全 文 ：第 52 卷 第 3 期
2 0 1 6 年 3 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 52，No. 3
Mar．，2 0 1 6
doi:10．11707 / j．1001-7488．20160307
收稿日期: 2015 － 04 － 17; 修回日期: 2015 － 05 － 18。
基金项目: 国家自然科学基金项目“巨桉锌指结构蛋白基因 EgrZPCT 在抗冷胁迫中功能和调控机制的研究”(31270657) ; 国家“863”项
目子项目“白桦、桉树等分子育种与品种创制”(2011AA100202)。
* 程龙军为通讯作者。
巨桉低温胁迫响应基因 EgrCR的表达与功能*
徐凤华 程龙军 魏晓玲 窦锦青
(浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地 临安 311300)
摘 要: 【目的】通过对巨桉中冷响应基因 EgrCR(Eucgr． B02857)的蛋白序列特征、亚细胞定位、低温等非生物
逆境条件下的表达以及拟南芥中该基因超表达株系的表型分析，探讨 EgrCR 基因在巨桉响应低温等非生物逆境中
的作用。【方法】利用 Protparam，PSIPRED，TMHMM，MatInspector 和 MEGA 等生物信息学软件，预测 EgrCR 编码蛋
白结构特征、启动子上的重要顺式作用元件，并构建其同源蛋白序列进化树; 同时，采用基因枪轰击洋葱表皮方法
进行基因编码蛋白亚细胞定位分析; 组织特异性表达及低温等非生物逆境及昼夜节律下的表达分析，分别采用半
定量和定量 RT-PCR 方法。通过构建 35S::EgrCR 超表达载体转化拟南芥，观察转基因株系在不同低温(0，4 ℃ )处
理下的表现，研究该基因对低温响应的功能特性。【结果】EgrCR 编码的蛋白序列含有 144 个氨基酸，二级结构中
包含 4 个 α 螺旋、3 个 β 折叠，没有预测到结构域、跨膜域的存在。在进化的亲缘关系上，EgrCR 与毛果杨中的同源
蛋白亲缘关系最近，氨基酸序列相似度达到 68%。在其启动子序列上含有多个与植物逆境响应相关的顺式作用元
件。亚细胞定位结果表明其编码蛋白在核中表达。正常条件下，EgrCR 主要在茎和叶中表达。不同低温(0，2，4，
6，8 ℃ )处理和 4 ℃低温下随处理时间(2，6，12，24，48 h)的延长，EgrCR 受到强烈的诱导。ABA(100 μmol·L － 1 )对
EgrCR 表达没有明显影响，而 NaCl(200 mmol·L － 1 )处理下则表现为先抑制后促进。昼夜节律也影响 EgrCR 的表
达，光照下基因表达被诱导，黑暗条件下基因表达受抑制。拟南芥中 EgrCR 超表达转基因株系 4 ℃处理条件下，花
青素苷积累现象减轻; 0 ℃处理 3 天再恢复生长 1 周后，超表达株系能快速恢复生长，表现出较强的耐低温能力。
【结论】EgrCR 基因参与巨桉低温胁迫响应，还可能参与巨桉的高盐胁迫响应，昼夜节律对其表达也有影响。
关键词: 巨桉; EgrCR; 低温胁迫; 基因表达; 基因功能
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2016)03 － 0059 － 09
Expression and Function of EgrCR Gene Responding to
Cold Stress in Eucalyptus grandis
Xu Fenghua Cheng Longjun Wei Xiaoling Dou Jinqing
(The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture Zhejiang A ＆ F University Lin’an 311300)
Abstract: 【Objective】The protein structure，subcellular localization and expression with treatment of abiotic stresses
for EgrCR(Eucgr． B02857)，a cold responsive gene in Eucalyptus grandis，were characterized． And，the phenotype of
Arabidopsis thaliana lines which over-expressed EgrCR were also analyzed to elucidate the roles it played in response to
