 之后，ABA 对 EgrDＲEB2A 的表达开始发
挥抑制效应，24 h 时，ABA 处理条件下 EgrDＲEB2A
的表达水平仅为对照的 0. 28 倍。而在 200 mmol·
L － 1的高盐环境 (图 9) 中，EgrDＲEB2A 的表达随处
理时间的延长表现出先受抑制(6 h 前)而后又被促
进的现象，处理 24 h 时，EgrDＲEB2A 的表达量已为
对照的 2. 92 倍。这表明巨桉中 DＲEB2A 基因功能
的发挥不仅与 ABA 有密切的关系，同时与高盐胁迫
的逆境响应途径之间也存在复杂的互作关系。
很多 DＲEB 类基因的表达会受昼夜节律的调
控。在常温条件下，对巨桉苗进行了 24 h 的处理，
结果(图 10)发现，光照 (0 ～ 12 h)对 EgrDＲEB2A
基因表达有促进作用，但随处理时间的延长，呈先上
升后下降的趋势，在光照处理 8 h 时，基因表达的诱
导达到最高水平。黑暗(12 ～ 24 h)条件下相对于
光照对 EgrDＲEB2A 基因有一定的抑制作用。
68
第 2 期 魏晓玲等: 巨桉 EgrDＲEB2A 基因结构及表达特性分析
图 8 ABA 处理下 EgrDＲEB2A 的相对表达差异
Fig. 8 Ｒelative expression of EgrDＲEB2A with ABA
图 9 盐胁迫下 EgrDＲEB2A 的相对表达差异
Fig. 9 Ｒelative expression of EgrDＲEB2A under salt stress
图 10 在昼夜节律下 EgrDＲEB2A 的相对表达差异
Fig. 10 Ｒelative expression of EgrDＲEB2A under circadian rhythm
3 讨论
EgrDＲEB2A 蛋白序列结构分析表明，它具有典
型的 AP2 结构域，结构域中包含 YＲG 和 ＲAYD 2 个
保守区，这些都是典型的 DＲEB 类基因的特征( Liu
et al．，1998; Mizoi et al．，2012; Okamuro et al．，
1997)。根据拟南芥、水稻中对 DＲEB 分类的标准，
不同物种之间 DＲEB 类基因编码蛋白进化树的构建
结果表明编码 EgrDＲEB2A 的基因属于 DＲEB2 类中
的亚型 I，目前发现的该亚型中的基因都与植物的
抗逆性有密切的关系，如 AtDＲEB2A，AtDＲEB2B，
AtDＲEB2C，AtDＲEB2E; OsDＲEB2A，OsDＲEB2B 等。
EgrDＲEB2A 氨基酸序列与其他物种中同源基因编
码蛋白氨基酸序列的相似性总体上较低，暗示巨桉
中该基因在功能上可能与其他物种有较大分化。另
外，在 EgrDＲEB2A 启 动 子 序 列 上 含 有 ABＲE，
DＲEB，WＲKY，HSF，MYB，NAC 等多个逆境响应相
关转录因子结合的顺式作用元件，也表明大量与逆
境响应相关的转录因子参与了对 EgrDＲEB2A 的调
控。因此推测该基因很可能像其他同类基因一样参
与巨桉的非生物逆境响应。
参与植物抵抗非生物逆境分子途径的 DＲEB2 型
基因大部分属于亚型 I，同时研究表明该类基因主要
参与 干 旱、高 盐 逆 境 胁 迫 的 响 应，但 禾 本 科
(Gramineae)植物中的 DＲEB2 类基因对低温胁迫也
有响应 (Egawa et al．，2006; Matsukura et al．，2010;
Shen et al．，2003)。而 EgrDＲEB2A 为低温条件下
mＲNA 差减文库中筛选得到的基因，暗示在巨桉中该
基因也很可能参与了低温逆境胁迫的响应。正常条
件下，地 上 部 分 不 同 组 织 中，根、茎 和 叶 片 中
EgrDＲEB2A 也都有表达，叶片中表达量要高于根和
茎中表达量，表明该基因作用的发挥可能主要在叶片
中进行。在不同低温条件下(0，2，4，6，8 ℃ )以及 4
℃条件下不同时间梯度(0. 5，2，6，12，24，48 h)处理
的试验结果也表明，不同程度的低温都能诱导
EgrDＲEB2A 的表达，而且随低温处理时间的延长，基
因被诱导的程度不断得到增强。这些都明确说明不
仅在禾本科植物中存在低温响应的 DＲEB2 类基因，
而且巨桉中也存在此类基因。EgrDＲEB2A 的亚细胞
定位分析也表明，该基因表达的蛋白定位在细胞核
中，这与其蛋白序列预测的其转录因子特性是一致
的。低温条件下，其很可能作为重要的上游调控因子
调控巨桉抵抗低温胁迫相关基因的表达，提高其低温
耐受能力。
同时，低 温 不 同 时 间 的 处 理 条 件 下，与
EgrDＲEB2A 共表达的基因中 NAC、MYB 以及 C2H2
锌指 结 构 类 转 录 因 子 类 基 因 的 出 现，暗 示
EgrDＲEB2A 基因的调控与这些基因可能有密切的
关系。水苏糖合成酶、海藻糖合成酶和天冬酰胺合
成酶基因与 EgrDＲEB2A 的共表达关系说明了这些
基因与 EgrDＲEB2A 在低温条件下协同作用，共同参
与了巨桉的低温响应过程，作为代谢相关基因，水苏
糖合成酶、海藻糖合成酶和天冬酰胺合成酶基因极
有可能在 EgrDＲEB2A 基因的下游发挥功能。
78
林 业 科 学 51 卷
DＲEB2 类基因编码的蛋白往往参与多个逆境
因子的响应，而且有的还受到脱落酸(ABA)的影响
( Dubouzet et al．， 2003; Liu et al．， 2008 )。
EgrDＲEB2A 除了受低温的诱导外，研究中发现它还
受高盐条件(200 mmol·L － 1 NaCl)的影响，试验处理
前期，基因受到强烈的抑制作用，但随着处理时间的
延长，抑制作用逐渐减弱，在 12 h 之后，基因反而呈
现为诱导效应。而 ABA 处理则表现为早期诱导、逐
渐变为抑制的规律。在 DＲEB1 类基因中，人们发现
昼夜节律对该类基因的表达也有重要的影响，在白
天表达量上升，夜间表达量下降(Bieniawska et al．，
2008; Fowler et al．，2005)，而对 DＲEB2 类基因表达
