全 文 ：第 4 卷 第 5 期
1 9 9 1 年10月
林 业 科 学研 究
FO R E S T R E S E A R CH
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4
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5
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1 9 9 1
细毛樟实生苗同工酶的初步研究 ’
曾 英 程必强
(中国科学院昆叨植物研究所)
关 . 词 细毛樟 , 精油 , 同工醉
细毛樟(Ci: 。a m o m u 二 te n : fp ilu m K o 3 te r n )系樟科樟属植物 , 根据精油主成分的不 同 将
细毛樟分为不同的化学型 , 如细毛香樟 (香叶醇 g er a ni ol 为精油主成分) 、 细毛芳樟 (芳樟醇
li na n0 1 为精油主成分 )等。 在引种驯化的过程中发现细毛樟种子苗精油主成分变化相当大 ,
一般解释为遗传分离的结果 。 本文以细毛香樟和细毛芳樟的种子苗为材料 , 研究樟叶在生化
实验中的一些内源干扰问题 , 探讨子代精油变异与同工酶的关系 , 为系统地研究细毛樟精油
的生物合成控制打下基础 。
1 材料与方法
1
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1 材料
采用西双版纳劲咨植物园 , 细毛香樟和细毛芳樟母树自然授粉结实的种子苗 , 经本所温
室栽培 , 取苗龄一年半生细毛香樟种子苗共四株(G : 、 G Z 、 G 3 、 G ‘) , 细毛芳樟种子 苗 共 二
株 (L : 、 L : )作试材 。
1
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2 方法
1
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2
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1 精 油的提取和分析 叶片经水蒸汽蒸馏 、 乙醚萃取得精油 , 成分分析 由本所植 化 室
完成。
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2
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2 电泳样品的制备
(1 ) 提取缓冲液 。. I M磷酸缓冲液 (p H = 6 . 5) 内含 : o , ZM蔗搪 ; 10 m M 偏重亚 硫 酸
钠 , 5 m M 乙二胺四乙酸二钠 ; 5 m M 抗坏血酸 , 3 m M 二硫苏糖醇 , 0 . 5 %牛血清白 蛋白 。
(2 ) 幼芽和叶片处理 洗净吸干后称取。. 5 9 剪碎 , 在液 N 下冷冻研磨成粉 , 加入 预 冷
的提取缓冲液 1 m l, 在 4 ℃下提取 3 0 m in , 冷冻离心 10 m in , 转速 15 0 0 0 rPm , 幼 芽的上清液留
做电泳 , 叶片的上清液需进一步处理 。
(3 ) 样品的酶处理 叶片提取液异常粘稠 , 加入蜗牛酶 (上海产)或纤维素酶 (日本产)使
最终酶浓度为 30 陪 / m l, 室温 21 ℃放置 , 一定时间后样品不再牵丝 , 认为可以用作 电 泳 ,
同时将纤维素酶和蜗牛酶用提取缓冲液配成 3 0 “g / m l的溶液 , 与酶解样品一起电泳 。
(4 ) 组织冻融法制备酶液 叶片洗净吸干后 , 剪成。. 5 c m , 的小方块 , 液 N 冷冻 1 m in,
置于3 7 ℃保温3 m in , 上述两步骤重复 3 次后冷冻离心 (1 5 0 0 0 r pm , 2 5 m in )得淡黄色组织
液 , 对半加入预冷的提取缓冲液 , 直接上样电泳。
本文 于1 9 9 0年 10 月2 5 口收到。
* 本文承周俊教 授给予经费支持 , 季本仁老师具体指导 , 谨 友谢念 。
5 期 曾 英等 : 细毛樟实生苗同工酶的初步研究 571
1
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2
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3 同工酶 电泳 采用垂直板聚丙烯酚胺凝胶 电泳 〔’〕, 4 ℃水循环。 浓缩胶 4 % , 分离胶
6 %
, 脂酶同工酶电泳分离胶浓度为7 纬。 过氧化物酶同工酶用联苯胺一过氧化氢染色法 。
2 结果与讨论
2
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1 子代精油变异
在分析的 6 个单株中, 没有发现能保持亲本精油主成分的种子苗 , 而是以甲基 丁 香 酚
