全 文 ：第 6 卷 第 1 期
1 9 9 3 年 2 月
林 业 科 学 研 究 N o
FO R E ST R E SE A R C }1
、’ 0 1 。 6
F c b
. ,
1 9 9 3
发 根农 杆 菌 促 进 黑 荆树
切 根 幼 苗 生 根
王敬文 陆秀华 蒋 晶
摘共 利用发根农杆菌A ‘、 94 02菌株接种黑荆树切根幼苗 , 在M S 培养基上促进其生根 , 生
根率达96 % ~ 98 % , 平均每株苗生根17 ~ 19 条 , 且促进幼苗高生长 。冠痪碱检测证明新生恨是 RI T -
D N A 转化根 。 R I T 一 D N A 转化细胞生根效应与植物激素有相关性 。
关. 饲 黑荆树、 切根幼苗 、 发根农杆菌 、 生根 、 植物激素
发根农杆菌 (刁g , o ba c t o r iu功 : hiz o g o n o s R ik e r )是一种土壤 杆 菌 , 偶尔通过伤 口或自然
孔 口侵入植物根部 , 引起次生根增生 , 导致“毛根病 ” : ” ’] , 但它从来就没被看 作一种病害 。
虽然其有广泛的寄主范围 , 但还仅限于双子叶植物 。 近年来 , 利用发根农杆 菌 R I T 一D N A
转化植物促进生根、 增加生物量的研究 日益被人们所重视 , 并有人先后申请了技术专利{“’‘] 。
美国、 日本、 以色列学者先后进行了利用发根农杆菌 R I T 一D N A 转化根促进扁桃、 苹果、
油橄榄 、 葡萄等作物生长和提高 产 量 的 研究{“’‘〕, 显示了在农业 、 林业和园艺 上的重要应
用价值 。
在农业 、 林业和园艺实践中 , 扦插和移栽是最基本的栽培技术 , 其成败的关键在于生根
活力。 现在在研究和生产 _I:所应用的生根制剂大都是化学药品配制的 , 能够不同程度地促进
生根活力 , 而发根农杆菌 A 。 rh izo g 。n。 : 侵 染 植 物促进生根 , 则是其 R I T 一D N A 转移并整
合到植物细胞核基因组中 , 并得以表达的结果〔’] 。 农杆碱型 R I T 一D N A 有二 个不连续的片
段 , 即 T L一D N A 和 T R 一D N A , 与根的形态发生有关的 4 个位点 ro l A BC D 位于 T L 一D N A
片一段 , 生长素合成基因t 二 , 1 和 t 。 , 2 位于 T R 一 D N A l:’i. 段上 ’ ‘] 。 St ro be l等〔’J用 A . 动i“g 。n 。s
促进扁桃 (p 犷“用 u s a 二夕g d a lu s Sm its )生根和生 民, 只有携 , ;!护R I T 一 D N A 的 活 细 菌才能有
促进效果 , 细菌提取物或杀死的细菌没有促进作用 。 这友明菌株所产生的任何外源激素对促
进生根无效 , 植株的生长效应主要是根 系发达改善供水的结果 , 而顶端生 L之更旺盛也是个双
要原因 。 然而 , 虽然根组织发生了遗传转化 , 但也不能排除植物激素质和贫的变化对根和植
株的效应 。
黑荆树是优良的丹宁树种 , 无性繁殖团难 。 本文报道利用发根农杆菌接种黑荆树 切根实
生幼苗 , 诱导其生根的部分结果 , 以探讨黑荆树无性繁殖的新途径 。
19 9 2一 0 5一 3 0收摘 。
王 . 文日研究员 , 陆秀华 , 称晶(中国林业科学研究院亚热带林业研究所 浙江畜 阳 3 1衬0 0) 。
1 期 王敬文等 : 发根农杆菌促进黑荆树切根幼苗生根
1 材料和方法
1
.
1 细菌菌株
本实验所用发根农 杆 菌 (A g : o 乙a c ‘。: fu二 t 左f: o g e 。。s )9 4 0 2 、 A ‘、 1 5 8 3 4 、 1 8 5 5 、 8 1 9 6 ,
由法国 D . T e p fe r 教授提 供 。 细菌在Y M 培养基上24 ℃培养72 h , 刮取菌浆 放 在Y M 培
养液中制备悬浮菌液 , 细菌密度为 1 09 个 / m l。
1
.
