全 文 ：第 51 卷 第 11 期
2 0 1 5 年 11 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 11
Nov．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20151118
收稿日期: 2014 － 12 － 15; 修回日期: 2015 － 07 － 28。
基金项目: 江苏省林业三项工程项目( lysx［2014］17) ; 中央财政林业科技推广示范资金项目(［2014］TJS02 号)。
Bt +灭幼脲混剂对美国白蛾幼虫中肠蛋白酶、血淋巴蛋白的影响
徐 明1 徐福元1 吴小芹2
(1．江苏省林业科学研究院 南京 211153; 2．南京林业大学林学院 南京 210037)
摘 要: 【目的】通过测定 Bt、灭幼脲及其混剂对美国白蛾 4 龄幼虫体内中肠有关生化指标的影响，探讨用混剂
防治幼虫的增效机制。【方法】分别将 Bt、灭幼脲及其混剂设置为 5 个浓度;采用生化测定法分别测定药剂对美国
白蛾 4 龄幼虫血淋巴蛋白和中肠蛋白酶活力的影响。【结果】5 个浓度的 Bt、灭幼脲及其混剂处理 4 龄幼虫后，混
剂对幼虫中肠蛋白酶、血淋巴蛋白的抑制效果均优于单剂。混剂处理 6 h 后，幼虫体内中肠蛋白酶活力低于对照，
各浓度处理间差异显著;24 h 后各浓度处理的幼虫中肠蛋白酶的活性较对照明显降低，且与处理浓度呈负相关关
系，说明 Bt +灭幼脲混剂处理明显抑制白蛾 4 龄幼虫的中肠蛋白酶活力，进而直接影响到幼虫的取食。混剂处理
美国白蛾 4 龄幼虫 6 h 后，幼虫的血淋巴蛋白含量分别为 11. 8，18. 0，19. 7，23. 4 和 13. 9 mg·mL － 1，高于对照的
14. 0 mg·mL － 1，处理组血淋巴蛋白含量增加，说明美国白蛾 4 龄幼虫启动防御反应; 处理 12 h 后，血淋巴中部分蛋
白质被消耗或破坏，其含量降低明显，且与处理时间呈负相关关系; 至 72 h 后处理组幼虫体内血淋巴蛋白含量分
别为 6. 2，8. 9，2. 3，3. 2 和 9. 0 mg·mL － 1，均明显低于 72 h 对照的 13. 3 mg·mL － 1，与对照相比下降显著(P ＜ 0. 01)。
【结论】Bt +灭幼脲混剂对白蛾 4 龄幼虫体内中肠蛋白酶活力和血淋巴蛋白的抑制作用均大于单剂，混剂有较强的
增效作用，可加速白蛾 4 龄幼虫的死亡，提高死亡率。
关键词: 美国白蛾; Bt +灭幼脲混剂; 中肠蛋白酶; 血淋巴蛋白; 增效作用
中图分类号: S718. 7 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)11 － 0137 － 08
Effects of the Mixture of Bt and Chlorbenzuron on the Activity of Midgut Proteinase，
Haemolymph Proteins on 4th Instar Larvae of Hyphantria cunea
Xu Ming1 Xu Fuyuan1 Wu Xiaoqin2
(1 ． Forestry Academy of Jiangsu Province Nanjing 211153; 2 ． Forestry College，Nanjing Forestry University Nanjing 210037)
Abstract: 【Objective】The indoor virulence and field control test results showed that the mixture of Bt and
chlorbenzuron had synergism to the second and third generation of the larvae of Hyphantria cunea． This paper analyzed the
influence on the activity of midgut protease and haemolymph proteins on the 4 th instar larvae of H． cunea for exploring its
mechanism of synergism．【Method】The biochemical determination method was used to detect the mixture treatment effect
on the activity of midgut protease and haemolymph proteins on the 4 th instar larvae of H． cunea． 【Ｒesult】 In 6 h
treatments with 5 concentrations of Bt，chlorbenzuron and its mixture to the 4 th instar larvae，the activity of midgut protease
