全 文 ：第 5 卷 第 2 期
1 9 9 2 年 4 月
林 业 科 学研 究 V o l
FO R E S T R E S EA R C H A p r
。 ,
,
N o
。
2
1 9 9 2
马尾松共生真菌(P . t) 增殖培养条件 *
装致达 陈连庆
(中国林业科学研究院亚热带林业研究所)
关盆词 马尾松 , 彩色豆马勃 , 培养条件
马尾松(Pi 。: : m as son ian a L a m b . )是我国亚热带地区主要用材树种之一 , 具有分布面积
广 、 生长快、 经济效益高等优点。 它又是典型的外生菌根树种 , 抗逆性强 , 适应性广 , 是我
国荒山绿化的先锋树种。 研究表明 , 马尾松苗木菌根感染率不同 , 对其造林成活率有着明显
的不同 , 且菌根化苗木造林后缓苗期短 , 生长快 , 株高、 茎粗 、 新梢高度均大大超过无菌根
化苗木[ 11 。 因此 , 马尾松苗木菌根化是十分必要的。
用高效益的优良菌种对马尾松苗期进行人工接种 , 是培育菌根化壮苗的重要措施 。 在对
马尾松菌根真菌调查研究和优良菌株筛选的基 础 上￡‘一2 卫, 选择 了彩 色豆 马 勃 〔尸矛: ol ith as
红nc to ri 。 : (Per s) 伪 ke r & Co uc h〕液体培 养菌丝体作为接种剂得到了较好的效果 , 马尾
松苗木菌根感染率达75 . 7 % 。 为了扩大培 养马尾松菌根菌(P 。t) , 对其增殖技术条件进行了
研究 , 目的是确定最佳方案 , 为生产马尾松菌根菌剂提供依据 。
1 材料和方法
1
。
1 菌株
彩色豆马勃 尸。 tfn e oo : i: : (简称 P 。t )是从马尾松林内采集 、 分离的(亚林)5 6 9 0 2菌株。
1
.
2 培养甚
改良的菌根菌合成培养基tsl 。
1. 3 接种培养
取 P 。t 菌菌丝接种于盛有 10 m l培养液的250 m l三角瓶中 , 在H S各 1型弧型往返生物 液
体培养振荡台上振荡培养 , 接种量为3 . 2 m g (干) / 1 0 0 m l菌丝 , 每个处理重复 3 次 , 培养周
期为30 天 。
1
。
3
.
1 温度试验 分别在15 , 20 , 25 , 30 , 35 , 40 ℃共 6 个梯度条件下恒温培养。
1
.
3
.
2 p H 值试验 在 p H 值为2 。5~ 8 。o范围 内, 间隔。. 5为一梯级共设12 个梯度处理 , 灭菌
后备用。
1
.
3
.
3 碳源试验 在 p H 值为5 . 6 、 温度为20 一 25 ℃条件下 , 以单搪类葡萄糖 、 果糖 , 双 糖
类麦芽糖 、 蔗糖 , 多糖类可溶性淀粉 、 糊精为碳源 , 加上对照共设 7 个处理 。
本文于 1 9 9 1年 1 月1 2 日收到。
* 本研究系 ‘七五 , 国家科技攻关项 目. 菌根在林业上应用—马尾松菌根研究”内容的一部分 。
23 2 林 业 科 学 研 究 5 卷
1
.
3
.
4 氮源试验 用无机态氮 : (N H ‘): 5 0 ‘ 、K N O 3 、 C a (N 0 3 )卜 N H 一N o a和有机态氮 : 酒
石酸钱 、 尿素 、 蛋白膝及酵母浸汁为 N 源 , 共设 8 个处理 , 在 p H 值 5 . 6 、 温度20 ~ 25 ℃条
件下振荡培养。
1
.
4 苗丝体生物最洲定
分别取试验后的培养液经抽提、 过滤 、 清洗 , 105 ℃烘干至恒重 , 计算每百毫升培 养 液
中菌丝干物质重量 。
1
.