low temperature and other abiotic stresses in E． grandis． 【Method】The characterization of EgrCR protein，cis-elements
in promoter sequence of the gene and construction of phylogenetic tree of homologous proteins of EgrCR in different plants
were analyzed with Protparam，PSIPRED，TMHMM，MatInspector and MEGA softwares． Subcellular localization of
EgrCR was characterized with the method of introducing EgrCR-GFP fused genes into onion epidermal cells via gene gun
bombardment． Gene expression analysis under treatments of abiotic stresses and circadian rhythm were carried on by semi-
quantitative and quantitative RT-PCR methods respectively． The 35S::EgrCR over-expression vector was constructed and
transformed into Arabidopsis thaliana，and the phenotypes of transgenic plants under different low temperatures (0，4 ℃ )
were analyzed to elucidate the function of EgrCR under the treatment of low temperature． 【Result】The protein encoded by
EgrCR contains 144 amino acids and there were 4 α helixes and 3 β sheets． No domain and trans-membrane region were
found in the protein． The phylogenetic tree based on homology comparison showed that it was closed to its homologous
protein in Populus trichocarpa，sharing a 68% protein similarity for them． To the promoter sequence of EgrCR，Some cis-
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elements related with plant stresses response were found in it． Nuclear localization for EgrCR merged protein with GFP
implied EgrCR was located in the nucleus． Under normal condition，EgrCR were mainly expressed in stems and leaves，
and qRT-PCR result of EgrCR under 0，2，4，6，8 ℃ and time course (2，6，12，24，48 h) treatments at 4 ℃ revealed
that it was induced strongly by low temperature． In addition，EgrCR expression was not influenced by 100 μmol·L － 1
ABA． However，under the salt stress (200 mmol·L － 1 )，it was inhibited firstly and then induced． Circadian rhythm also
regulates the EgrCR expression，and the transcription level of it was promoted under light and hampered in the darkness．
When Arabidopsis thaliana transgenic lines of EgrCR overexpression were treated at 4 ℃，the accumulation of anthocyanin