2 植物材料
黑荆树 (A ca “a 二。。: , “1 D e W il d . )种子在沸水中烫过使种皮软化 , 用纱 布 搓去表皮
胶质 , 室温下浸种 3 d , 取 出种子用。. 5 %升汞消毒 5 m in , 无菌水洗涤15 m hi , 接 种 在经
高压灭菌过的0 . 8 %水琼脂培养基上 , 待种子发芽苗高约 5 c m 时进行接种细菌处理 。
1. 3 细菌接种
将黑荆树幼苗齐茎基切去根系 , 切 口在细菌悬浮液中蘸一下 , 随即插入含或不含激素的
M S 培养基中 , 25 ℃每天 16 h 光照下培养 , 观测幼苗生根和生长情况 。
1
。
4 冠澳碱检测
纸电泳分析冠瘦碱 (叩 in e) 按 Pet it 等【“]法 , 取 1 9 新鲜根同50 m 1 70 % 乙醇研磨匀浆 ,
在1 5 0 0 0 9 离心 1 0 m in , 取上清液蒸发至干 , 残渣溶于水中(o . l m l/ g 组织 ), 在W ha tm a n 几
滤纸上点样进行电泳分析 , 电泳条件 : 10 V /c m , 15 0 m in , 电泳缓冲液组成为甲酸 : 乙 酸:
水 = 3 0 : 6。: 9 1 0 (V : V : V ) 。 电泳结束后干燥滤纸 , 以碱性硝酸银试剂显色 。
2 结果和讨论
2
。
1 菌株的差异
A
。 袄众。g o ne s 不同菌株的 R i质粒类型不同 , 感染和遗传转化不同 寄 主 的能力是不同
的 , 明显地表现出对寄主植物的种属特异性 。 在所试验过的菌株和寄主中 , 不同菌株感染和
转化蔷薇科、 桑科等的能力都比较强 , 感染和转化毛食科、 婴栗科等的能力都相当弱 , 而对
豆科植物的不1司属种的寄主 , 不同菌株的能力有强有弱 : ’口”’」。 不同菌株对黑 荆 树 幼苗促进
生根的能力也不相同(表 1 ) 。 从表 1 可 以看出 , 通 . 涌‘” g 。 : 。“农托碱 型 (A g ro Pi n e 一ty p e)
菌株 A ‘ 、9 4 02 促进黑荆树切根苗生根的能力
比其他几个菌株强得多 , 有一定的应用价值 。
S tr o b e l等〔3 , “1已从农杆碱型性 . : hf: o g o n e s
T R 10 5菌株中筛选出超级菌株A . 法众。ge ne :
2 3 2 , 在扁桃、 油橄榄上用于促进生根、生长
和提高产量的田 间试验 。 由于A . rh 众og en es
A
‘、 9 4 0 2 促进生根 , 增加了根系对营 养 物
质和水分的吸收 , 黑荆树切根幼苗的生长量
也显著增加了(表 2 ) , 对照切根苗由于缺乏
根系吸收 , 仅维持存活 , 生长量没有增加。
表 1 卫 . r丙‘却 g ene : 不同菌株促进黑荆
树切根幼苗生根的结果
接种苗 数
(株)
平均生 根
株数 (株)
每株平均
根数 (条 )
根平均长
度 (e m )
几U介山,曰Ž七八Jtj
1人SC曰三0
On八U几1九廿nŽn”O”U0,二.J1.11Y M 培养液
1 8 55
9 4 02
A ‘
1 5 8 3 4
8 1 9 6
0
3
1 8
1 9
3
4
注 : 切根苗在M S培养基上21 d 的结果 。
肠 林 业 料 学 研 究 6 卷
表 2 A . r h‘: o g e , e s A‘、 84 02侄进燕粼
树切根幼苗生长
菌 株
平均苗高
(e m )
Y M 培养液
A ‘
9 4 02
5
.
2 士 0 . 4
6
.
3 土 0 . 3
6
.
1 土0 . 3
平均叶数
(张 /株 )
4
.
4 土 0 . 3
6
.
2 士0 . 3
6
.
2 士 0 . 2
注 : 在M S培养基上培养2 6 d 的结果。
从介og o ne : 处理大豆的幼苗 , 其异常生 长是
由于细菌产生的植物激素的结果 , 而不是由
于遗传转化所促进的〔‘2 ’将菌株培养物经 高
温(1 2 0 ℃ , 10 m in )杀死细菌 , 或经微孔滤
膜(0 . 45 协m ) 过 滤灭菌 的培养滤液来处理黑
荆树切根幼苗 , 其结果如表 3 。 结果表明 , 只
有活细菌才能促进黑荆树切根苗生根 , 这就
暗示菌株侵染了幼苗切口组织 的 细 胞 , R i
T 二D N A 已插入感染细胞核基因组中 , 已转
化的细胞表现出生 根 的功 能 , 这是 R I T -
2
.