5 培养液 p H 位刹定
取25 m l墙养液 , 用S PM 一10 型数字式 p H 计测定 。
2 结果与讨论
2
。
1 沮度与 P . t 菌菌丝体增殖
在25 ℃与 30 ℃条件下 , 菌丝体 2 ~ 3 天便开始萌动 , 增殖速度快 , 菌丝浓密 , 菌 落 正
常。 2 5 ℃时菌丝体日平均增长量为l 。2 m m , 随着温度的降低或升高 , 菌丝体萌动时间推迟。
在温度降低或升高 10 ℃ (15 ℃ 、 35 ℃ )条件下 , 菌丝体日增长量是25 ℃时菌丝增长量的十分
之一。 温度在 10 ℃ 时 , 从接种到菌丝萌动需18 天 , 且生长缓慢 , 菌丝长势稀 、 弱 , 温度在40 ℃
时 , 菌丝体根本不萌动(表 1 )。
裹 1 不同沮度下 P. t , 生长愉况
堵养溢度
(℃ )
萌动始时
(d )
苗落直径
墓 内颜色 菌丝颜 色
菌丝 增长皿
(m m / d )
气 生 菌 丝 形 态
(e m )
U2八nUS月JO口Oq自.⋯,勺山dZ嘴l
黄
棕
棕褐揭金杳1 8
9 ~ 1 1
6 ~ 7
3 ~ 4
2 ~ 3
浅 褐 色
祖 黄 色
暗福黄 色
揭 黄 色
黄 褐 色
黄 揭 色
1 1 9 2
0
.
03 5
心. 12 5
0
.
26
1
.
2
0
.
3 75
0
.
1 25
菌丝长势稀朋 、 t 少
菌丝较密 、 绒状爬 壁差
菌丝浓密 、 盛齐萦状爬璧
菌丝浓密 、 絮状或甸甸爬璧
菌丝浓密 、 报状整齐爬壁
菌丝 浓密 、 短绒状整齐
0尸舀八U匕n甘一,土,叮自人口内JC
4 0 一 一 一 一 一 一
. . . . . . . . . . . . . 州. . 曰. . . . . . . . . . . . 口 . .一- 一一- 一- 一- 一一.一一- 一- 一一- - 一- .-一. . . . . . . . 口 . 门. . . . . . . . . . . . 目 . . . . 口 . . . . . . . 口 . 曰 . . . . . . . . . . . . . . . . . 口 . . .2 。 2 pH 值与 P 。 t 菌菌丝休增殖
p H 值 是影响菌丝体新陈代谢的重要因素 , 在 p H 2 . 5 ~ 8 的范围内 P . t 菌 均能生长 , 但菌
丝球的大小 、 形态及菌丝体生物量各有不同 。 p H 值4 . 0一 5 . 5适合 P . t菌 菌 丝 体的增 殖 , 每
1 0 m l培养液中菌丝增殖量为65 . 2~ 7 7 。 1 m g (干重 ) , 增殖倍数为20 . 37 ~ 24 . 09 倍 , 其最佳
p H 值为5 . 5( 表 2 ) 。 我们还发现在p H 值2 . 5 ~ 5 . 5范围内 , P . t 菌 菌丝体增殖量随着 p H值的
增大而增加 , 呈极显著正相关 , , = 0 . 9 5 2 4 ( r 。. 。。 = 0 。7 5 4 , : 。, 。: “ 0 . 8 7 4 ) , PH 值 ( x ) 与菌丝体
干重 (妇的回归关系为 习 = 一 7 . 3 16 6 + 16 . 5 0 8 幻 而在 p H 值6 . 0~ 8 . 0范围内 , 菌丝体增殖量
是随p H 值的增加而减少 , 呈极显著负相关 , : = 一 0 . 9 9 5 7 ( , 。 . 。。 = 0 . 8 7 5 , : 。 . 。、 = 0 . 9 5 9 ) , 理论
回归方程为 夕二 2 0 2 . 8 5 一 2 3 一 9 1 8 劣。
还要提及的是 p H 值4 。 5以下的培养液经高压灭菌后 p H 值略有增大 , p H 值 5 。 O以上 的培
养液经高压灭菌后p H 略减小 , p H 值大于7 . 0的培养液经高压灭菌均产生沉淀物 , 液体颜色呈
2 期 裴致达等 : 马尾松共生真菌 (P . t) 增殖培养条件 2 3 3
铁锈色 , 这是由于在碱性高温条件下 , 培养液中一些物质发生化学反应所致 , P . t 菌菌丝 截-
生长较差。
表 2 各 p H 值液培养 P . t 菌菌丝体增殖情况
培葬液 pH 值 培 养 液 颜 色 菌 丝 球 形 态
灭菌前 灭菌后 培养前 培养后 颜 色 直 径(e m )
培养后 菌丝休
培养液 干 重 增殖倍数
PH 值 (m g )
月才J,门才了n.UO拓曰七8bJ‘06OU月,升舀曰人n甘八月山甩1尸.⋯月才内舀r八1比性月吕.几UO4.上j月山丹‘,曰,止土2目舀O材2,占1lq咋自U尸勺.⋯月ql毖n‘组97062J, ,gJ一已拓ht子仲丹了才:吮氏舀n曰工月了,上九舀火几七翻O户口5.0J枯OU250口
们‘上月,曰78,自行白nJ几口舟口
怡月‘性J尸J
6
犯匕介b
2
。
5 6
3
。
0 5
3
.