was reduced obviously． And，with one week recovery after 3 days treatment at 0 ℃，the transgenic lines can return to grow
quickly，showing cold resistance compared to the wild type．【Conclusion】The EgrCR was involved in responses to cold
and salt stresses in Eucalyptus grandis． Circadian rhythm also had an effect on its expression．
Key words: Eucalyptus grandis; EgrCR; cold stress; gene expression; gene function
低温作为主要的非生物逆境因子严重影响植物
生长发育、经济产量以及地理栽培范围。为了应对
低温逆境伤害，植物在长期进化过程中形成了一系
列低温应答机制。在这些响应过程中，由基因表达
控制的生理代谢和形态调整几乎涉及了植物生长、
发 育 的 各 个 方 面 ( Chinnusamy et al．， 2004;
Krasensky et al．，2012)。
植物对低温胁迫响应在生理代谢层面上，包括
植物激素 ( ABA、生长素、乙烯等 ) 水平的改变
(Rahman，2013; Shi et al．，2014)、膜质组成的变化
以及渗透调节物质(可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱等)
的积累。在分子水平上，ICE1-CBF-CORs 途径是目
前了解较为详细的植物响应低温胁迫的分子路径。
在该途径中，低温导致的 Ca2 +信号变化能够使 ICE1
(1 个 MYC 型 bHLH 转录因子)磷酸化而激活，进而
启动 CBF ( C 重 复 结 合 因 子，C repeat binding
factors) /DREB(干旱响应原件结合因子，dehydration
responsive element binding factors ) 类基因的表达
(Chinnusamy et al．，2003)。CBF 编码的蛋白能够和
下游冷调节基因 CORs( cold regulated genes)启动子
区域的 CRT(C 重复序列，C repeat) /DRE(干旱响应
原件，dehydration responsive element)顺式作用元件
结合，激活它们的转录，参与冷诱导效应的形成(Liu
et al．，1998; Thomashow，1999; Maruyama et al．，
2012)。冷胁迫响应相关的基因中，大约有 12% 属
于 CBF 途径。因此，除了 CBF 途径外，还有被称为
不依赖于 CBF 的分子途径参与了冷胁迫响应
(Fowler et al．，2002)。ABA 依赖的冷信号转导途径
是另一个参与植物冷胁迫响应的分子机制，转录组
分析表明，ABA 响应的基因中约 10%同样对冷胁迫
也有 响 应 ( Kreps et al．， 2002 )。 RD29A，RD22，
COR15A 和 COR47 等 COR 基因启动子上，不仅含有
CRT /DRE 顺式作用元件，也含有脱落酸响应顺式作
用元件(ABRE) (Uno et al．，2000)。ABRE 的结合
蛋白基因 ABI3 在拟南芥( Arabidopsis thaliana)中的
超表达，能够提高植株的抗寒性( Tamminen et al．，
2001)。另外，一类锌指结构蛋白 ( ZFP，zinc finger
proteins)转录因子参与的低温调控途径可能也独立
于 CBF 途径，拟南芥中的 ZAT12 负调控 CBF3，但超
表达 ZAT12 同样可以提高植株的抗寒性; 通过基因
芯片技术对 ZAT12 调节的下游基因进行分析，发现
有 24 个 COR 基因表达发生变化 ( Vogel et al．，
2005)。在巨桉 (Eucalyptus grandis) 中也发现了多
个与低温胁迫响应相关的 ZFP 基因 (Wang et al．，
2014)。
由此可见，植物冷胁迫调控的分子机制非常复
杂。除了上述参与低温响应的基因外，仍有大量其
他基因参与了冷胁迫效应。利用转录组对低温诱导
下植物中基因表达变化的数据进行分析，发现拟南
芥冷胁迫处理 1 周后，表达发生变化的基因有 8 000
多个，其中有相当数量未知功能基因具有明显的冷
胁迫效应(Fowler et al．，2002)。对这些基因功能进
一步的分析，有助于深入揭示植物冷胁迫响应的分