2 A
. 从贻。g one s 转化黑荆树根组织
该菌接种黑荆树切根苗 , 促进其生根和
生长 , 可以设想黑荆树根组织发生了遗传转
化 , 促进了根系生长和吸收 , 但还不能排除
这种促进效应是由于植物激素在质或量上的
变化所引起的结果 。 因存在于切根苗切面和
根系的 月 . Th i加 g en 。: 所产生的植物激素 促
进了生 根 和 生 长 , 例 如 以 高 . 密 度 的 A .
表 3 A . rjl i: 。g e朋 : 各菌株制备物对黑
荆树切根苗生根的作用
菌株制备物
生 根 率
(% )
平均根数
(条 /株 )
Y M 培养液
A
4
A ‘ , 高温灭菌
八‘ , 过 滤灭 菌
9 4 0 2
9 4 0 2 , 高压灭 菌
9 4 0 2 , 过滤灭菌
D N A 在转化细胞中 表 达 的 结 果 。 在一般情况下 , A . 动i“ge ne : R I T 一D N A 转 化组 织
的典型表征是出现毛状根 , 但在黑荆树切根苗上诱发的根是正常根 (详情另报 ) , 如图 1 , 在
扁桃 [a1 ; 油橄榄L“性 葡萄、 苹果 、 郁金香 [’1 (插穗 )上诱生的次生根都是有正 常 机 能 的正常
根 。 转化组织器官发生的机制是十分复杂的 , 与转化组织细胞存在的状态 、 部位 、 极性、 激
素运转等有密切的关系 〔“ ] , 与 R I T刁N A 的插入长度 、插入数 目也有关系 , 有 时两个或两
个以上的 A . 瘫fo ge 解 5 RI T 一D N A 同时转化一个细胞 , 有时同一个细菌的几个 T 一D N A 片
段都整合到一个植物细胞的核基因组中(D ePi c ker , A . et al . , 1 98 5 ) 。 农杆碱型 A . 油、z0 -
g 。, 。s A :
、
9 4 0 2 R I T 二D N A 包 括 二个 不
连续的区段 , 即左区的 T L二D N A 和右区的
T R 二D N A , 与诱导生根有关的 4 个位 点 ro l
A BCD 位于 T L 一D N A 片段中 , 编码生长素
和冠瘦碱合成酶的基因位于 T R刁N A 片段
中。 T L二D N A 和 T R 一D N A 都有促进 生根
的功能 , 但对大多数植物种来说 , 对于诱导
生根 T L 二D N A 比 T R 二D N A 更为重要 , 而
T卜D N A 和 T R ‘D N A 这二个区段之间 的
协同作用能产生最为健壮的根[ ‘3 1, 这种根还
有正常根的结构和功能 。
2. 3 冠续碱合成
经纸电泳分析 (图2 ), 接种A . 动玄: o g e n e s
图 1 接种A . r h‘z o g e o es 黑荆树切根幼苗诱导生根表型
左 : 在含激素的 M S 培养基上培养Z e d
右 : 在无激素的 M S 培养基上培养2 6 d
1 期 王敬文等 : 发根农杆菌促进黑荆树切根幼苗生根
彭鑫
麟攀肇
图 2 接种 A . r h汪。g e ”es 诱发的黑荆树切 根
幼苗根提取 物纸 电泳分析
1
. 农杆碱 a g r o P in e 标准样 品
2
. 甘露碱 m a n n o P in e 标准样品
3
. 没接种 A . : 从之。g en es 黑荆树幼苗的正常 根
4
. 接种 A . r jli z o g e ”e s 黑荆树切根幼苗诱发的 根
细胞分裂素 (6 一B A ) 的 MS 培养基上 , 接种
A
. : hl’o g o n 。: 的切根苗生根率高 达 96 % ~
98 %
, 每株苗平均生根数也多达 17 ~ 19 条 ,
而且根也粗壮 , 苗木生长旺盛 , 而在无激素
的 M S 培养基上切根苗生根状况明显弱化 。
生长素 在 A . 动贻o ge ne : R I T 一D N A 诱 导
生根机制中的作用需要进一步深入研究 。
诱发的黑荆树切根幼苗的根中含 有 农 杆 碱
(a g r o p in e )和甘露碱 (ma n n o p in e ), 这是R i
T 一D N A 所携带的编码冠瘦碱合成基因在黑
荆树根细胞中表达的产物 , 证明R I T一N A
已插入根细胞核基因组中 , 而没接种菌株的
对照根中没有检测到这二种冠瘦碱成分 。
2
.