受昼夜节律影响的研究却很少。本文对正常条件下
EgrDＲEB2A 表达受昼夜节律影响的试验结果表明，
EgrDＲEB2A 的表达同样受昼夜节律的影响，光照促
进其表达，黑暗则抑制其表达，同时无论光照还是黑
暗该基因的表达还有自己的节律性，呈现先升后降
的规律。这与其启动子上含有响应昼夜节律影响的
顺式作用元件 CCA 也是相呼应的，说明不仅
DＲEB1 类基因受到昼夜节律的影响，DＲEB2 类基
因表达同样与昼夜变化有密切的关系。该特性与
ABA、高盐逆境影响的互作可能是其表达规律具有
摆动性变化的一个原因，这从另一方面说明了植物
对逆境因子的响应受多种环境因素的影响。
本研究中有关 EgrDＲEB2A 的结果表明，在巨桉
中该基因具有响应低温胁迫的特性，同时其表达还
受 ABA 和 高 盐 条 件 的 影 响，这 表 明 巨 桉
EgrDＲEB2A 在低温逆境响应方面的功能，与禾本科
植物中 DＲEB2 类亚型Ⅰ基因可能有一定的相似性。
同时其对高盐和 ABA 的响应规律在其他植物中该
类基因 的表达 特性上 还未发现，这 些 都 表 明
EgrDＲEB2A 响应逆境因子的过程具有一定的复杂
性，可能与其他植物中的同类基因在应对逆境功能
发挥方面有很大的不同。对其进一步的深入研究，
有利于揭示巨桉耐低温、高盐的分子机制，协助桉树
抗逆分子辅助育种工作的开展。
参 考 文 献
王京京，童再康，黄程前，等 ． 2012． 巨桉 EgrCBF1 和 EgrCBF2 基因
的克隆和胁迫响应表达分析 ． 林业科学，48(10) : 41 － 48．
(Wang J J，Tong Z K，Huang C Q，et al． 2012． Cloning of EgrCBF1
and EgrCBF2 genes from Eucalyptus grandis and their expression
under stresses． Scientia Silvae Sinicae，48 ( 10 ) : 41 － 48． ［in
Chinese］)
王亚红，刘 缙，王玉国 ． 2010． 高质量提取银杏种仁总 ＲNA 的改
良方法 ． 中国农学通报，26(15) : 48 － 52．
(Wang Y H，Liu J，Wang Y G． 2010． An improved method ＲNA
isolation from seeds of Ginkgo biloba L． Chinese Agricultural
Science Bulletin，26(15) :48 － 52． ［in Chinese］)
Agarwal P K，Agarwal P，Ｒeddy M K，et al． 2006． Ｒole of DＲEB
transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants．
Plant Cell Ｒep，25(12) : 1263 － 1274．
Agarwal P， Agarwal P K， Nair S， et al． 2007． Stress-inducible
DＲEB2A transcription factor from Pennisetum glaucum is a
phosphoprotein and its phosphorylation negatively regulates its DNA-
binding activity． Mol Genet Genomics，277(2) : 189 － 198．
Avonce N， Leyman B， Mascorro-Gallardo J O， et al． 2004． The
Arabidopsis trehalose-6-P synthase AtTPS1 gene is a regulator of
glucose，abscisic acid，and stress signaling． Plant Physiol，136
(3) : 3649 － 3659．
Bieniawska Z，Espinoza C，Schlereth A，et al． 2008． Disruption of the
Arabidopsis circadian clock is responsible for extensive variation in
the cold-responsive transcriptome． Plant Physiol， 147 ( 1 ) :
263 － 279．
Chinnusamy V， Schumaker K， Zhu J K． 2004． Molecular genetic
perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling
in plants． Journal of experimental botany，55(395) : 225 － 236．
Dubouzet J G，Sakuma Y，Ito Y，et al． 2003． OsDＲEB genes in rice，
Oryza sativa L．， encode transcription activators that function in
drought-，high-salt- and cold-responsive gene expression． Plant J，
33(4) : 751 － 763．
Egawa C，Kobayashi F，Ishibashi M，et al． 2006． Differential regulation
of transcript accumulation and alternative splicing of a DＲEB2
homolog under abiotic stress conditions in common wheat． Genes
Genet Syst，81(2) : 77 － 91．