子调控机制。本文在巨桉低温(4 ℃ )不同时间处理
的数字表达谱数据中筛选得到 1 个受低温强烈诱导
的基因，命名为 EgrCR ( cold responsive)，分析了该
基因的特征和低温等不同逆境条件下的表达情况，
并利用异源转化手段，在拟南芥超表达，初步对其响
应低温胁迫的功能进行了分析。
1 材料与方法
1. 1 材料
通过组培无性繁殖的巨桉幼苗种植于浙江省杭
州市临安浙江农林大学的苗圃地。选取生长 3 个
月，健康、长势一致的幼苗作为试验材料。试验处理
在生长箱( Snijders MC1000，荷兰)中进行，正常培
06
第 3 期 徐凤华等: 巨桉低温胁迫响应基因 EgrCR 的表达与功能
养条件为: 日照 16 h，日温 28 ℃，夜温 22 ℃，光强
150 μmol·m － 2 s － 1，相对湿度 70%。试验处理完毕
后收获所需根、茎和叶等组织，迅速放入液态氮中冷
冻进行 RNA 提取。
1. 2 EgrCR 基因、蛋白序列及启动子元件分析
根据数字表达谱中 EgrCR 基因注释编号，即
http: / /www． phytozome． net / search． php 网站上巨桉
基因组数据库的相应基因编号(Eucgr． B02857)，将基
因序列、蛋白序列在该网站下载。其蛋白的氨基酸序
列 在 http: / /www． expasy． ch / tools 网 站 中 利 用
Protparam 软件进行分子量、等电点的分析。其二级
结构利用蛋白质序列二级结构预测分析网站 http: / /
bioinf． cs． ucl． ac． uk / index． php 中的 PSIPRED 软件进
行分析。蛋白质跨膜结构域的预测则利用在线
TMHMM2. 0 软件 ( http: / /www． cbs． dtu． dk / services /
TMHMM /)来进行。
系统进化树的构建则是利用 NCBI ( http: / /
www． ncbi． nlm． nih． gov /)上 blast 软件比对获得的
EgrCR 的同源蛋白序列来进行，对不同植物的
EgrCR 同 源 蛋 白 序 列 进 行 多 序 列 联 配，并 用
MEGA4. 0 软件 ( http: / /www． megasoftware． net /)构
建 1 000 个自举重复的无根邻接树。
以 EgrCR 基因起始密码子 ATG 为起点，截取其
上游 1. 5 kb 序列作为 EgrCR 的启动子序列，利用在
线软件 MatInspector( http: / /www． genomatix． de / cgi-
bin / /matinspector_prof)对序列进行分析。
1. 3 冷胁迫处理
在生长箱中进行，25 ℃生长条件下的幼苗作为
对照(CK)。0，2，4，6，8 ℃作为低温处理温度，每处
理组 3 个重复，巨桉幼苗处理 2 h 后，收获叶片提取
RNA 备用。4 ℃低温下不同处理时间试验中，4 ℃
低温培养箱中，采用先后间隔 0，24，36，42，46 h 依
次放入处理苗的方法，分别作为 48，24，12，6，2 h 的
低温处理组，每组处理 3 个重复。处理完成后统一
提取处理苗的叶片 RNA 备用。
1. 4 盐胁迫、ABA 和昼夜节律处理
盐处理和 ABA 处理试验根据 Kayal 等 (2006)
的方法进行。从巨桉幼苗完整的完全展开的叶片上
剪取直径 1. 5 cm 的叶盘，分别在 100 μmol·L － 1ABA
(DMSO 作为 ABA 溶剂，终浓度为 10%，含有 10%
DMSO 的蒸馏水作为对照)和 200 mmol·L － 1 NaCl 溶
液(以去离子水培养的同一无性系幼苗叶盘作为对
照) 中处理 2，6，12，24 h，处理结束后提取叶片
RNA。昼夜节律试验中，将桉树幼苗放生长箱中培
养，培养条件为: 光照 25 ℃ 12 h，黑暗 22 ℃ 12 h，
相对湿度 80%。以光照开始为起点，分别在 0，4，8，
12，16，20，24 h 时间点收获处理植株叶片，提取
RNA 备用。
1. 5 RNA 的提取、cDNA 合成及基因定量表达
分析
根据王亚红等(2010)的方法提取处理材料的
RNA。组织特异性表达分析以正常生长条件下的苗
龄 3 个月的巨桉根、茎、叶为 RNA 提取材料。RNA
反转录利用 PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa，大
连，中国)试剂盒完成。
定量荧光染料 SYBR-Green ( Takara，大连，中
国)和 BIO-RAD CFX96 实时 PCR 系统 ( Bio-Rad，
USA)用于 EgrCR 基因的定量试验。以 Egr18SrRNA
作为内参基因，试验设 3 个重复。结果用 Bio-Rad