was all lower than that of control，but there were significant differences among treatments． Compared with control the
larval midgut protease activity decreased significantly after 24 h treatments with different concentrations，and the activity
was negatively correlated with treatment times． Test results indicated that the activity of midgut protease was inhibited
significantly by the mixture of Bt and chlorbenzuron，which directly affected the feeding of larvae． After being treated for
6 h with 5 concentrations of the mixture of Bt and chlorbenzuron，the content of haemolymph protein was 15. 8，18. 0，
19. 7，23. 4 and 13. 9 mg·mL － 1 of the 4 th instar larvae and was higher than the content of 14 mg·mL － 1 of the control．
The higher content of haemolymph protein in the treated larvae suggested that the larvae initiated defense responses; After
being treated for 12 h the larvae were consumed or damaged the content of haemolymph protein，and the content of
haemolymph protein decreased significantly，and the treatment concentration were negatively correlated with the treatment
林 业 科 学 51 卷
time; The content of haemolymph protein of the treated group was 6． 2，8． 9，2． 3，3． 2 and 9． 0 mg·mL － 1 respectively
after being treated for 72 h，and they were all significantly lower than 13． 3 mg·mL － 1 of the corresponding control． The
content of haemolymph protein significantly decreased compared with the control group (P ＜ 0． 01) ． 【Conclusion】The
inhibition of the mixture of Bt and chlorbenzur on the activity of midgut protease and haemolymph protein of the 4 th instar
larvae of H． cunea was stronger than that of the single agent，the mixture has strong inhibition and synergistic effect so as
to accelerate and increase the death of the treated 4 th instar larvae of H． cunea．
Key words: Hyphantria cunea; mixture of Bt and chlorbenzuron; the activity of midgut proteinase; haemolymph
proteins; synergistic effect
美国白蛾 (Hyphantria cunea)是一种危险性的
食叶害虫，具有食性杂、危害大、繁殖快、易传播等特
点，属世界性检疫对象。2010 年起该虫在江苏连云
港、徐州、宿迁和盐城等地暴发，并向周边地区扩散
蔓延，目前蔓延的势头仍在加剧，严重威胁当地的城
市绿化、林果业和养蚕业的发展。防治该虫所使用
的有机磷和菊酯类等农药，对家蚕 ( Bombyx mori)
(马惠等，2005)、鱼虾(冷春梅等，2012)具有高毒
性，迫切需要对该虫开展高效安全、可持续、无污染
新型防治方法(罗成等，2011)和生物控制方法的研
究。用苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)与灭幼
脲( chlorbenzuron)混剂防治白蛾幼虫有显著的致死
增效作用(徐明等，2013)，为白蛾生物、无公害防控