5 5
4
.
0 4
峨。 5 2
4
.
9 6
5
.
4 5
5
.
9 8
‘。 3 8
6
.
5 3
6
.
8 7
无色透明 无色透明
无色透明 白黄透 明
无色透明 土黄透明
无色透明 浅福 黄透明
无色透明 揭黄透明
无色透 明 黄福透明
无色透明 黄揭透明
无色透明 黄祖透明
浅黄透 明 黄福透明
浅锈黄有沉淀 上黄透明
黄锈 色有沉淀 浅土黄透明
铁锈 色有沉淀 黄色透明
黄棕揭
黄棕褐
黄棕褐
黄棕褐
0
.
2 ~ 1
.
5
0
.
5 ~ 2
0
.
5 ~ 2
1 ~ 3
1 ~ 3
1 ~ 3
1 ~ 3
1 ~ 3
1 ~ 2
0
.
5 ~ 1
0
.
5 ~ 1
0
.
5 ~ 1
绒球少长绒
绒球细长绒
长毛绒球
长毛绒球
长毛绒球
大长绒球
大长 绒球
绒球片状
线球片状
短 蜜绒球
短密绒球
短密绒球
黄褐金褐黄
黄色白
50SQO1的47盯236口44556677
在菌丝体增殖过程中由于新陈代谢所产生的有机酸 (醋酸 、 唬拍酸、 草酸等) 的积累 , 也
会使培养液p H 值降低 t4] , 但初始p H 值与培养后培养液的 p H 值之间是极显著的正相关关系 ,
, = 0
.
9 7 0 1 ( ,
。 . 。5 = 0 . 5 7 6 , : 。
. 。: = 0 . 7 0 6 )
, 理论回归方程为夕 = 0 . 1 8 4 2 + 0 . 8 18 g x 。 我们在文
中所采用的 p H 值是指培养液灭菌前的初始 p H 值 。
2
.
3 碳源与 P . t 菌菌丝体增殖
碳源是菌丝体最重要的营养来源 , 它不仅能提供碳素以作为合成碳水化合物和氨基酸的
原料 , 而且也是重要的能量来源。 在基础培养液中分别加入葡萄糖 、 果糖 、 麦芽糖 、 蔗糖、
可溶性淀粉、 糊精等作碳源 , 其菌丝球的形态、 大小各异。 菌丝生物量 (除果糖外 )均比对照
增加 , 以葡萄糖作碳源 , 菌丝球多 , 且大, 形态正常 , 每 10 m l培养液菌丝干重达62 . 7 m g,
增殖 1 9 . 6倍 , 是对照的 16 倍 , 效果最好 。 双糖中以麦芽糖作碳源为好 , 仅次于葡萄糖( 表 3 ) 。
本试验中 P . t菌菌丝体对各种碳源利用情况排序是 : 葡萄糖> 麦芽搪> 糊 精> 可溶性淀粉>
CK > 果糖 。 可溶性淀粉作为大分子化合物不能直接被 P 。 t 菌菌丝吸收利用 , 需经淀 粉酶 分
解 , 因而效果较差 , 而 P 。 t 菌对果搪所提供的碳源反应最差 , 其机理有待进一步探讨 。
表 3 不同碳滚培养液对p 。 t菌增殖生长的影晌
营 养 液 颜 色 菌 球 形 态 菌丝千重
碳想种类
接种前 堵养后 饭色 直 径( e m ) (m g ) 增殖倍致
24劝
有 萄 箱
果 精
麦 芽 糖
蔗 精
可溶性淀粉
溯 精
CK
无色透明
褐棕色透明
无色透明
无色透明
微乳白色
无色透 明
无色进明
祖色透明
黄色透 明
黄棕色透明
黄棕色透明
白黄色 乳状
黄棕色稍乳
无色透明
黄揭色
土黄色
黄棕色
黄棕色
土黄色
土黄色
土黄色
1 ~ 2
0
.