CFX Manager(Version 1. 5. 534)软件进行分析。引
物序列见表 1。
表 1 实时荧光定量、半定量、亚细胞定位及超表达载体构建所用引物序列
Tab． 1 List of primer sequences used in RT-PCR，qRT-PCR，sGFP and 35S vector construction
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
Egr18SrRNA-qRT-F 5 － CGCGCTACACTGATGTATTC － 3
Egr18SrRNA-qRT-R 5 － GTACAAAGGGCAGGGACGTA － 3
EgrCR-qRT-F 5 － GCAAGTTCGTGGTGGAGGC － 3
EgrCR-qRT-R 5 － TGGGACACACACAAGACGC － 3
EgrCR-sGFP-F 5 － ggatccGGATCCAAAATGGAGATGGTTCGCC － 3
EgrCR-sGFP-R 5 － tctagaTCTAGAAGCCGCCAGTTTCTTATAG － 3
EgrCR-35S-F 5 － cccgggCAAAATGGAGATGGTTCGCC － 3
EgrCR-35S-R 5 － tctagaCCGAACGACGAAAGTATCACG － 3
16
林 业 科 学 52 卷
1. 6 EgrCR 蛋白表达的亚细胞定位
设计引物(表 1)，克隆用于 EgrCR::sGFP 载体
构建的基因片段克隆，将 PCR 克隆得到的带有
BamHⅠ和 XbaⅠ酶切位点的 EgrCR 基因开放阅读
框序列，插入到 pCAMBIA1300 载体为基础载体的
35S-sGFP 载体中。转化入大肠杆菌 ( Escherichia
coli)DH5α 中，挑取阳性克隆，测序验证，提取质粒。
通过 PDS-1000 /He 型基因枪法(Xu et al．，1998)转
化洋葱(Allium cepa)表皮细胞进行亚细胞定位。定
位结果用激光共聚焦扫描显微镜观察，成像。
1. 7 EgrCR 超表达载体构建、拟南芥转化与转基
因株系的低温处理
设计引物克隆 EgrCR 带有 SmaⅠ和 XbaⅠ 酶
切位点的全长基因序列(表 1)，插入带有 35S 启动
子序列的 pCAMBIA1301 载体上，构建 35S::EgrCR
超表达载体。电击转化农杆菌 ( Agrobacterium )
EHA101。挑取阳性克隆测序验证后，进行扩大培
养，菌液浓度摇至 OD600为 1. 0 时，加 0. 02% Silwet。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)选取盛花期植株，采用
沾花法侵染。收获侵染植株种子后，用20 mg·L － 1潮
霉素(hygromycin)进行筛选，阳性植株继续繁殖，收
获，筛选，直到获得转基因纯合阳性株系。转基因株
系分别在 4 ℃处理 3 天、6 天后观察其表型变化。
同时，还利用 0 ℃处理转基因株系 3 天后再恢复 1
周，观察转基因株系生长情况。
2 结果与分析
2. 1 EgrCR 基因及蛋白序列分析
利用巨桉 3 个月龄幼苗，对低温(4 ℃ )不同时
间(2，6，12，24，48 h)处理条件下的表达谱数据进行
分析，发现 1 个基因编号为 Eucgr． B02857 的基因表
达水平在不同处理时间下相对于对照均有明显上
调，将 其 命 名 为 EgrCR。 根 据 http: / /www．
phytozome． net / search． php 网站上下载的该基因序
列数据并进行 PCR 验证，结果表明该基因转录本长
度为 634 bp，开放阅读框长 435 bp，没有内含子，编
码 1 个包含 144 个氨基酸残基的蛋白。Protparam
软件预测其分子量为 16. 34 kDa，等电点为 10. 82。
从目前已有的注释信息来看，该基因没有明确的功
能域，为功能未知基因。 PSIPRED 分析系统对
EgrCR 蛋白二级结构进行预测，发现该基因编码蛋
白序列包含 4 个 α 螺旋、3 个 β 折叠片结构，其他为
无规则卷曲(图 1)。TMHMM 软件预测 EgrCR 蛋白
序列也没有明显跨膜区域，序列中所有氨基酸序列
位点的跨膜几率均小于 0. 2(图 2)。
图 1 EgrCR 蛋白二级结构预测
Fig． 1 The secondary structure prediction of EgrCR protein sequence
图 2 EgrCR 蛋白序列跨膜区分析
Fig． 2 Transmembrane region analysis of EgrCR protein sequence
Blast 分析表明该基因编码蛋白的同源序列在