提供了新的研究方向。Bt 与灭幼脲混剂均为昆虫
食后发生作用的菌剂，据喻子牛(1990)报道，Bt 毒
蛋白和灭幼脲杀虫机制研究涉及中肠，中肠是昆虫
消化吸收食料的重要场所和组织。Bt 的主要杀虫
机制是昆虫食入毒蛋白晶体后，在中肠高 pH 环境
和蛋白水解酶的作用下，毒蛋白晶体溶解并被激活;
活化的蛋白引起中肠膜上皮细胞裂解、中肠麻痹，使
昆虫几天内死亡。Bt 被昆虫取食后必须被中肠蛋
白酶水解激活，才能释放出具有杀虫活性的毒素蛋
白，如果毒素水解不充分或是被过度水解，都可能造
成昆虫对 Bt 产生抗性(谭声江等，2001; 徐艳聆等，
2006a; 2006b; 赵霞等，2013)。经灭幼脲Ⅰ号处理
后约 1 h，中肠蛋白酶的活力便受到影响; 严重时，
约 60%的酶活力受到抑制。同时观察到，经灭幼脲
Ⅰ号处理后，蚊幼体质量普遍减轻，同时幼虫中肠的
蛋白酶活力下降，这是由于灭幼脲Ⅰ号影响了蚊幼
虫的取食(吴秋雁，1990)。试验表明取食转 API 基
因棉对棉铃虫(Helicoverpa armigera)中肠强碱性类
胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性具有抑制作用(刘
贤进等，2003)。在昆虫的开放式循环系统中，血淋
巴是代谢和代谢过程中各种物质储存和交换的重要
场所。血淋巴在昆虫的防御、免疫、损伤应答、抗冻
等方面都起到重要作用。昆虫血淋巴含有多种蛋白
质，包括形成组织所需蛋白、供应卵母细胞发育的卵
黄原蛋白、激素和脂类的载体蛋白、多种酶等，这些
蛋白质与组织形成和物质代谢有关 (张国洲等，
2000; 谭树乾等，2013; 魏纪珍等，2012)。目前，Bt、
灭幼脲及其混剂处理对白蛾 4 龄幼虫体内中肠蛋白
酶和体内血淋巴蛋白与防效研究尚未见报道。本文
采用生化测定法研究了其对白蛾 4 龄幼虫血淋巴蛋
白 ( haemolymph protein ) 和 中 肠 蛋 白 酶 ( midgut
proteinase)活力的影响，初步探讨了 Bt + 灭幼脲混
剂对防治白蛾增效作用的生理生化机制，以期为该
混剂的研发和推广运用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 供试昆虫 2013 年 6—10 月，江苏省新沂市
窑湾镇欧美杨无性系 72 杨 ( Populus euramericana
cv． I-72)林内采集美国白蛾(简称白蛾)4 龄幼虫。
1. 2 供试药剂 Bt(苏云金杆菌)悬浮剂毒力效价
为 8 000 IU·μL － 1 (扬州绿源生物化工有限公司生
产)，25% 灭幼脲 (安阳市瑞泽农药有限公司生
产)。
1. 3 仪器 恒温水浴锅 (上海申生科技有限公
司)，SpectraMax M2 酶标仪(美国分子仪器公司)，
Heraeus biofuge 台式高速离心机 (D37520 型，德国
Kendrc 公司)，台式低速离心机(TD5A-WS 型，长沙
湘仪离心机仪器有限公司)，分析天平 (0. 1 mg)
(BS110S，赛多利斯 )，电热恒温干燥箱 ( DHG-
9070A 型，上海精宏实验设备有限公司)，混合球磨
仪(德国莱驰 ＲETSCH MM400)，电泳槽 ( Bio-Ｒad
Mini Protean Tetra Cell )，电 泳 电 源 ( Bio-Ｒad
PowerPac Basic)。
1. 4 Bt +灭幼脲混剂对白蛾 4 龄幼虫的室内联合
毒力 1) 药剂配制 (1) 单剂: 将供试 Bt 分别等
831
第 11 期 徐 明等: Bt +灭幼脲混剂对美国白蛾幼虫中肠蛋白酶、血淋巴蛋白的影响
比稀释为 0. 8，0. 4，0. 2，0. 1 和 0. 05 IU·μL － 1 5 个浓
度; 将供试灭幼脲分别等比稀释为 2. 5，1. 25，
0. 625，0. 313 和 0. 156 μL·L － 1 5 个浓度。(2) 混剂:
Bt +灭幼脲混剂是将上述 2 种供试单剂各减半混配
后，分别将其等比稀释为 0. 4 IU·μL － 1 + 1. 25 μL·
L － 1，0. 2 IU·μL － 1 + 0. 625 μL·L － 1，0. 1 IU·μL － 1 +
0. 313 μL·L － 1，0. 05 IU·μL － 1 + 0. 156 μL·L － 1和
0. 025 IU·μL － 1 + 0. 078 μL·L － 1 5 个浓度。
2) 供试幼虫取样 将新鲜复叶槭 ( Acer
negundo )叶片在上述各浓度药液中速浸 20 s，晾干
后放入直径 15 cm 的大培养皿中，每处理浓度接
4 龄幼虫 30 头，以无菌水为对照，重复3 次，分别于
药剂处理后 6，12，24，36，48，72 和 96 h 测定白蛾
4 龄幼虫供血淋巴蛋白和中肠蛋白酶的活力。
1. 5 白蛾 4 龄幼虫血淋巴蛋白和中肠蛋白酶活力
测定方法 1) 中肠蛋白酶测定 (1)样品粗酶液
的提取 中肠样品: 每管样品为 1 mL 进行球磨匀
浆。球磨条件为频率 10 次·s － 1、时长 1 min，重复
3 次。匀浆液于 4 ℃，12 000 r·min － 1条件下离心
5 min，取上清液即为粗酶提取液。