5 ~ 1
0
.
5 ~ 1
.
5
0
.
5 ~ 1
.
5
0
.
5 ~ 1
0
.
5 ~ 1
.
5
0
.
5 ~ 1
.
5
长毛绒球状
不规则片状
近似球形 , 二菌丝长短不齐
绒球片状
片状 , 菌丝细弱
绒球 、 片状不规则
片 状
6 2 7
2
.
3
4
。
7
1 6
.
4
4
.
4
19
。
6
0
。
7 2
7
.
7
4
.
1
1
.
5
5
.
1
1
。
4
2 3 4
2
。
4
林 业 科 学 研 究 5 卷
氮源与 P . t 菌菌丝体增殖
氮素是菌丝体合成蛋 白质和核酸的重要营养物质 , P 。 t 菌能利用的氮源很 多 , 在其生长
过程中 , 无机态氮源最易被吸收利用 , 菌丝体增加量大 , 其中以氨态氮 为 最 好 , 1 0 m l培
养液菌丝体干重达5 1 . 6 m g , 增殖2 3 . 4 5倍 ; 硝态氮次之 。 P . t 菌对有机态氮分解利用能力较
差 , 以尿素、 蛋 白陈为氮源的培养基 , P . t 菌菌丝生长差 , 菌丝球小 , 菌丝 短 , 说明所提供
的这些氮源难以利用 , 尤其是酵母浸 汁提供的氮源 , P . t菌几乎不能利用 , 其 菌丝体不萌动
(表 4 ) 。
二表 4 P . t 菌液培氮派选排试验结果
背 养 液 颜 色 菌 球 形 态 菌 丝 干 爪
氮源种类 接种前 培 养 后 直 径
(c m )
形 状 (m g ) 增殖倍 数
(N H ; ) : 5 0 ;
K N 0 3
C a (N O s ):
N H 一N O :
酒石酸筱
尿 素
蛋 白 陈
醉母浸汁
无色透明
无色透明
无色透明
无色透明
无色透明
无色透明
褐黄透明
黄色乳状
棕揭透 明
暗棕褐透明
浅褐棕透 明
黄棕透 明
棕褐透 明
产生 白色沉淀
褐黄透 明
棕褐色
棕褐色
褐棕色
黄棕色
棕褐色
自 色
褐黄色
1
le Z
1 ~ 2
1
0
.
5 ~ 1
0
.
5
0
.
5
丝 片 状
绒 球 状
绒 球 状
绒 球 状
毛绒球状
不规则片状
不规则片状
5 1
.
6
3 5
.
5
3 4
.
5
2 3 45
1 6
.
1 4
3 9
3 7
3
{:
3
.
1 1
.
40
一 菌丝不起动至污
3 小 结
通过对马尾松菌根菌—P . t 菌液体培养的温度 、p H 值 、碳源 , 氮源等试验 得 知 : P . t菌菌丝体在 10 ~ 35 ℃时均能生长 , 适宜的温度是20 ~ 30 ℃ , 25 ℃是其生长最佳温度 。 P . t菌菌丝
喜酸性环境 , 且适应范围较宽 , 最适 p H 值为 5 . 5 。 培养用的碳源以葡萄糖最好 , 果糖最差 。
在对氮源的利用上 , 是无机态氮优于有机态氮 ; 无机态氮中 , 按态氮优于硝态氮 , 以硫酸铁
效果最好 。
在进行以上内容研究的同时 , 还进一步对碳氮比、 矿质元素、 维生素等组合配比进行了
筛选试验 , 已确定了马尾松菌根菌—P . t菌增殖的最佳培养基 、培养条件及菌剂生产工艺 ,以 七内容将于另文报道。
参 考 文 献
〔1 〕陈连庆等 , 1 9 90 , 马尾 松菌根真菌的筛选及目地接种效应 , 林业科学研 究, 5 (1 ) : “ ~ 7。。
〔2 〕 陈连庆 , 1 9 8 9 , 马尾松共生留根真苗调查研究 , 林业科学研究 , 2 ( 4 ) : 3 5 7 ~ 36 2 。
〔3 〕俞大级 , 19 7 5 , 植物病理学和真菌学技术汇编 , 人民教育 出版社 , 7 40
〔4 〕杨庆尧 , 19 81 , 食用茵生物学墓 础, 上海科学技术出版社 。
2 期 裴致达等 : 马尾松共生真菌(P . t) 增殖培养条件 2 35
T he C u ltu r a l C o n d itfo n s j
o r the P r o lij
e r a tio n
o f a s夕阴bfo tic F 。。g u s (P . t) 。fth M a ss o n P in e
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Che n L ia n q in g
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u 乙t r o 尹fc a l F o r e : 才r 夕 C A F )