植物中广泛存在，对 12 种植物的同源蛋白序列进行
进化树构建发现 EgrCR 与与木本植物中的同源蛋
白序列相似程度较高，其中与毛果杨 ( Populus
trichocarpa)中的氨基酸序列相似程度最高，达到了
68% ; 而与草本植物拟南芥和水稻(Oryza sativa)中
的同源蛋白氨基酸序列相似程度都比较低，分别只
有 40%和 41% (图 3)。
2. 2 EgrCR 启动子顺式作用元件分析
EgrCR 基因启动子序列中含有与植物非生物逆
境胁迫密切相关的顺式作用元件，其中包括 1 个乙
烯响应元件(EREF)、1 个干旱应答元件(DREB)、9
个 MYB 转录因子结合序列位点(MBS)、4 个热击蛋
白结合的顺式作用元件(HSE)、8 个 WRKY 转录因
子结合元件(W-BOX)，此外，还有 7 个昼夜节律应
答元件(CCA)(表 2)。
26
第 3 期 徐凤华等: 巨桉低温胁迫响应基因 EgrCR 的表达与功能
图 3 植物 EgrCR 同源蛋白的系统发育树
Fig． 3 Phylogenetic tree of homologous proteins of EgrCR in different plants
表 2 EgrCR 基因启动子上的顺式作用元件
Tab． 2 List of cis-element in the promoter of EgrCR
可能元件
Putative element
位置
Position
序列
Sequence(5—3)
数量
Number
EREF － 1241— － 1259 aACGAgcttttccaagttg 1
DREB － 785— － 805 tatttgaaCCGActcaatctc 1
MBS － 41— － 57 acgataccGTTGcaggg 9
－ 375— － 391 cacagtTTGTtgactgt
－ 441— － 457 tagctacaGTTAgcctc
－ 510— － 526 caaaaaggGTTAtgcag
－ 832— － 848 tttcaggaGTTAtctgc
－ 1235— － 1251 aaaagcTCGTtataaat
－ 1248— － 1264 ttttccaAGTTgccggt
－ 1361— － 1377 gaaagcTTGTtatacat
－ 354— － 370 gtacgcCGGTtgaatcc
HSE － 335— － 351 gtgaatTTTCctaaggt 4
－ 467— － 483 ctcaatTTTCtgcaaat
－ 640— － 656 atggagcgtcgAGAAtg
－ 831— － 847 cagataactccTGAAaa
W-Box － 214— － 230 cacagTTGAccatattc 8
－ 379— － 395 gtttgTTGActgtacta
－ 566— － 582 gaagaTTGAcaaaaaaa
－ 620— － 636 ctaatTTGActttatgg
－ 955— － 971 catctTTGAcgaaaatg
－ 1007— － 1023 tttcaTTGActaattaa
－ 1256— － 1272 tgtttTTGAccggcaac
－ 1275— － 1291 caatgTTGAccaacgcg
CCA － 6— － 20 aggagaacAATCtca 7
－ 659— － 673 aaaagaaaAATAtca
－ 661— － 675 aagaaaAATAtcagc
－ 719— － 733 tagaaaAATAtcagc
－ 796— － 810 ggttcaAATAtctcg
－ 962— － 976 gacgaaAATGtctag
－ 977— － 991 gataatAATAtatgt
2. 3 EgrCR 蛋白表达的亚细胞定位
为了进一步了解 EgrCR 基因在细胞中所发挥
的功能，确定其蛋白表达的可能部位，构建了
EgrCR::GFP 表达载体，利用基因枪轰击洋葱表皮
的方法对 EgrCR 表达蛋白的亚细胞定位特性进行
了研究。结果表明，在洋葱细胞中 EgrCR 蛋白定位
在细胞核(图 4)，暗示其作用的发挥可能主要在细
胞核中进行。
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林 业 科 学 52 卷
图 4 EgrCR 的亚细胞定位
Fig． 4 Subcellular localization of EgrCR
2. 4 EgrCR 组织特异性表达分析
对正常生长条件下，巨桉幼苗根、茎和叶不同的
器官进行半定量 RT-PCR 分析，结果表明，巨桉正常
生长状态下，EgrCR 基因主要在茎和叶中表达，根组
织中的表达量很低(图 5)。