(2)蛋白酶活力测定参照魏纪珍等(2012)的方
法。①酪氨酸标准曲线的制作: 取 7 个 1. 5 mL
Ependoff 管 (标号 0，1—6 )，按顺序分别加入 0，
0. 02，0. 04，0. 06，0. 08，0. 10 和 0. 12 mL 标准酪氨
酸溶液，再用水补足到 0. 20 mL，摇匀后各加入 0. 55
mol·L － 1碳酸钠 1. 0 mL，摇匀，加入 Folin － 酚试剂
0. 20 mL，摇匀并计时，于 30 ℃ 水浴锅中保温
15 min。然后 680 nm 处测定吸光值(以 0 号管作对
照)。以酪氨酸含量(μg·mL － 1 )作横坐标，吸光值
为纵坐标绘制标准曲线。②酶活力测定: a. 酶反
应: 将一 1. 5 mL Ependoff 管加入 0. 4 mL0. 5%的酪
蛋白溶液，于30 ℃水浴中预热 5 min，再加入 0. 2 mL
已预热好的样液并计时，保温水浴 10 min，取出后立
即加入0. 4 mL的 10% 三氯醋酸液，摇匀静置数分
钟，8 000 r·min － 1离心 2 min，取上清液(A 液)。将
另一 1. 5 mL Ependoff 管加入 0. 2 mL 已预热好的样
液和 0. 4 mL 的 10% 三氯醋酸液，摇匀，放置数分
钟，再加 0. 4 mL0. 5%的酪蛋白溶液，然后于30 ℃保
温水浴 10 min，同样离心，得上清液 (对照液即 B
液)。以上 A，B 液各做 1 次平行试验。b. 滤液中
酪氨酸含量的测定: 将 3 个 1. 5 mL Ependoff 管分别
加入0. 2 mL 水、A 液、B 液，然后各加入 1. 0 mL
0. 55 mol·L － 1碳酸钠溶液和 0. 2 mL Folin －酚试剂，
摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。分别
求出 A 液与水、B 液与水的吸光度差值，由标准曲线
查出 A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活
力单位。 c. 酶活力单位定义: 在上述条件下，每
1 min水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸酶量定义为 1 个
蛋白酶活力单位(U)。
2) 血淋巴蛋白测定 (1) 考马斯亮蓝染色法
测定血淋巴蛋白 将血淋巴样品在12 000 r·min － 1
下离心 10 min，取上清做为样品。测定时用 0. 9%
生理盐水对样品进行适当稀释。血淋巴总蛋白测定
采用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒。具体操作按文
献方法 (Bradford，1976)。
(2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳与血淋巴总蛋白测定
及含量计算 ① 凝胶配制: a. 按仪器说明装好玻
璃板，制作的胶的厚度为 1. 0 mm; b. 配制 7. 5%和
10%的分离胶各 15 mL，混匀，超声波脱气灌制;
c. 在凝胶液面上小心加水覆盖，以使界面平滑;
d. 凝固后 (约 30 ～ 45 min)，配制浓缩胶 ( 5%，5
mL): 水 3. 4 mL，30%丙烯酰胺溶液 0. 83 mL，1. 5
mol·L － 1 Tris-HCl( pH6. 8)0. 63 mL，10% SDS 0. 05
mL，10%过硫酸铵 0. 05 mL，TEMED 0. 005 mL，混
匀，灌制; e. 胶插上梳子形成上样孔，约 30 ～ 45 min
后可用。② 加样电泳: a. 取 10μL 样品，加入 2 μL
6 ×上样缓冲液混匀; b. 5 000 r·min － 1 离心，取上
清加样; c. 30 V 电泳至样品进入分离胶 (约 90
min)，再调至 60 V 电泳 1. 5 h，最后调至 90 V 电泳
到溴酚蓝移至凝胶下边界时停止。每槽血淋巴上清
液加样量 6 μL，1—9 号样所用分离胶浓度 7. 5%，
10—112 号样所用分离胶浓度 10%。③ 蛋白的染
色及含量分析计算: a. 染色液的配制。1% 考马斯
亮蓝 Ｒ250: 称取 1 g 的考马斯亮蓝 Ｒ250 溶于 99
mL 乙酸中，过滤后置于 4 ℃冰箱待用。10% 三氯
乙酸(TCA)溶液: 在装有 500 g TCA 的瓶中加入
227 mL 水，形成密度为 1. 454 g·mL － 1 的 100%
(m /V)TCA 的溶液，再稀释到溶液体积的 10 倍。
12. 5%三氯醋酸稀释到溶液体积的 12. 5 倍，7. 5%
三氯醋酸稀释到溶液体积的 7. 5 倍。苏丹黑 B 酒
精饱和液(饱和苏丹黑 B 染液)取苏丹黑 B 约 5 g，
溶于无水乙醇中，使其呈饱和状态。b. 蛋白染色:
1%考马斯亮蓝 Ｒ250 用 12. 5%三氯醋酸稀释 20 倍
后染色 12 h，用 7. 5%三氯醋酸脱色至背景白色透
明。普通蛋白被染成深蓝色。c. 蛋白含量分析计
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林 业 科 学 51 卷