(m e thy l e堪e n o l)或榄香素醋 (e lem ie in )为主 , 其中 G : 和 G : 的精油主成分是甲基丁香酚 ,
L :
、
L
: 、
G 3
、
G
‘的精油主成分是榄香素醋 , 这与我们先前发表的结果是一致的 , 即有 性 繁
殖后代实生树叶油成分发生了很大的变化 , 与亲本的完全不同。 就生物合成的角度看 , 香叶
醇和芳樟醇在植物体内通过异戌二烯代谢途径合成 , 甲基丁香酚和榄香素醋一般认为是由另
一条次生代谢途径即莽草酸途径合成的闭 , 也就是说 , 在亲本和子代 , 这两条次生代谢途径
对精油合成的贡献各有主次 , 其中的调控机制尚不清楚 。 根据无性繁殖的后代都保持了亲本
的化学类型 , 可认为亲代化学型的划分只是表型划分 , 不是遗传型划分 , 子代精油的变异可
能源于有性繁殖过程中性状分离的结果。
2
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2 细毛棒叶片用于醉学研究遇到的内源千扰
在以伸展的幼叶或成年叶片为材料的提取过程中 , 发现提取液异常粘稠 。 事先将材料用
一 20 ℃的丙酮抽提或提取液经硫酸钱沉淀 , 均不能去除样品的粘性。 按 R e d g w el ls l的方法
抽提粘液并用氯仿一正丁醇 (4 : 1 )进一步纯化 , 冰冻干燥后得到白色疏松的样品 , 用蕙酮法 [‘]
和咔哇法 [s] 检测到一定含量的多糖及糖醛酸 , 认为粘性是大分子多糖所致。 由于样品很粘 ,
电泳时无法上样 , 尝试用一定的多糖水解酶处理样品。 经实验发现纤维素酶和蜗牛酶的效果
较好 , 在30 协g’m 1一 ‘的作用浓度下样品经6 ~ 10 h 酶解后不再牵丝 , 能正常电泳 , 而且纤维
素酶和蜗牛酶不干扰过氧化物酶的显色反应(图 l ) , 认为多糖水解酶可以有效地克服细毛樟
的粘性给同工酶 电泳造成的困难。 在其他植物如称猴桃、 芦荟等都发现有植物粘液质 (p la nt
m uc il a g e)
, 粘液质属于具粘性的多糖类 , 与果胶质及海藻胶质都不 同 , 用硫酸钱 、 重金属
盐 、 乙醇 、 丙酮等蛋白质沉淀剂均不能沉淀〔“1。 细毛樟叶片用于生化研究时 , 植物粘液质成
为主要的内源干扰 , 就过氧化物酶同工酶来看 , 用纤维素酶和蜗牛酶处理样品可 以 消 除 干
扰 , 获得满意的电泳效果。
通过组织冻融并高速离心获得的组织液用作过氧化物酶同工酶电泳 , 效果与酶解样品相
同 , 均可得到丰富的酶谱带(图 2 ) , 这将是减少叶片提取物内源干扰的另一条途径 。 冻融处
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图 1 叶片酶解样品的过氧化物酶 同工酶谱
s: 蜗牛酶 , C : 纤维素酶
图 2 叶片冻融离心液的过氧化 物酶 同工酶谱
林 业 科 学 研 究 4 卷
理植物组织 , 使其细胞膜系统破坏 , 含自由酶蛋白的组织液经高速离心收集 , 。. 5 9 样品 可 得
到。. 1~ 0 . 2 m l组织液 。 早在 1 9 7 4年 , R ho d es 等就报道了体内测定浮萍酶活性的方法门 , 即
组织冻融加真空渗透酶反应底物 , 所得酶活性及酶动力学特征与常规无细胞提取物相当。 从
W ild e nt
吕J抽 提细胞间液的实验进一步得到启示 , 经过反复实验认为细毛樟叶片经冻融处理
加上高速离心 , 所得的组织液具有较高的过氧化物酶活性 , 样品有轻微的粘性 , 但不影响上
样和电泳 , 与酶解样品比较 , 除有轻度拖尾外 , 同工酶谱带完全一致(图 2 )。 其它活性酶特
别是与膜结合的酶蛋白能否用类似的方法抽提得到 , 还有待研究。
2
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3 同工醉与精油成分变异
幼芽和叶片过氧化物酶同工酶 谱 带 (图 l
~ 3 )可以看到 , 6 个子代苗无论是 幼芽 还是
叶片的同工酶酶谱都具有很大 的 相 似性 , 如
L :与G : 的 同工酶谱一致 , 其它的细 微差异与
子代的化学类型似乎没有关联 , 同样说明这两
种细毛樟化学型的划分是表型的划分 , 它们原
属遗传性极其相似的同一个种。 至于细毛樟种
子苗精油成分变异的生化基础可能是代谢途径 图 3 幼芽的过氧化 物醉同工酶 谱
上的调节酶 , 如果我们拥有必要的酶反应物及合适的研究体系 , 就有可能研究两条次生代谢
途径在亲本与子代间转化的酶学基础 。
参 考 文 献
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:
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5 期 曾 英等 : 细毛樟实生苗同工酶的初步研究 57 3
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