4 生长案的作用
黑荆树切根幼苗接种 A . 油i“ge n 。: A ‘
或9 4 02 菌株后 , 插入含和不含植物激素的培
养基中 , 其诱导生根的效果是 显 著不 同 的
(表4 ) 。在含有 l m g / L Z , 4 一D 和 o . sm g / m l
表 4 生长素对 A . r hi之o g e o e s R I T 一D NA
诱导燕荆树切根苗生根的促进作用
M S培养基了2 , 4 一 D 1 m g / L _ 、
火6 一 B A 0 . 5 m g / L l
MS培养基
(髯甜)
生 根 率 生 根 数 生 根 率 生 根 数
(% ) (条 ) (% ) (条)
O†6
Žb门了nQ勺‘n6Jq曰.1上8月了CJR†
Y M 培养液
A 4
9 4 0 2
0 0
Ha is in
g h 和 D ur bi 彭 “ 1的研究指出 , 单独使用天然的或合成的生长素对胡萝 卜、甜菜、
芜青、 马铃薯和其他材料的切片都没有明显诱导生根的效果 , 但同 时 也 指 出生 长 素 对 于
A
. 从介og 二。: RI T 一D N A 转化细胞诱导生根又是必不可少 的。 Ma ur a 等汇‘”J的研究指出 ,
生长素本身没有明显的诱导生根作用 , 但 它象扳机那样起动了转化 细 胞 开 始 分 化 出 根 。
M aur a 等利用含不同补体和构件的 RI T 一D N A 的 A . 涌众og o ne : 菌株和胡萝 卜切片顶侧和
基侧生长素极性不同的性质 , 研究了生长素和 T 一D N A 在诱导生根中的相关性 , 结 果 也 证
明植物激素和 T一N A 二者对于诱导生根都是必不可少的 。 单独添加生长 素 ( IA A ) 或同细
胞分裂素( 6 一B A )联合使用 , 都不能诱导未转化细胞生根 , 仅有含生长素合成基因的 T一N A
所转化的细胞也难 以分化生根 。 在无内源或外源激素的情况下转化细胞不能分化出根 , 当给
这些转化细胞供给生长素时就能分化出根 。 但是 , 植物激素的作用与 T 一D N A 转 化 和 表达
并没有直接关系 , 只能说以 目前还不了解的方式作用于 T 一D N A 转化细胞。
利用 A . 从 i扔 g ‘ne : 促进黑荆树硬枝插穗生根尚有一定困难 , 主要是插穗 切口细胞木质
化和多酚类分泌物 , 这使细菌难以存活和发生侵染 。 在农业 、 林业和园艺栽培实践中, ‘包括扦
插和移栽 , A . 话犷二g en “ 是日益受到重视的细菌 , 它的促进生根 的功能有重要的应用价值 ,
在此方面的研究和应用将会越来越多。
参 考 文 献
1 R i k e r , A J
.
Stu d i e s o n ! n fe e ti o u s h a i r y r o o t o f n u r s e ry a p p le t r e e s
.
Jo u r n a l o f A g r i c u ltu r a l
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刀e s e a r e h , 19 3 0 , 魂1 : 5 0 7~ 5 4 0 .
2 H ild e b r a n d
,
E M
.
Life h! s to r y o f th e h a ir y
·
r o o t o r g a n is m in r e 1a tio n t o it s p a t ho g e n e s is o n
n u r s e r y a p p le tr e e s
.
Jo u r n a l o f A g r ic u ltn ra l R e s e a re h l , s‘, 一a , 吕5 7 ~ sas
.
5 St r o b e l
,
G
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D e v e 1o p m e n t o f p la n t r o o t s
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E u r
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Pa t
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1 , 8一, 0 13 70 3 5 .
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A
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H e s s W M
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Im p r o v e m ‘n t s in th e g r o w th a n d y ie ld o f o liv e tr e e s
by tr a n sfo r m a t io n w ith t h e R i Pla s m id o f 月 g r o b o e te r i“门 r 几12 0 9 日n e s . C a n . J . B c r . , 29 5 5 , 6 。:
2 5 8 1 e 2 5 8 5
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, 八 . A g r o b a c , e rf u m r几「z o g e n e s P r o m o te s th e in it i a l g r o w tl一 o f b a r e r o o t
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J o u r n a l o f G e n e ra l M ie r o b io lo g y
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2 9 5 5
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1 3 1 : 1 2‘5 ~ 12 ‘, .