算: 用凝胶分析仪拍照，再对图谱进行分析。计算
各蛋白质谱带相对迁移率 (Ｒf) = (谱带迁移距离
( cm) /溴酚蓝迁移距离( cm)，或用核酸蛋白电泳成
像仪扫描仪对蛋白质谱带进行扫描定量 (曹传旺
等，2009; 程惊秋等，1986)。
1. 6 数据统计分析 采用 DPS 7. 0. 5 软件进行方
差分析，采用 Duncan 邓肯氏(新复极差法)分别在
0. 05 和 0. 01 水平检验各处理间的差异显著性。
2 结果与分析
2. 1 Bt、灭幼脲及其混剂处理对白蛾 4 龄幼虫体内
中肠蛋白酶活力的影响 1) 不同浓度 Bt 处理对白
蛾 4 龄幼虫体内中肠蛋白酶活力的影响 Bt 被昆
虫取食后必须被中肠蛋白酶水解激活，才能释放出
具有杀虫活性的毒素蛋白，5 个浓度 Bt 处理白蛾
4 龄幼虫6 h 后，除 0. 05 IU·μL － 1和 0. 1 IU·μL － 1处
理的幼虫体内中肠蛋白酶活力 9. 71 U·mL － 1和 8. 46
U·mL － 1高于对照的 8. 42 U·mL － 1外，其余浓度处理
的中肠蛋白酶活力均低于对照，并于 12 h 后其活力
下降明显，且与处理时间呈负相关( r = － 0. 74); 处
理后 4 龄幼虫体内中肠蛋白酶活力明显降低，与对
照组相比下降显著(P ＜ 0. 01)(图 1)。
图 1 Bt 处理对美国白蛾 4 龄幼虫体内中
肠蛋白酶活力的影响
Fig． 1 Effects of the activity of midgut protease on 4 th
instar larvae of H． cunea by different concentration
of B． thuringiensis treatment
图中数据经邓肯氏新复极差检验法 ( DMＲT)检验在 P ＜ 0. 01
水平差异显著。Data is tested by Duncan multiple range test，P ＜
0. 01．下同 The same below．
2) 不同浓度灭幼脲处理对白蛾 4 龄幼虫体内
中肠蛋白酶活力的影响 5 个浓度灭幼脲处理对美
国白蛾 4 龄幼虫中肠蛋白酶活力的影响如图 2 所
示: 处理 6 h 的 0. 625 μL·L － 1处理的中肠蛋白酶的
活力 10. 71 U·mL － 1高于对照的 8. 42 U·mL － 1，处理
36 h 的 0. 625 μL·L － 1和 1. 25 μL·L － 1处理的中肠蛋
白酶的活力分别为 6. 04 U·mL － 1、5. 81 U·mL － 1，高
于对照的 4. 28 U·mL － 1，除上述处理外，其他处理均
受到影响。处理白蛾 4 龄幼虫体内中肠蛋白酶的活
力低于对照，并于 12 h 后其活力均低于对照，下降
明显，且与处理时间呈负相关( r = － 0. 60); 处理后
4 龄幼虫体内中肠蛋白酶活力明显降低，与对照组
相比下降显著 ( P ＜ 0. 01 )，中肠蛋白酶活力受到
抑制。
图 2 灭幼脲处理对美国白蛾 4 龄幼虫体内中
肠蛋白酶活力的影响
Fig． 2 Effects of the activity of midgut protease on 4 th
instar larvae of H． cunea by the treatment of
different concentration of chlorbenzuron
3) 不同浓度 Bt +灭幼脲混剂处理对白蛾 4 龄
幼虫体内中肠蛋白酶活力的影响 5 个浓度的 Bt +
灭幼脲混剂处理白蛾 4 龄幼虫后，除处理 36 h 的
0. 2 IU·μL － 1 + 0. 625 μL·L － 1处理的中肠蛋白酶的
活力 4. 34 U·mL － 1高于对照的 4. 28 U·mL － 1和处理
48 h 的 0. 4 IU·μL － 1 + 1. 25 μL·L － 1处理中肠蛋白
酶的活力 3. 43 U·mL － 1高于对照的 3. 13 U·mL － 1
外，6 h后美国白蛾 4 龄幼虫体内中肠蛋白酶的活力
均低于对照，并于虫取食 12 h 后混剂处理同单剂处
理一样，幼虫中肠蛋白酶的活性较对照低，但各浓度
处理间差异显著。处理 24 h 各浓度处理幼虫中肠
蛋白酶的活力较对照明显降低，其活力下降明显，且
与处理时间呈负相关( r = － 0. 84); 处理后 4 龄幼
虫体内中肠蛋白酶活力明显降低，与对照组相比下
降显著(P ＜ 0. 01) (图 3)，中肠蛋白酶活力受到抑
制。这会直接影响到虫的取食，破坏昆虫营养吸收
041
第 11 期 徐 明等: Bt +灭幼脲混剂对美国白蛾幼虫中肠蛋白酶、血淋巴蛋白的影响
与平衡，干扰昆虫生长，是幼虫加快死亡的一个
原因。
图 3 Bt +灭幼脲混剂处理对美国白蛾 4 龄幼虫体内中
肠蛋白酶活力的影响
Fig． 3 Effects of the activity of midgut protease on 4 th
instar larvae of H． cunea by the treatment of
different concentration of the mixture of Bt and chlorbenzuron