Fowler S G，Cook D，Thomashow M F． 2005． Low temperature induction
of Arabidopsis CBF1，2，and 3 is gated by the circadian clock． Plant
Physiol，137(3) : 961 － 968．
Herrera-Ｒodriguez M B， Perez-Vicente Ｒ， Maldonado J M． 2007．
Expression of asparagine synthetase genes in sunflower ( Helianthus
annuus ) under various environmental stresses． Plant Physiol
Biochem，45(1) : 33 － 38．
Jaglo-Ottosen K Ｒ，Gilmour S J，Zarka D G，et al． 1998． Arabidopsis
CBF1 overexpression induces COＲ genes and enhances freezing
tolerance． Science，280(5360) : 104 － 106．
Kayal E W，Navarro M，Marque G，et al． 2006． Expression profile of
CBF-like transcriptional factors genes from Eucalyptus in response to
cold． Journal of Expression Botany，57(10) : 2455 － 2496．
Lim C J，Hwang J E，Chen H，et al． 2007． Over-expression of the
Arabidopsis DＲE /CＲT-binding transcription factor DＲEB2C
enhances thermotolerance． Biochem Biophys Ｒes Commun，362
(2) : 431 － 436．
Liu L，Zhu K，Yang Y，et al． 2008． Molecular cloning，expression
profiling and trans-activation property studies of a DＲEB2-like gene
from chrysanthemum ( Dendranthema vestitum) ． J Plant Ｒes，121
(2) : 215 － 226．
Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，et al． 1998． Two transcription factors，
DＲEB1 and DＲEB2，with an EＲEBP /AP2 DNA binding domain
separate two cellular signal transduction pathways in drought- and
88
第 2 期 魏晓玲等: 巨桉 EgrDＲEB2A 基因结构及表达特性分析
low-temperature-responsive gene expression， respectively， in
Arabidopsis． Plant Cell，10(8) : 1391 － 1406．
Matsukura S，Mizoi J，Yoshida T，et al． 2010． Comprehensive analysis of
rice DＲEB2-type genes that encode transcription factors involved in
the expression of abiotic stress-responsive genes． Mol Genet
Genomics，283(2) : 185 － 196．
Mizoi J，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K． 2012． AP2 /EＲF family
transcription factors in plant abiotic stress responses． Biochim
Biophys Acta，1819(2) : 86 － 96．
Nakashima K， Ito Y，Yamaguchi-Shinozaki K． 2009． Transcriptional
regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and
grasses． Plant Physiology，149(1) : 88 － 95．
Nakashima K，Takasaki H，Mizoi J，et al． 2012． NAC transcription
factors in plant abiotic stress responses． Biochimica et Biophysica
Acta (BBA)-Gene Ｒegulatory Mechanisms，1819(2) : 97 － 103．
Novillo F，Medina J，Salinas J． 2007． Arabidopsis CBF1 and CBF3 have
a different function than CBF2 in cold acclimation and define
different gene classes in the CBF regulon． Proc Natl Acad Sci USA，
104(52) : 21002 － 21007．
Okamuro J K，Caster B，Villarroel Ｒ，et al． 1997． The AP2 domain of
APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in