7 C h ilto n
,
M D
,
T e p fe r
,
D
,
Pe t it
, 八 . A 夕r o bo c te r ‘u 的 rh iz o g e ”e s ln s e rt T 一 D N 、、 in to t h e g o n o m e s
o f th e h o s t p la n t r o o t e e lls
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N a t u r e
,
L o n d o n
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1 9 5 2
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2 9 5 : 一52 ~ ‘5 4 .
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J l
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一
T a r d if
,
M
,
Jo u a n ln
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L
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N u e le o t id e se g u e n e e 认 n a lys is o f
‘
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L D 加 A o f
刀夕 r o 乙a c 了e , ‘u , z : r h二之 。夕e z : e s a g r o p i一l e t y p e p la , m id : id e n tifi e a t io n o f o p e n 一 r e a d in g fr a m e s . J .
B in l C he m
, 1 9 86
, 2 G I: 1 0 8 ~ 12 1
.
。 P e tit , 八 , D a v id , C , D a iil, G . Fu r t he r e x re n s io n o f t he o p in e e o n e e p t . p la s 一刀 i d 11, 月夕 r o 6。。 t
e r ‘“爪 r h i之。夕e n e s e o o p e r a t e fo r o p in e d e g r a d a tio n . M o l. G e n . G e n e t , 1 9 8 3 , 1 9 0 : 2 0一2 x4 .
2 0 M u g n ie r
,
J
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E s ta b lis h m e n t o f n e w o x e n ie 11a ir y r o o t lin e b y in o e u la tio n w ith A g r o 乙a 。了e r ‘“ 。 :
r h fz o 夕e ,z e s . P la 一It e e ll R e P o ts , 1 9 8 8 , 7 : ,一 12 .
1 1 T e p fe r
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.
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D N A fr o m A 夕 r o b a c te r ‘u 用 r h‘之 。夕e o e s : ‘\ s o u r e e o f g e n e s ha v in g a p p lie a tio n s
in r h iz o sp h e re b io lo g y a n d p la n t d e v e lo p m e n t
, e c o lo g y
, a n d e v o lu t io n
,
In
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1 2 Ja y n e s
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T h e p o s itio n o f 刀夕 r o ba c te r ‘:‘m rl犷: o 夕en e s . 1llte r 一la tio n a l R e u ie w o f C yt o lo g y
(S u Pp l
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1 9 5 2
, 13
:
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1 3 C a r d a r e lli
,
M
. ,
S Pa n o
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L
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D e Pa o lis
, 八 . Id e n tifie a tio n o f th e g e n e tie lo e u s r e s p o n s ib le fo r
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3 9 1
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S o m e p h y si o lg ie a l e ffe e ts o f A 夕r o b a e le r io m r h‘之o g e o e s o n to m a to .
Ph g to P a t h o l 1 97 0
,
6 0 : 1 10 1~ 1 1 0召.
1 5 C a r d a r e lli
,
M
,
S p a n o
,
L
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M a r io tt i
,
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1
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he r o la o f e u x in in h a ir y r o o t i n d u e t io n
.
Nlo l
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G e n
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G e n e t
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, 2 0 8
: 4 5 7 ~ 4 6 3
.
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R o o t
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o ba c r。, iu n : , hiz o g 。”。e s A ‘ , 9 4 0 2 , a n d r o o tin g w a s Pr o m o te d o n M S m e d iu m
.
T h e r o o t in g r a t io w a s 9 6 % ~ 9 8 %
, a n d t h e a v e ra g e n u m b e r o f n e w r o o t s P e r
s e e d lin g w a s 1 7 ~ 1 9
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b u t th e r o o t
一
e u t s e e d lin g t re a te d w it h m e d iu m a lo n e
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, t r o o t
。
O Pin e a s sa y in d {e a te d th a t th e r e w a s s ta b le m a in te n a n c e o f T
-
D N A in t h e s e n e w ro o ts
.
T h e r e w a s s o m e r e la t io n shiP b e tw e e n a u x in a n d
A
。 : 无i之o g e n e s T 一D N A in tlle in d u e t io n o f r o o t in g .
K ey w o r d s A c a eia , , :ea r n sfi se e d lin g e u te d o f ro o t
,
A g r o ba c te r iu 沉 : 入i之o g e o e s ,
r o o t in g
, Phy to h o rm o n e
W
a n g Jin g w e 一1 , 八 ss o e ia te P ro fe s s o r , l u X iu h u 汪 . J i“ n g J in g (’l’ he R e s e a r e h In s tit u te o f Su b t r -
o Pie a l Fo r e s tr y
,
(二八I户 l厂一 ya n 众Z 卜, e iia n g 3 1 1 40 0 )