2. 2 Bt、灭幼脲及其混剂处理对白蛾 4 龄幼虫体内
血淋巴蛋白的影响 1) 不同浓度 Bt 处理对白蛾
4 龄幼虫体内血淋巴蛋白的影响 5 个浓度 Bt 处理
白蛾 4 龄幼虫 6 h 后，处理组 4 龄幼虫的血淋巴蛋
白含 量 分 别 为 19. 6，19. 6，20. 2，23. 3 和 16. 0
mg·mL － 1，对照的白蛾 4 龄幼虫血淋巴蛋白含量为
14. 0 mg·mL － 1，说明药剂能够使得白蛾 4 龄幼虫启
动防御反应，血淋巴中蛋白质含量增加。当处理
12 h后，血淋巴中部分蛋白质被消耗或破坏，处理组
血淋巴蛋白含量下降明显，且与处理时间呈负相关
( r = － 0. 65); 处理组 4 龄幼虫体内血淋巴蛋白含
量至 72 h 分别为 7. 2，4. 9，7. 3，4. 7 和·6. 7 mg·
mL － 1，至 96 h 分别为 5. 5，6. 3，7. 2，5. 5 和 7. 1 mg·
mL － 1，均明显低于对照 72 h 的 13. 3 mg·mL － 1和
96 h的 15. 1 mg·mL － 1，与对照组相比处理组 4 龄幼
虫体内血淋巴蛋白下降显著(P ＜ 0. 01) (表 1)，中
肠血淋巴蛋白受到破坏，加快幼虫死亡。
2) 不同浓度灭幼脲处理对白蛾 4 龄幼虫体内
血淋巴蛋白的影响 不同浓度灭幼脲处理后其 4 龄
幼虫体内血淋巴蛋白的含量受到影响。不同浓度灭
幼脲处理 12 h 后高于对照，说明白蛾 4 龄幼虫启动
防御反应，血淋巴中蛋白质含量增加。当处理 36 h
后血淋巴中部分蛋白质被消耗或破坏，其含量降低
明显，且与处理时间呈负相关( r = － 0. 88); 至 96 h
后处理组4 龄幼虫体内血淋巴蛋白含量分别为 4. 9，
5. 2，7. 5，5. 1 和 8. 2 mg·mL － 1，明显低于对照的
15. 1 mg·mL － 1，与对照组相比处理组 4 龄幼虫体内
血淋巴蛋白下降显著(P ＜ 0. 01) (表 2)，中肠血淋
巴蛋白受到破坏，加快幼虫死亡。
表 1 不同浓度 Bt 处理对白蛾 4 龄幼虫体内血淋巴蛋白含量的影响①
Tab． 1 The content of haemolymph protein in 4 th instar larvae of H． cunea by the
treatment of different concentration of B． thuringiensis (mg·mL － 1 )
处理 Treatment 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h
0. 8 IU·μL － 1 19. 6 ± 2. 5b 8. 4 ± 1. 6b 13. 1 ± 1. 9a 5. 0 ± 0. 7d 9. 1 ± 2. 1b 7. 2 ± 1. 3b 5. 5 ± 0. 8d
0. 4 IU·μL － 1 19. 6 ± 2. 8b 7. 6 ± 2. 0c 11. 5 ± 2. 1a 7. 8 ± 1. 0c 10. 0 ± 2. 2a 4. 9 ± 0. 2d 6. 3 ± 0. 7c
0. 2 IU·μL － 1 20. 2 ± 2. 0a 9. 2 ± 2. 3b 10. 0 ± 2. 2b 8. 4 ± 1. 1b 4. 4 ± 0. 4d 7. 3 ± 0. 7b 7. 2 ± 1. 1b
0. 1 IU·μL － 1 23. 3 ± 2. 7a 7. 7 ± 1. 8c 1. 9 ± 0. 4d 5. 6 ± 0. 5d 3. 9 ± 0. 3d 4. 7 ± 0. 5 5. 5 ± 0. 6d
0. 05 IU·μL － 1 16. 0 ± 2. 6b 13. 0 ± 2. 2a 6. 8 ± 1. 2c 8. 6 ± 0. 7b 3. 5 ± 0. 2d 6. 7 ± 0. 6c 7. 1 ± 0. 8b
CK 14. 0 ± 1. 8c 10. 4 ± 2. 1a 12. 3 ± 1. 8a 12. 6 ± 1. 8a 12. 6 ± 2. 5a 13. 3 ± 1. 9a 15. 1 ± 2. 7a
①数据经邓肯氏新复极差检验法(DMＲT)检验差异显著(P ＜ 0. 01)。Data is tested by Duncan multiple range test，P ＜ 0. 01． 下同 The same
below．
表 2 不同浓度灭幼脲处理对白蛾 4 龄幼虫体内血淋巴蛋白含量的影响
Tab． 2 The content of haemolymph protein in 4 th instar larvae of H． cunea by the treatment of
different concentration of chlorbenzuron (mg·mL － 1 )
处理 Treatment 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h
1. 25 μL·L － 1 17. 7 ± 2. 2b 14. 5 ± 1. 8c 16. 9 ± 2. 8a 11. 1 ± 1. 1a 12. 9 ± 3. 0a 12. 0 ± 2. 2a 4. 9 ± 0. 8d