A bs仕a et T he e u lt u r a l e o n d it io n s fo r th e Pr o life r a tio n o f a s tr a in , SF -
8 6 9 02 se le e te d fro m P艺so lit儿a s 才i”c to l f衣s (P . t ) , a sPe e ie s o f sym b io t ie fu n g i w it h
M a ss o n Pit e
, 五a v e b e e n s tu d ie d 。 T h e r e s u lts sh o w e d t h a t u n d e r a r t ifie ia l
Pu r e
一
e u ltu r e
, t h e o Pt imu m g
r o w th te m P e r a tu re w a s 2 5 ℃ ; th e o Pt imu m PH
in th e e u ltu r e so lu t io n w a s s
。
5 : the s o u r e e s o f c a r b o n a n d n itr o g e n w h ieh
a r e e a s ily abe o r b e d a n d u s e d , 犷e r e mo
n o sa e g luc o se a n d in o r g a n ie a m m o n
-
iu m t it ro g e n r e sPe e t iv e ly
。
T h e r e se a re h P ro v id e d s e ie n tifie b a s is fo r Pr e P
-
a r in g m yC o r r h iz a in o e u lu m by the P
.
t fu n g u s o f e c to tr o Phie m yC o r r hiz a w it五
M a s so 立 P in e
。
K盯 w o r d s M a ss o n P in e : P is o l玄跳a s ri”o to riu s : e u ltu r a l e o n d it io n
“浙江省林木良种选育技术推广和
繁育体系的建立 ”通过鉴定
由浙江省种苗站牵头 , 组织中国林科院亚林所 、 浙江省林科所 、 浙江省林学院 、 浙江林校和 良种 基地
的科技人员协同攻关 。 坚持以科研为先导 , 基地建设为中心 , 推广为手段 , 实现造林良种化为目标 , 建 立
起一个 良种科研 、 生产 、 管理和推广四大系统为支往的完整的林木良种繁育体系。 十八年来 , 推广 应用27
个树种有关种源选择 、 种子园 、 引种、 无性繁殖技术和基因资源保存 , 利用 46 项科研成果 , 建立28 个 林木
良种基地 17 9 23 亩 , 生产 良种 43 . 9万k g , 优良穗条 1 687 万根 , 亩木3 54 万株 , 在全国 17 个省 (区 ) 、 浙江 省
70 个县(市 )推广 良种造林 , 面积达40 5万亩 , 取得极显著的经济效益和社会效益 。良种选育技术推广和 繁育
体系的建立 , 使科研 、 生产和推广工作的运行机制发生了深刻的变化 , 加快了科研成果转化为生产力的 速
度 , 科研成果应用率达到 95 。 7 % , 促进了良种基地稳产和丰产 , 目前杉木良种基地单产居全国领先水 平 ,
实现了杉木 、 按树、 油茶 、 油桐 、 乌柏和柏木等树种造林良种化 , 提高了其他主要造林树种良种化 水平 ,
加速了全省造林良种化进程 。
经省科委批准 , 1991 年12 月 7~ 8 日, 由浙江省林业厅科教处主持 , 邀请了中国林科院副院长洪菊生研
究员 、 林业部种苗管理总站站长王琪高级工程师 、 北京林业大学沈熙环教授 、 东北林业大学张培呆教授 和
南京林业大学王章荣教授等12 位国内著名的遗传育种和管理专家 , 对项目进行了鉴定。 专家们一致认 为 :
该项目在推广实施过程中技术配套, 组织严密 , 措施得当 , 基地规划布局合理 , 研究 目的明确 , 管理体 系
科学 , 技术档案完备 , 质量把关严格 , 推广效益显著 , 为在一个省开展 良种繁育和推广创出了一条新路 。
(赵娜年)