图 6 不同低温( a)和 4 ℃不同时间(b)处理下 EgrCR 的相对表达差异
Fig． 6 Relative expression of EgrCR under different low temperatures ( a) and time course treatment at 4 ℃ ( b)
图 5 巨桉 EgrCR 基因在根、茎、叶中的表达
Fig． 5 Analysis of EgrCR gene expression in root，
stem and leaf in E． grandis
2. 5 不同逆境条件及昼夜节律下 EgrCR表达分析
qRT-PCR 结果分析表明 EgrCR 基因在不同低
温(0，2，4，6，8 ℃ )下都被诱导表达。在温度为 2 ℃
时诱导表达量达到最高，相对表达量水平是对照的
235 倍(图 6a)。4 ℃不同处理时间 EgrCR 也均被诱
导。在处理 2 h 后 EgrCR 表达量即为对照(25 ℃ )
处理的 10. 5 倍，随着时间的延长，其表达水平相对
于对照继续提高，处理 48 h 时，EgrCR 相对于对照
的表达倍数已达到 113. 4 倍(图 6b)。说明低温处
理对该基因的诱导非常强烈。
EgrCR 在 200 mmol·L － 1盐胁迫处理下(图 7a)，
相对于未处理样品，基因表达先是受到抑制，处理
2 h时，基因表达仅为对照的 1 /6 左右，但随着处理
时间的延长，这种抑制作用逐渐减弱; 24 h 后，
EgrCR 相 对 于 对 照 表 现 出 表 达 上 调 现 象。在
100 μmol·L － 1 ABA(图 7b)处理下，该基因的表达与
对照相比，变化不明显。
目前发现很多与逆境胁迫相关的基因表达都受
到昼夜节律和光照的影响(Shi et al．，2014)。EgrCR
的表达同样受光照诱导，受黑暗条件的抑制，光照
8 h时达到最高诱导水平，随后有所下降。而随黑暗
处理时间的延长，该基因受抑制的作用也不断加强
(图 8)。
46
第 3 期 徐凤华等: 巨桉低温胁迫响应基因 EgrCR 的表达与功能
图 7 盐胁迫( a)和 ABA 处理(b)下 EgrCR 的相对表达差异
Fig． 7 Relative expression of EgrCR under salt stress ( a) and ABA treatment ( b)
2. 6 利用异源转化对 EgrCR 低温响应的功能分析
异源转化获得 2 个 EgrCR 超表达的拟南芥纯
合株系 EgrCR-OE1 和 EgrCR-OE2，在 4 ℃处理条件
下，随时间的延长，EgrCR-OE1 和 EgrCR-OE2 的植
株虽然也有花青素苷积累现象，但相对于野生型明
显减弱(图 9)。而在 0 ℃处理 3 天、25 ℃恢复 1 周
后，野生型植株大部分死亡，EgrCR-OE1 和 EgrCR-
OE2 两个株系却开始恢复生长 (图 10 )。表明
EgrCR 基因在植物抗寒性功能发挥上具有一定
作用。
图 8 在昼夜节律下 EgrCR 的相对表达差异
Fig． 8 Relative expression of EgrCR under circadian rhythm
图 9 4 ℃处理条件下拟南芥超表达 EgrCR 转基因株系的表型
Fig． 9 Phenotype of Arabidopsis thaliana transgenic lines of over-expression of EgrCR under 4 ℃ treatment
图 10 0 ℃处理 3 天恢复 1 周后拟南芥超表达
EgrCR 转基因株系的表型
Fig． 10 Phenotype of Arabidopsis thaliana transgenic lines of over-expression
of EgrCR after 1 week recovery from treatment at 0 ℃ for 3 days
3 讨论
参与植物逆境响应的基因数目非常庞大，其中
大多数尚未进行详细研究(Fowler et al．，2002)。本
实验室前期于 4 ℃不同时间处理的数字表达谱测序
试验中发现了数量众多的低温响应基因，其中有相
当一部分没有明确的功能注释，EgrCR 基因就是其
中 1 个，其随低温处理时间的延长，表达水平不断提
高。其编码蛋白序列中没有发现已知的功能域和跨
膜结构域。EgrCR 蛋白同源序列在不同植物中广泛
存在，但并没有其相关功能的研究报道，表明其属于
一个尚未得到详细认知的可能参与植物低温胁迫响
应的基因。亚细胞定位结果表明其主要在核中表
56
林 业 科 学 52 卷
达，但它是作为转录因子参与相关基因的转录调控，
还是在核内发挥其他作用，仍需做进一步研究加以
证实。EgrCR 基因不同组织表达特异性分析表明，