1. 25 μL·L － 1 11. 0 ± 1. 4c 10. 0 ± 1. 5d 17. 6 ± 2. 6a 8. 5 ± 0. 5b 12. 4 ± 1. 8a 5. 2 ± 0. 3d 5. 2 ± 0. 6d
0. 625 μL·L － 1 21. 4 ± 3. 0a 27. 8 ± 3. 3a 10. 7 ± 1. 3c 8. 4 ± 0. 6b 9. 7 ± 0. 8c 11. 3 ± 0. 9b 7. 5 ± 0. 4c
0. 313 μL·L － 1 9. 3 ± 1. 1d 17. 7 ± 2. 7b 12. 7 ± 1. 5b 8. 6 ± 0. 5b 6. 4 ± 0. 4d 7. 9 ± 0. 5c 5. 1 ± 0. 2d
0. 156 μL·L － 1 11. 4 ± 1. 2c 13. 1 ± 1. 8c 5. 0 ± 0. 4d 7. 5 ± 0. 4c 11. 7 ± 1. 0b 9. 0 ± 0. 7c 8. 2 ± 1. 1b
CK 14. 0 ± 2. 0b 10. 4 ± 1. 3d 12. 3 ± 1. 5b 12. 6 ± 1. 3a 12. 6 ± 1. 3a 13. 3 ± 1. 2a 15. 1 ± 2. 4a
141
林 业 科 学 51 卷
3) 不同浓度 Bt +灭幼脲混剂处理对白蛾 4 龄
幼虫体内血淋巴蛋白的影响 5 个浓度 Bt +灭幼脲
混剂处理白蛾 4 龄幼虫 6 h 后，处理组白蛾 4 龄幼
虫体内血淋巴蛋白含量分别为 15. 8，18. 0，19. 7，
23. 4 和 13. 9 mg·mL － 1，高于对照的 14. 0 mg·mL － 1，
说明白蛾 4 龄幼虫启动防御反应，血淋巴中蛋白质
含量增加; 当处理 12 h 后血淋巴中部分蛋白质被消
耗或破坏，其含量降低明显，且与处理时间呈负相关
( r = － 0. 62); 处理组 4 龄幼虫体内血淋巴蛋白含
量至 72 h后分别为 6. 2，8. 9，2. 3，3. 2 和 9. 0 mg·
mL － 1，至96 h分别为 5. 6，9. 0，6. 5，4. 5 和 9. 2 mg·
mL － 1，均明显低于对照 72 h 的 13. 3 mg·mL － 1和
96 h的 15. 1 mg·mL － 1，与对照组相比处理组 4 龄幼
虫体内血淋巴蛋白下降显著(P ＜ 0. 01) (表 3)，中
肠血淋巴蛋白受到破坏是加快幼虫死亡的另一个
原因。
综上所述，5 个浓度 Bt、灭幼脲单剂及其混剂处
理 6 h 白蛾 4 龄幼虫，其体内中肠蛋白酶的平均活
力分别为 6. 85，5. 09 和 3. 50 U·mL － 1，处理 72 h 白
蛾4 龄幼虫体内中肠蛋白酶的平均活力分别为
3. 04，4. 60 和 2. 39 U·mL － 1，说明混剂处理对白蛾 4
龄幼虫体内中肠蛋白酶活力的抑制作用均大于单
剂; 5 个浓度Bt、灭幼脲单剂和其混剂处理 12 h 白
蛾 4 龄幼虫体内血淋巴蛋白平均含量分别为
15. 60，9. 40 和 9. 70 mg·mL － 1;处理 72 h 白蛾 4 龄
幼虫体内血淋巴蛋白平均含量分别为 11. 60，7. 30
和 7. 16 mg·mL － 1，说明混剂处理对白蛾 4 龄幼虫体
内血淋巴蛋白含量的抑制作用均大于单剂。总之，
Bt +灭幼脲混剂对白蛾 4 龄幼虫体内中肠蛋白酶活
力和血淋巴蛋白的抑制作用均大于单剂，混剂均有
较强的抑制作用和增效作用，并加快了白蛾 4 龄幼
虫的死亡速度，提高了死亡率(徐明等，2013; 喻子
牛，1990; 吴秋雁等，1991)。
表 3 不同浓度 Bt +灭幼脲混剂处理对白蛾 4 龄幼虫体内血淋巴蛋白含量的影响
Tab. 3 The content of haemolymph protein in 4 th instar larvae of Hyphantria cunea by the treatment of
different concentration of the mixture of Bt and chlorbenzuron (mg·mL － 1 )
处理
Treatment
6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h
0. 4 IU·μL － 1 + 1. 25 μL·L － 1 11. 8 ± 1. 3d 5. 8 ± 0. 4d 15. 3 ± 2. 2a 8. 3 ± 0. 5b 8. 9 ± 1. 6b 6. 2 ± 0. 5c 5. 6 ± 1. 3d
0. 2 IU·μL － 1 + 0. 625 μL·L － 1 18. 0 ± 2. 4b 7. 5 ± 0. 5d 8. 2 ± 1. 1c 5. 0 ± 0. 3d 7. 3 ± 0. 4c 8. 9 ± 1. 2b 9. 0 ± 1. 1b
0. 1 IU·μL － 1 + 0. 313 μL·L － 1 19. 7 ± 2. 1b 6. 3 ± 0. 4d 7. 0 ± 0. 6c 4. 4 ± 0. 2d 4. 7 ± 0. 2d 2. 3 ± 0. 1d 6. 5 ± 0. 5c