Arabidopsis． Proc Natl Acad Sci USA，94(13) : 7076 － 7081．
Paul M J，Primavesi L F，Jhurreea D，et al． 2008． Trehalose metabolism
and signaling． Annu Ｒev Plant Biol，59: 417 － 441．
Puranik S，Sahu P P，Srivastava P S， et al． 2012． NAC proteins:
regulation and role in stress tolerance． Trends in Plant Science，17
(6) : 369 － 381．
Qin F， Sakuma Y， Tran L S， et al． 2008． Arabidopsis DＲEB2A-
interacting proteins function as ＲING E3 ligases and negatively
regulate plant drought stress-responsive gene expression． Plant Cell，
20(6) : 1693 － 1707．
Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，et al． 2002． DNA-binding specificity
of the EＲF /AP2 domain of Arabidopsis DＲEBs，transcription factors
involved in dehydration- and cold-inducible gene expression．
Biochem Biophys Ｒes Commun，290(3) : 998 － 1009．
Sakuma Y，Maruyama K，Osakabe Y，et al． 2006． Functional analysis
of an Arabidopsis transcription factor， DＲEB2A， involved in
drought-responsive gene expression． Plant Cell， 18 ( 5 ) :
1292 － 1309．
Shen Y G，Zhang W K，He S J，et al． 2003． An EＲEBP /AP2-type
protein in Triticum aestivum was a DＲE-binding transcription factor
induced by cold，dehydration and ABA stress． Theor Appl Genet，
106(5) : 923 － 930．
Stockinger E J，Gilmour S J， Thomashow M F． 1997． Arabidopsis
thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional
activator that binds to the C-repeat /DＲE， a cis-acting DNA
regulatory element that stimulates transcription in response to low
temperature and water deficit． Proc Natl Acad Sci USA，94 ( 3 ) :
1035 － 1040．
Usadel B，Blasing O E，Gibon Y， et al． 2008． Multilevel genomic
analysis of the response of transcripts， enzyme activities and
metabolites in Arabidopsis rosettes to a progressive decrease of
temperature in the non-freezing range． Plant Cell Environ，31(4) :
518 － 547．
Wang S，Wei X L，Cheng L J，et al． 2014． Identification of a C2H2-
type zinc finger gene family from Eucalyptus grandis and its response
to various abiotic stresses． Biologia Plantarum，58(2) : 385 － 390．
Wang H， Liu D， Sun J， et al． 2005． Asparagine synthetase gene
TaASN1 from wheat is up-regulated by salt stress，osmotic stress and
ABA． J Plant Physiol，162(1) : 81 － 89．
Xu S P，Wei Z M． 1998． Introduction to method of microprojectile
bombardment and its application． Plant Physiology Communications，
34(1) :41 － 43．
Zhao J，Ｒen W， Zhi D， et al． 2007． Arabidopsis DＲEB1A /CBF3
bestowed transgenic tall fescue increased tolerance to drought stress．
Plant Cell Ｒep，26(9) : 1521 － 1528．
(责任编辑 徐 红)
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