正常条件下，基因主要在茎和叶中表达，在根中表达
量很低，暗示其功能的发挥可能主要在茎和叶器官
中进行。
EgrCR 基因启动子区域含有的顺式作用元件大
多与逆境胁迫响应有关，如 DREB 元件被认为是
CBF 等低温和干旱胁迫相关转录因子结合序列
(Baker et al．，1994); MBS 和 W-BOX 元件则分别为
MYB 转录因子和 WRKY 转录因子结合的序列。相
当多的 MYB 类转录因子参与了植物的生物和非生
物逆境调控过程(Ambawat et al．，2013); 而 WRKY
在植物抗病、非生物逆境响应、衰老及激素控制等过
程中同样发挥重要作用 ( Bakshi et al．，2014 )。此
外，EgrCR 启动子中的乙烯响应元件(EREF)和昼
夜节律应答元件(CCA)的存在，暗示该基因功能的
发挥可能受多种因素的影响。
无论在不同低温处理条件下，还是在低温
(4 ℃ )不同处理时间下，EgrCR 都有非常明显的低
温诱导效应，进一步证明该基因功能可能与低温胁
迫响应的关系非常密切。与 4，6，8 ℃低温处理相
比，2 ℃低温对 EgrCR 的诱导作用最强，表明该基因
对不同低温的响应敏感性不同。0 ℃条件下，诱导
作用相对较弱，这可能是因为冷冻温度下，植株细胞
中的代谢作用被削弱，导致分子响应的迟钝。低温
在拟南芥中会导致花青素的积累，使叶色呈现为紫
红色(Leyva et al．，1995)。EgrCR 基因在拟南芥中
超表达，转基因株系在低温处理下与对照相比，花青
素苷积累现象明显减弱; 同时，0 ℃处理再恢复的
试验中，转基因株系的死亡率与对照相比也大幅度
降低，恢复生长能力也比较强，表明其对低温造成的
影响具有一定的抵抗能力。EgrCR 低温处理条件下
的表达和异源转化试验都表明了该基因可能在巨桉
低温响应过程中发挥着重要作用。
参与不同逆境胁迫响应的基因之间存在复杂的
互作关系(Huang et al．，2012)。某些基因还参与了
多种非生物逆境胁迫的响应。如拟南芥中的
COR15a，RD29A 既能被低温诱导，也能被干旱、高盐
等脱水逆境条件诱导(Xiong et al．，2002)。超表达
AtCBF1 能提高转基因拟南芥植株对低温的抗性，而
其在欧 洲 油 菜 ( Brassica napus )、番茄 ( Solanum
lycopersicum)中的表达还能提高转基因植株的抗旱
性和耐盐性( Jaglo et al．，2001; Hsieh et al．，2002)。
陆地棉(Gossypium hirsutum)中的 GhDREB1L 除了受
低温诱导外，还在干旱和高盐条件下上调表达
(Huang et al．，2007)。本研究中，定量 RT-PCR 结果
表明，EgrCR 基因在高盐处理时表现出先抑制后诱
导的现象，表明该基因对盐胁迫也有一定响应。植
物激素 ABA 含量水平在低温处理下会明显上升
(Chen et al．，1983)，低温响应的基因按照其与 ABA
的关系还可以分为 ABA 依赖性的和 ABA 非依赖性
的 2 种 ( Xiong et al．，2002 )。但从 ABA 处理下
EgrCR 的表达情况来看，该基因表达并不受 ABA 处
理的影响，其作用的发挥可能是独立于 ABA 调控途
径的。
另外，低温胁迫响应基因还受昼夜节律影响，参
与昼夜节律调控的 2 个关键因子 CCA1 和 LHY 对
CBF 类基因都有正调控效应(Dong et al．，2011); 拟
南芥 CBF1 － 3 在低温条件下的表达变化除了与低
温时间长短有关外，昼夜节律在其中发挥重要作用
( Fowler et al．， 2005 ); 马 铃 薯 ( Solanum
sogarandinum)中的 SsBBX24 基因表达也有明显的
昼夜节律，同时该节律还会受低温等逆境影响
(Kielbowicz-Matuk et al．，2014)。EgrCR 的表达在
24 h 内同样受光照的诱导、黑暗的抑制，在光照条
件下表达量表现出先上升后下降的趋势，体现出昼
夜节律在该基因表达调控中发挥了重要作用，暗示
昼夜节律可能也对该基因功能的发挥产生影响。其
启动子序列上 CCA 昼夜节律相关顺式作用元件的
存在，也在一定程度上证明了这一点。
4 结论
巨桉 EgrCR 基因在不同非生物逆境胁迫下的
表达变化说明其参与了巨桉低温胁迫响应，同时它
在巨桉高盐胁迫响应中也发挥一定的作用，昼夜节
律对其表达也有影响。该基因的异源转化植株在低
温下的表现进一步证明了该基因可能在植物的低温
胁迫中发挥一定的功能。
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(责任编辑 徐 红)
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