0. 05 IU·μL － 1 + 0. 156 μL·L － 1 23. 4 ± 3. 6a 7. 3 ± 0. 8d 6. 3 ± 0. 5d 7. 6 ± 1. 0c 2. 8 ± 0. 1d 3. 2 ± 0. 2d 4. 5 ± 0. 3d
0. 025 IU·μL － 1 + 0. 078 μL·L － 1 13. 9 ± 1. 8c 14. 8 ± 2. 7a 6. 3 ± 0. 3d 4. 3 ± 0. 2d 6. 3 ± 0. 4c 9. 0 ± 1. 3b 9. 2 ± 0. 7b
CK 14. 0 ± 1. 9c 10. 4 ± 1. 4c 12. 3 ± 1. 6b 12. 6 ± 1. 5a 12. 6 ± 1. 7a 13. 3 ± 0. 9a 15. 1 ± 2. 1a
3 讨论
室内外毒力测定和防治试验结果表明，Bt + 灭
幼脲混剂对防治白蛾 2，3 代幼虫有较强的增效作用
(徐明等，2013)。许多研究表明药剂处理后中肠蛋
白酶的活力便受到影响，严重时约 60%的酶活力受
到抑制(龚国玑等，1988)。这会直接影响到昆虫的
取食，导致体质量减轻，是使幼虫生长发育缓慢的另
一个原因。针对昆虫中肠蛋白酶与 Bt 毒力活性的
大量研究表明，蛋白酶直接影响 Bt 毒素蛋白的杀虫
专一性、作用方式及其抗性(Brar et al．，2007; 张宗
炳等，1990; 张少燕等，2004); 活体 PuGV-Ps 包涵
体中碱性蛋白酶的存在，增强了 Bt 晶体蛋白的酶解
活性，提高了 Bt 对小菜蛾(Plutella xyllostella) 的毒
力(徐健等，2008)。Oppert 等(1996)发现丝氨酸蛋
白酶类是 Bt 的主要消化酶。20 世纪 50 年代 Birk
等发现含有大豆胰蛋白酶抑制素的大豆 ( Glycine
max)浸提物可抑制赤拟谷盗( Tribolium castaneum)
幼虫的生长(刘贤进等，2003)，Hilder 等(1987)首
次证实了转蛋白酶抑制素基因植物的抗虫作用。蛋
白酶抑制素对昆虫的作用方式在于影响多种蛋白酶
的活性，如强碱性类胰蛋白酶的活性降低，而弱碱性
类胰蛋白酶的活力反而提高，最终破坏昆虫消化过
程中重要蛋白酶的协调性，导致昆虫生长受阻 (王
琛柱等，1995)。进食转 API 基因棉后生长受明显
抑制的棉铃虫幼虫，蛋白酶活性下降，引起昆虫对食
物中蛋白质消化的障碍，并影响昆虫进一步摄食，破
坏昆虫营养吸收与平衡，干扰昆虫生长，最终导致昆
虫死亡(刘贤进等，2003; 梁革梅等，2001)，这方面
研究很多，但未见有关 Bt、灭幼脲及其混剂处理对
白蛾4 龄幼虫体内血淋巴蛋白和中肠蛋白酶活力影
响的报道。本研究表明: 1) Bt + 灭幼脲混剂处理
使白蛾4 龄幼虫中肠蛋白酶活力受到明显抑制并破
坏了昆虫营养吸收与平衡，加速了白蛾 4 龄幼虫的
死亡。本试验 5 个浓度 Bt + 灭幼脲混剂处理白蛾
4 龄幼虫6 h后，中肠蛋白酶的活力便受到影响。药
241
第 11 期 徐 明等: Bt +灭幼脲混剂对美国白蛾幼虫中肠蛋白酶、血淋巴蛋白的影响
剂处理白蛾 4 龄幼虫体内中肠蛋白酶活力低于对
照，并于取食 12 h 后混剂处理同单剂处理一样，幼
虫中肠蛋白酶的活力较对照略有降低，但在各浓度
处理间差异显著。处理 24 h 各浓度处理幼虫中肠
蛋白酶的活性较对照显著下降，且与处理浓度呈负
相关; 处理后 4 龄幼虫体内中肠蛋白酶活力明显降
低，与对照组相比 4 龄幼虫体内中肠蛋白酶活力也
下降显著。2) Bt + 灭幼脲混剂处理使白蛾 4 龄幼
虫体内血淋巴蛋白质含量下降显著，使其失去了防
御、免疫、损伤应答、抗冻等方面的功能。5 个浓度
Bt +灭幼脲混剂处理白蛾 4 龄幼虫 6 h 后，处理组
白蛾4 龄幼虫体内血淋巴蛋白含量分别为 15. 8，
18. 0，19. 7，23. 4 和 13. 9 mg·mL － 1，高于对照的
14. 0 mg·mL － 1，说明白蛾 4 龄幼虫启动防御反应，
血淋巴中蛋白质含量增加; 当处理 12 h 后，血淋巴
中部分蛋白质被消耗或破坏，蛋白质含量降低明显，
且与处理时间呈负相关; 处理组 4 龄幼虫体内血淋
巴蛋白含量至72 h后分别为 6. 2，8. 9，2. 3，3. 2 和
9. 0 mg·mL － 1，至 96 h 分别为 5. 6，9. 0，6. 5，4. 5 和
9. 2 mg·mL － 1，均明显低于对照 72 h 的 13. 3 mg·mL － 1
和96 h的 15. 1 mg·mL － 1。相关研究表明，微孢子虫
寄生引起意蜂(Apis mellifera)中肠上皮细胞破坏、脱
落，肠壁溃烂，肠道对蛋白质和其他营养物质的吸收
功能降低，然而意蜂血淋巴总蛋白质含量的降低并
不表示微孢子虫感染后意蜂的防御反应功能的减弱
或抑制 (周婷等，2004; 谢伟东，1988; 张仙红等，
2006)。但本研究发现，Bt +灭幼脲混剂处理使白蛾
4 龄幼虫体内血淋巴蛋白受到破坏是加快幼虫死亡
的另一个原因。
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(责任编辑 朱乾坤)
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